李冬梅,陳曉萍,李春艷,劉光明

（大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南 大理 671000）

云南松(Pinus yunnanensisFaranch）為松科松屬植物,又名青松、飛松、長(zhǎng)毛松,分布于我國(guó)西南地區(qū),主要分布于云南、西藏東南部、貴州、廣西等地。松塔系松科松屬植物的球果,又名松球、松果[1-2]。云南松松塔中含有萜類、黃酮、多糖、酚酸類、木脂素類等多種化學(xué)成分[3-6],其中多糖研究最為廣泛,云南松松塔多糖由甘露糖(Man）,鼠李糖(Rham）,葡萄糖醛酸(Glc UA）,半乳糖醛酸(Gal UA）,葡萄糖(Glc）,半乳糖(Gal）, 木糖(Xyl）, 阿拉伯糖(Arab）和巖藻糖(Fuc）組成[7]。研究發(fā)現(xiàn)松塔具有良好的抗腫瘤活性,如日本白松松塔水提物可抑制移植于小鼠的腹水瘤及S180(實(shí)體瘤）細(xì)胞生長(zhǎng)和降低小鼠乳汁中鼠乳房腫瘤病毒的含量[8-10]。課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn),云南松松塔提取物對(duì)多種肺癌細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的增殖具有抑制作用[11-12]。本文考察了苯酚-硫酸法中不同顯色條件對(duì)云南松松塔抗腫瘤活性部位多糖含量測(cè)定的影響,從而確定最佳顯色條件,采用最佳顯色條件測(cè)定了云南松松塔抗腫瘤活性部位的多糖含量[13],該方法操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性好,可用于云南松松塔抗腫瘤活性部位多糖含量的測(cè)定。

1 儀器與試劑

TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；FA2004N型分析天平,上海精密科學(xué)儀器有限公司；超聲波清洗器,上海聲源超聲波儀器設(shè)備有限公司；HH-S2s數(shù)顯恒溫水浴鍋；HG-9075A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥機(jī),上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

云南松松塔抗腫瘤活性部位為課題組前期研究中,通過(guò)活性篩選從云南松(Pinus yunnanensisFaranch）松塔中得到的具有抗腫瘤活性的提取部位。葡萄糖對(duì)照品(批號(hào):20151214,分析純）,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；苯酚和濃硫酸均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 5%苯酚溶液的配制

精密量取5 mL重蒸的苯酚于100 mL棕色容量瓶中,加蒸餾水使其溶解,定容,搖勻,避光保存(臨用前配制）。

2.1.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取于105℃干燥至恒重的葡萄糖對(duì)照品0.0200 g于100 mL容量瓶中,加水定容,搖勻,得0.20 mg·mL-1的葡萄糖溶液。精密量取上述葡萄糖溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中,加水定容,搖勻,即得0.02 mg·mL-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.1.3 樣品溶液的配制

精密稱取于105℃干燥至恒重的云南松松塔抗腫瘤活性部位粗粉25.0 mg于25 mL的容量瓶中,加水溶解,定容并搖勻,即得樣品溶液。精密量取樣品溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中,加水溶解,定容,搖勻,即得供試品溶液。

2.2 最大吸收波長(zhǎng)的選擇

精密量取上述葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試品溶液各2.0 mL分別置于2支10 mL具塞試管中,分別加5%苯酚溶液1.0 mL,濃硫酸5.0 mL,加水定容,搖勻,室溫放置10 min,置沸水浴中加熱10 min,立即取出置冷水浴中冷卻至室溫,以2.0 mL的蒸餾水以同樣方法作空白對(duì)照[13],TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)400～600 nm范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描,確定最大吸收波長(zhǎng)為491 nm。

2.3 最佳顯色條件的選擇

2.3.1 水浴溫度的選擇

精密量取2.0 mL的供試品溶液于10 mL具塞試管中,依次加入5%苯酚溶液1.0 mL,濃硫酸5.0 mL,加水定容,搖勻,于室溫放置10 min,分別于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃和沸水浴下加熱10 min后,立即取出置冷水浴中冷卻至室溫,測(cè)定吸光度。結(jié)果見(jiàn)圖1,結(jié)果表明,最佳水浴溫度為60℃。

圖1 水浴溫度對(duì)吸光度的影響Fig.1 Effect of water bath temperature on absorption

2.3.2 水浴加熱時(shí)間的選擇

精密量取2.0 mL的供試品溶液于10 mL具塞試管中,按照2.3.1項(xiàng)下方法顯色,60℃水浴溫度下分別加熱10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min,然后立即取出置冷水浴中冷卻至室溫,測(cè)定吸光度,結(jié)果見(jiàn)圖2,結(jié)果表明,最佳水浴加熱時(shí)間為20 min。

圖2 水浴加熱時(shí)間對(duì)吸光度的影響Fig.2 Effect of heating time in water bath on absorption

2.3.3 苯酚用量的選擇

精密量取2.0 mL的供試品溶液于10 mL具塞試管中,分別加入0.3 mL、 0.4 mL、 0.5 mL、 0.6 mL、 0.7 mL、 0.8 mL、0.9 mL、1.0 mL 5%苯酚溶液,按照2.3.1項(xiàng)下方法顯色,于60℃水浴中加熱20 min,立即取出置冷水浴中冷卻至室溫,測(cè)定吸光度,結(jié)果見(jiàn)圖3,結(jié)果表明,最佳的苯酚溶液用量為0.6 mL。

圖3 苯酚用量對(duì)吸光值的影響Fig.3 Effect of the amount of phenol on absorption

2.3.4 濃硫酸用量的選擇

精密量取4份2.0 mL的供試品溶液分別置于4支10 mL具塞試管中,分別加入5%苯酚溶液0.6 mL,向4支試管中分別加入4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL、7.0 mL濃硫酸,按照2.3.1項(xiàng)下方法顯色,測(cè)定吸光度,結(jié)果見(jiàn)圖4,結(jié)果表明,最佳的濃硫酸用量為6.0 mL。

圖4 濃硫酸用量對(duì)吸光度的影響Fig.4 Effect of theamount of concentrated sulfuric acid on absorption

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,確定樣品溶液的最佳顯色條件為:水浴加熱溫度60℃,水浴加熱時(shí)間為20 min,5%苯酚溶液的用量為0.6 mL,濃硫酸用量為6.0 mL。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取25.2 mg干燥至恒重的葡萄糖對(duì)照品于25 mL容量瓶中,加水溶解,定容,搖勻,即得1.008 mg·mL-1的葡萄糖儲(chǔ)備溶液。分別精密量取葡萄糖儲(chǔ)備液0.00 mL、0.25 mL、0.75 mL、1.25 mL、1.75 mL、2.25 mL于25 mL容量瓶中,加水定容,搖勻,即得葡萄糖系列溶液。精密量取上述葡萄糖系列溶液各2.0 mL分別置于6支10 mL具塞試管中,依次加入0.6 mL 5%苯酚溶液、6.0 mL濃硫酸,加水定容,搖勻,室溫放置10 min,然后在60℃水浴中加熱20 min,立即取出置冷水浴中冷卻至室溫,測(cè)定吸光度。以吸光度值(A）為縱坐標(biāo),葡萄糖溶液的濃度(μg·mL-1）為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算回歸方程。結(jié)果表明,葡萄糖溶液在2～18 μg·mL-1范圍內(nèi)其濃度與吸光度線性關(guān)系良好,回歸方程為A=0.0423C+0.0042(r=0.9998）。

2.4.2 精密度試驗(yàn)

精密量取2.0 mL供試品溶液置于10 mL具塞試管中,按2.4.1項(xiàng)下方法顯色,連續(xù)測(cè)定吸光度6次,RSD為0.025%,表明精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密量取2.0 mL供試品溶液置于10 mL具塞試管中,按2.4.1項(xiàng)下方法顯色,每隔20 min測(cè)定一次吸光度,考察樣品溶液在2 h內(nèi)顯色的穩(wěn)定性,結(jié)果表明供試品溶液在2 h內(nèi)穩(wěn)定,RSD為0.87%。

2.4.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密量取2.0 mL供試品溶液6份,分別置于6支10 mL具塞試管中,按2.4.1項(xiàng)下方法顯色,測(cè)定吸光度,RSD為1.8%,表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.4.5 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

精密稱取干燥至恒重的葡萄糖對(duì)照品0.0205 g于100 mL容量瓶中,加水定容,搖勻,即得0.205 mg·mL-1的葡萄糖溶液。精密量取上述葡萄糖溶液 0.0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL于6支10 mL容量瓶中,加水定容,搖勻, 即得 0.0 μg·mL-1、 20.5 μg·mL-1、 41.0 μg·mL-1、61.5 μg·mL-1、 82.0 μg·mL-1、 102.5 μg·mL-1的葡萄糖溶液。精密量取1.0 mL供試品溶液6份,分別置于6支10 mL具塞試管中,各加入上述葡萄糖系列溶液1.0 mL于上述6支具塞試管中,按2.4.1項(xiàng)下方法顯色,計(jì)算回收率,平均加標(biāo)回收率為98.0%,RSD為1.4%。

2.5 樣品含量測(cè)定

精密稱取3份干燥至恒重的云南松松塔抗腫瘤活性部位粗粉25.0 mg于25 mL容量瓶中,配制3份供試品溶液。精密量取上述供試品溶液各2.0 mL,按2.4.1項(xiàng)下方法顯色,測(cè)定吸光度值,計(jì)算多糖含量,結(jié)果見(jiàn)表1,云南松松塔抗腫瘤活性部位的多糖平均含量為44.07%。

表1 云南松松塔抗腫瘤活性部位多糖含量測(cè)定（n=3）Table 1 Determination of thecontent of polysaccharide in the anti-tumor active site from pinecones of Pinus yunnanensis Faranch（n=3）

3 結(jié) 論

本文對(duì)云南松松塔抗腫瘤活性部位多糖含量測(cè)定的最佳顯色條件進(jìn)行了考察,通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定最佳顯色條件為:水浴加熱溫度為60℃,水浴加熱時(shí)間為20 min,5%苯酚溶液的用量為0.6 mL,濃硫酸的用量為6.0 mL。該方法操作簡(jiǎn)便、精密度良好,且在2 h內(nèi)穩(wěn)定,可用于云南松松塔抗腫瘤活性部位多糖含量的測(cè)定,云南松松塔抗腫瘤活性部位的多糖含量為44.07%。