劉力瑋,楊夢露,覃希榕,劉銘昱,唐振威,侯 娟,2

（1吉首大學醫(yī)學院，湖南 吉首 416000；2吉首大學湖南省土家藥研究中心，湖南 吉首 416000）

隨著抗生素在臨床醫(yī)學上的廣泛應用,病原體對傳統(tǒng)抗生素類型藥物的抗藥性越來越明顯,導致抗生素的在醫(yī)學上的應用愈發(fā)局限性[1],并且傳統(tǒng)抗生素藥物對身體會產(chǎn)生副作用,現(xiàn)在人們開始逐漸關注中藥的抗菌效果[2]。湘西動氣候適宜,植物資源豐富,有著燦爛的醫(yī)藥文化,其中有一種名為豨薟草的土家族藥材,具有祛風濕,通經(jīng)絡,清熱解毒之功效[3],可以用來治療黃疸,蟲獸咬傷等疾病[4]。臨床可用于祛風濕、利關節(jié)、抗炎、降血壓[5-6]。豨簽草中所含有的抑菌物質是一種豨薟堿類生物堿的成分。為了更加深入的研究豨簽草生物堿成分的抗菌效果,從豨簽草中提取了豨薟堿,采用常見的病原菌做實驗進進行藥物敏感性實驗并對敏感菌的最小抑菌濃度進行檢測[7-8]。本文擬以植物該的提取物為材料,以常見的病原菌為實驗菌進行藥物敏感性實驗。研究粘草子中生物堿成分的抑菌效果,為進一步深入研究與應用提供科學依據(jù)。

1 實 驗

1.1 材料與儀器

1.1.1 實驗材料

供實材料豨簽草材料于2018年6月15日采于湖南省湘西土家族苗族自治州吉首市矮寨鄉(xiāng)德夯村(經(jīng)度:109.57,緯度:28.34采摘）,經(jīng)鑒定為菊科植物豨薟的全草,將帶花果的豨簽草全草放入恒溫箱干,控溫105℃干燥24 h,取出冷至室溫用FZ-102植物粉碎機將干燥后的豨簽草粉碎備用。

1.1.2 菌種與培養(yǎng)基

肺炎鏈球菌,金黃色葡萄球菌,大腸桿菌,銅綠假單胞菌,枯草桿菌共5種標準菌,肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,購于北京奧博星生物技術有限公司。

1.1.3 儀 器

電熱恒溫培養(yǎng)箱；光學顯微鏡；型恒溫水浴鍋；植物粉碎機；高壓蒸汽滅菌鍋。

1.2 實驗方法

1.2.1 正交設計

將豨簽草放入恒溫箱干,控溫105℃干燥24 h,取出冷至室溫用植物粉碎機將干燥后的豨簽草粉碎,然后準確稱取粉碎后的黏草子。分別稱取10 g豨簽草以10∶1液料比獲得浸提液。

1.2.1.1 醇提正交實驗的設計

根據(jù)正交實驗設計原理,總和單因素預實驗結果,選取影響乙醇浸提豨簽草浸提液抑菌效果的影響因素:乙醇溶液體積分數(shù)(Ⅰ）、浸提溫度(Ⅱ）、浸提時間(Ⅲ）,實驗因素與水平設計見表1。

表1 正交實驗因素與水平Table 1 Orthogonal test factors and levels

1.2.1.2 水提實驗的設計

水提實驗分為兩組,第一組均用沸水分別浸提60、120、240、360 min；第二組:在第一組基礎上,分別用60、70、80、90℃蒸餾水浸提。為保持溫度,實驗在水浴鍋內(nèi)進行。

1.2.2 方法及最小抑菌濃度的測定

根據(jù)上述1.2.1.1與1.2.1.2的方法獲取豨簽草的提取液,采用無菌鹽水配置待試菌懸液。分別吸取0.2 mL的待試菌懸液放入到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基表面上,然后進行均勻的涂抹,然后放入(37±0.5）℃的培養(yǎng)箱中干燥20 min,待瓊脂凝結后,放入到恒溫箱中,在(37±0.5）℃溫度下進行培養(yǎng)1～2 d,觀察細菌的生長情況。

圖1 濾紙片法Fig.1 Filter paper method

采用濾紙片法進行對抑菌效果進行測定,如圖1所示,采用直徑為6 mm的滅菌濾紙片,放在豨簽草提取液中浸泡2 d,然后使用無菌的鑷子取出濾紙片然后放在含菌平板上,每皿放入7片,其中1張空白濾紙作為對照,其余6張均勻排列,每種菌做兩組平行實驗。

最小抑菌濃度(MIC）的測定:將無菌水在1.2.1.1與1.2.1.2獲取提取液稀釋成若干梯度的溶液,用滅菌移液搶吸取1 mL稀釋的提取液放入要培養(yǎng)皿中,放入培養(yǎng)基,然后在分布吸取0.1 mL的各種各種供試菌菌懸液放入到培養(yǎng)皿表面,采用涂布棒將提取液均勻涂布,然后蓋好培養(yǎng)皿,置于(37±1）℃溫度下的恒溫箱中培養(yǎng)18 h。采用無菌生長的濃度為最低抑菌濃度。以無菌生理鹽水做空白對照[9]。

2 結果與討論

2.1 醇提正交實驗

乙醇提取豨簽草浸提液抑菌實驗結果見表2。從表2可知,不同水平組合下,抑菌環(huán)的大小存在明顯差異。對于銅綠假單胞菌和大腸桿菌而言,Ⅰ1Ⅱ1Ⅲ1組合的抑菌環(huán)分別達到最大；而Ⅰ3Ⅱ3Ⅲ2組合對金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌和枯草桿菌的抑菌環(huán)分別為最大。

表2 醇提抑菌正交實驗結果Table 2 Orthogonal test results of alcohol extraction and bacteriostasis

2.2 水提實驗結果

豨簽草在60、120、240、360 min這幾個時間段內(nèi)用蒸餾水浸提所得浸提液的抑菌環(huán)直徑變化趨勢見圖2。結果顯示,在60、120、240 min兩個豨簽草提取液的浸泡時間會產(chǎn)生抑菌效果,2～4 h的時間段抑菌效果逐漸減弱,240～360 min的抑菌效果出現(xiàn)明顯下降的趨勢,浸泡超過360 min已經(jīng)基本上起不到抑菌的作用。因此,當浸泡時間低于120 min,抑菌效果隨著浸泡時間的增加而增強；當浸泡時間超過120 min后,抑菌效果開始逐漸下降,最后消失,因而水提實驗采用n的浸泡時間為120 min。

豨簽草在60、70、80、90℃ 4個溫度梯度下用蒸餾水浸提120 min所得浸提液的抑菌環(huán)直徑變化趨勢見圖3。結果顯示,60、70℃下浸提液無抑菌現(xiàn)象。80、90℃下對5種菌均有抑菌現(xiàn)象,且80℃下抑菌環(huán)直徑較大,90℃下抑菌效果顯著下降。可見,80℃的溫度能夠更好地提取出豨簽草中的抑菌物質,而90℃的溫度過高,可能導致效應物揮發(fā),故確定水提實驗采用80℃的溫度浸泡。

圖2 不同水提時間抑菌環(huán)直徑變化趨勢圖Fig.2 Variation Trend of diameter of bacteriostatic ring in different water extraction time

圖3 不同水提溫度抑菌環(huán)直徑變化趨勢圖Fig.3 Variation Trend of diameter of bacteriostatic ring at different water extraction temperature

2.3 豨簽草浸潤提取液的最小抑菌濃度

表3 豨簽草浸提液對各供試菌種的最小抑菌濃度Table 3 Minimum inhibitory concentration of the extract of Herba Siegesbeckiae

通過實驗,豨簽草水提液與醇提液均對各供試菌有良好的抑制效果。我們進而采取最小抑菌濃度實驗法來進一步探究抑制作用和對各菌種最小抑菌的差異。實驗結果如表3所示,此結果與上述研究結果一致,豨簽草提取液對5種供試菌均具有抑制效果。由表3可知最小抑菌濃度下,豨簽草水提取液對枯草桿菌的MIC值影響最大,豨簽草的淳提取液對枯草芽孢桿菌的MIC影響較為明顯,豨簽草無論是水提取液和醇提液均對金黃色葡萄球菌的最小抑制濃度均為最低,說明豨簽草提取液對金黃色葡萄球菌的影響較為明顯。在同種豨簽草提取液濃度下,豨簽草的醇提取液比水提取液抑菌效果更明顯,可能是由于乙醇本身具有抑菌的作用,或者乙醇對豨簽草的抗菌物質提取更明顯。

3 結 論

通過研究發(fā)現(xiàn),不管是粘草子的乙醇提取物還是水提取物對常見有害菌有抑制作用。本項中,粘草子醇提取物在醇濃度高,浸潤溫度和浸潤時間較長的情況下對金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌和枯草桿菌在抑菌方面比較顯著。

下一步值得探究的是將豨簽草的提取物中各種成分進行分離并研究各種成分對抑菌效果產(chǎn)生的影響。雖然關于豨簽草的研究很多,但是對于抑菌效果以及比較方面的研究卻較少。本課題在現(xiàn)有的研究基礎上,對土家族特色中藥豨簽草資源開展抑菌活性成分的提取,可帶動以豨簽草為原料的抑菌藥物和保健品等市場的發(fā)展,拓廣養(yǎng)生醫(yī)藥行業(yè)并帶動當?shù)亟?jīng)濟發(fā)展,對中藥材的開發(fā)有強大的引領作用。