孟雁欣 于湄 張靜 楊玉秀

石家莊市第四醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心（石家莊050001）

研究報道約12.4%～35%胎兒超聲異常由染色體畸變引起，染色體核型結(jié)構(gòu)或數(shù)目異常約占25%，染色體微結(jié)構(gòu)異常約占10%［1］。染色體核型分析技術(shù)以“胎兒來源細(xì)胞”為檢測標(biāo)本，被公認(rèn)為檢測染色體數(shù)目異常、大片段缺失/重復(fù)（>10 Mb）、重排、倒位等結(jié)構(gòu)異常的遺傳學(xué)產(chǎn)前診斷“金標(biāo)準(zhǔn)”。染色體微陣列分析技術(shù)（chromosomal microarray analysis，CMA）亦稱為“分子核型”技術(shù)，包括比較基因組雜交的微陣列（array?based com?parative genomic hybridization，aCGH）及單核苷酸多態(tài)性微陣列（single nucleotide polymorphism arrays，SNP arrays），具備高分辨率（0.1～0.3 Mb）、高效率、高靈敏度等優(yōu)勢，可精確定位異常片段，顯示受累基因，利于識別并鑒定疾病相關(guān)基因。2009年美國婦產(chǎn)科醫(yī)師協(xié)會（ACOG）推薦將CMA用作產(chǎn)前胎兒超聲異常檢測，2013年ACOG及美國母胎醫(yī)學(xué)會（SMFM）推薦將CMA替代傳統(tǒng)染色體核型分析技術(shù)方法［2］。部分學(xué)者認(rèn)為CMA不能檢出平衡異位、倒位、<30%嵌合體及單基因疾病，檢測結(jié)果分析復(fù)雜，短期內(nèi)完全取代傳統(tǒng)核型分析并不實(shí)際［3］。

我國2014年發(fā)布CMA產(chǎn)前診斷應(yīng)用專家共識［4］，起步晚，缺乏完善的中國人群數(shù)據(jù)庫等一定程度延緩它的發(fā)展進(jìn)度。本研究回顧性分析47例超聲結(jié)構(gòu)異常胎兒的染色體檢測結(jié)果，探討分析染色體核型及CMA聯(lián)合應(yīng)用在超聲異常胎兒中的臨床應(yīng)用價值，以及染色體結(jié)構(gòu)/微結(jié)構(gòu)變異與臨床表型關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2016年1月至2017年12月因胎兒超聲結(jié)構(gòu)異常于石家莊市第四醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心就診的妊娠女性47例。患者及家屬明確產(chǎn)前診斷指征及意義后簽署知情同意書。

1.2 介入性產(chǎn)前診斷 孕婦取仰臥位，常規(guī)消毒鋪巾，超聲定位穿刺部位。13例孕婦孕12周行絨毛穿刺術(shù)，由專人超聲引導(dǎo)下經(jīng)腹部或經(jīng)陰道抽取妊娠12周絨毛組織25 mg；余孕18周后行羊水穿刺術(shù)，由專人經(jīng)腹部抽取羊水30 mL。

1.3 實(shí)驗(yàn)室分析

1.3.1 傳統(tǒng)染色體核型分析 絨毛細(xì)胞核型分析：取絨毛組織15～20 mg應(yīng)用胰蛋白酶及膠原蛋白酶消化處理，采用長期培養(yǎng)法無菌平行獨(dú)立培養(yǎng)。約9～10 d收獲制片，進(jìn)行常規(guī)G顯帶分析，鏡下計數(shù)20個分裂相，分析3到5個分裂相，如果疑為異常核型或是嵌合體分析不少于50個細(xì)胞分裂相。

羊水細(xì)胞核型分析：抽取羊水10 mL，置于離心機(jī)中1 500 r/min離心10 min，棄上清液，加入羊水細(xì)胞培養(yǎng)基放置于37℃，5%體積分?jǐn)?shù)的二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約5到7 d，收獲前2 h加入10μL秋水仙堿，低滲，固定，制片，進(jìn)行常規(guī)G顯帶染色體分析。顯微鏡下檢測20個核型，分析3個核型，如果疑為異常核型或是嵌合體分析不少于50個細(xì)胞分裂相。

1.3.2 DNA提取 抽取15 mg絨毛/10 mL羊水，應(yīng)用天根DNA提取試劑盒獲得基因組DNA，Nano?Drop1000微量核苷酸蛋白多功能酶標(biāo)儀（美國Gene公司）進(jìn)行DNA含量測定。OD260/OD280比值符合DNA模板擴(kuò)增需求。-80℃保存剩余絨穿/羊穿組織標(biāo)本，擬用于后續(xù)位點(diǎn)驗(yàn)證等分子生物學(xué)分析。

1.3.3 CMA檢測 實(shí)驗(yàn)反應(yīng)流程參照Affymetrix公司提供的實(shí)驗(yàn)操作流程。研究應(yīng)用美國Aff?ymetrix公司提供的全基因組Affymetrix CytoScan 750K Array芯片，該芯片包括200 000 SNP標(biāo)記及550 000 CNV標(biāo)記，平均1個標(biāo)記/4 kb的密度（未覆蓋全染色體基因組所有位點(diǎn)）分布于人類的整個基因組，可以檢測全基因組有臨床意義的染色體微缺失/微重復(fù)和染色體亞端粒缺失綜合征等異常染色體拷貝數(shù)變化及雜合性缺失。檢測結(jié)果與下列公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析：http：//omim.org/（OMIM數(shù)據(jù)庫）；http：//genome.ucsc.edu/（UCSC數(shù)據(jù)庫）；http：//ncbi.nlm.nih.gov/pubmed（NCBI數(shù)據(jù)庫）；https：//decipher.sanger.ac.uk/（DECIPHER數(shù)據(jù)庫）。

2 結(jié)果

2.1 臨床病例分析 孕婦年齡22～45周歲，依據(jù)末次月經(jīng)及孕早期超聲核實(shí)孕婦孕周，孕周11～33周。參照美國疾病控制中心出生缺陷及遺傳疾病科使用的分類標(biāo)準(zhǔn)，以受累器官系統(tǒng)畸形進(jìn)行分類［5］。9例單系統(tǒng)結(jié)構(gòu)異常合并其他系統(tǒng)異常。本研究47例孕婦行產(chǎn)前診斷，8例染色體核型變異，5例CMA變異孕婦選擇終止妊娠，8例染色體核型及CMA陰性胎兒生產(chǎn)，產(chǎn)后3個月隨訪無異常。26例孕婦胎兒染色體核型分析未見異常，動態(tài)超聲觀察，孕晚期進(jìn)行超聲情況及產(chǎn)后隨訪：2例失訪；5例足月順產(chǎn)（4例女孩，1例男孩），至產(chǎn)后3個月隨訪未見異常；4例行剖宮產(chǎn)（2例羊水多剖宮產(chǎn)術(shù)后送往?？漆t(yī)院手術(shù)治療后3個月未見異常）；1例透明隔腔未顯示，男嬰產(chǎn)后3個月頸部力量差；1例產(chǎn)后3個月未見異常。余13例引產(chǎn)胎兒中，1例小腦延髓池及側(cè)腦室增寬胎兒FL/BPD比值異常，胸廓窄小考慮成骨發(fā)育不全行相關(guān)基因檢測示FGR，exon7，c.764C>G；1例考慮超聲及MRI提示腎囊腫當(dāng)?shù)匾a(chǎn)，2例孕晚期胎停育；9例孕晚期超聲示逐漸加重放棄繼續(xù)妊娠。

2.2 染色體核型分析 47例孕婦進(jìn)行染色體核型分析，檢出率約16.8%（8/47），致病率14.9%（表1），包括21?三體4例，性染色體異常2例（含1例嵌合），平衡異位1例，衍生染色體1例，其中46，XN，t（6：18）（p10：q10）核型胎兒源于父親；46，XN，der（1）t（1：2）（q44：p24）核型胎兒源于母親，余夫婦雙方染色體未見異常。

8例核型異常樣本，6例頸部異常（4例<13+6周，2例>14周），包括21?三體2例，性染色體異常2例（含嵌合1例），平衡異位1例，衍生染色體1例；余兩例分別為頸部合并心臟異常及單獨(dú)心臟結(jié)構(gòu)異常，核型結(jié)果21?三體。

2.3 CMA檢測分析 13例染色體核型正常及2例核型異常（1例性染色體嵌合及1例常染色體衍生）孕婦了解CMA適應(yīng)癥、風(fēng)險及檢測意義后繼續(xù)CMA檢測，7例微結(jié)構(gòu)變異［2例染色體核型分析異常（1例性染色體嵌合及1例衍生染色體）］，變異率提高約10.5%（5/47），明確致病率提高約6.4%（3/47）。

檢測到的11個拷貝異常位點(diǎn)中，2例頸部超聲異常胎兒（1例性染色體嵌合及1例常染色體衍生）檢測出4個拷貝異常，2個歸類為致病位點(diǎn)；新發(fā)檢測的1q44未查詢到明確疾病報道，歸類為VOUS；1例超聲頸部異常但染色體核型未見異常胎兒CMA結(jié)果檢出6q26片段異常，與青年帕金森病相關(guān)但目前未發(fā)現(xiàn)與本研究胎兒超聲表型相關(guān)報道，歸類為可能良性位點(diǎn)。

3例臨床小于孕周胎兒染色體核型均未發(fā)現(xiàn)異常，CMA共檢測出5個拷貝異常，4個已報致病意義位點(diǎn)，2個位于性染色體，2個位于常染色體；位于常染色體的7q36.3區(qū)域缺失引起的Currarino綜合征及LGMD型肌營養(yǎng)不良與胎兒臨床表型無明確相關(guān)性，歸類可疑良性位點(diǎn)。

1例胸腹腔積液胎兒染色體核型未見異常，CMA檢測到兩個拷貝異常位點(diǎn)，1q22區(qū)域缺失與腎髓質(zhì)囊性病及先天性糖基化異常1型有關(guān)，數(shù)據(jù)庫報道先天性糖基化異常1型可表現(xiàn)各臟器積液或發(fā)育遲緩，但與胸腹腔積液報道超聲影像表型報道較少，歸類為可疑致病位點(diǎn)；2q13區(qū)域重復(fù)與Joubert綜合征有關(guān)，與本胎兒表型無相關(guān)性，歸類為可能良性。

表1 胎兒染色體及片段異常類型Tab.1 Karyotype and CMA findings in relation to indications for testing fetuses 例（%）

3 討論

3.1 染色體核型分析聯(lián)合CMA在胎兒超聲結(jié)構(gòu)中的臨床應(yīng)用 傳統(tǒng)染色體核型分析用于染色體結(jié)構(gòu)及數(shù)目檢測。本研究47例胎兒應(yīng)用傳統(tǒng)染色體核型分析明確8例核型異常，包括非整倍體、性染色體嵌合、平衡易位及衍生染色體結(jié)構(gòu)變異，但該方法對微小片段敏感性低易導(dǎo)致漏篩。CMA作為高分辨率、高效率分子生物學(xué)檢測方法，能檢測到傳統(tǒng)染色體核型無法檢測的<50 bp微小片段，變異檢出率顯著提高。筆者在染色體核型分析技術(shù)基礎(chǔ)上聯(lián)合CMA技術(shù)檢測提示5例核型陰性胎兒檢測出染色體微結(jié)構(gòu)變異，檢出染色體變異率提高了10.5%，明確致病比例提高了6.3%。這一結(jié)果與既往CMA檢測能顯著提高染色體疾病變異率報道一致，但略高于HILLMAN等［6］報道指出的CMA將染色體核型正常但超聲結(jié)構(gòu)異常胎兒病例明確致病率高于3%～5%的結(jié)論。與ANITA等報道一組香港人群研究中將診斷率提高12%～15%結(jié)果一致［7］。筆者考慮這與亞洲人群種族、地域差異性有關(guān)，同時本研究異常超聲表型局限，不除外入組病例數(shù)量少有關(guān)，后續(xù)研究筆者將繼續(xù)增加異常超聲表型數(shù)目及入組病例數(shù)。除此之外，1例明確性染色體嵌合胎兒繼續(xù)行CMA檢測微結(jié)構(gòu)變異提示男性無精/少精引起的不育癥有關(guān)［8?9］；1例胎兒衍生染色體行CMA明確了片段來源性質(zhì)及區(qū)帶定位，結(jié)果提示與2p25.3p24.3引起的CHARGE綜合征有關(guān)［10］。上述微結(jié)構(gòu)變異均與國際數(shù)據(jù)庫已報染色體微結(jié)構(gòu)變異與異常超聲表型報道一致，為遺傳咨詢提供了有效信息。然而，實(shí)際臨床工作中CMA短期內(nèi)并不能完全取代傳統(tǒng)染色體核型分析方法在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用［11］。究其原因與CMA檢測及親緣驗(yàn)證費(fèi)用高，地方普及該類檢測存在困難，復(fù)雜檢測數(shù)據(jù)結(jié)果解讀對臨床醫(yī)生專業(yè)水平要求較高；其次，CMA不能檢出倒位及低比例嵌合體、平衡異位重排信息、單基因等遺傳致病因素。筆者認(rèn)為產(chǎn)前診斷中，將染色體核型分析與CMA聯(lián)合用于超聲異常胎兒的檢測，對于核型分析未發(fā)現(xiàn)染色體異常病例進(jìn)一步行CMA檢測可以明確染色體微結(jié)構(gòu)變異致病風(fēng)險；對于核型分析發(fā)現(xiàn)標(biāo)記染色體或衍生染色體的病例，進(jìn)一步進(jìn)行CMA檢測，可以明確來源，對精準(zhǔn)產(chǎn)前診斷有重要意義。

3.2 染色體變異與胎兒產(chǎn)前超聲異常相關(guān)性分析 產(chǎn)前診斷依靠產(chǎn)前超聲對胎兒結(jié)構(gòu)及比例關(guān)系、外形輪廓變化、某些特殊征像等來評判胎兒預(yù)后及復(fù)發(fā)風(fēng)險。報道指出產(chǎn)前超聲檢出胎兒結(jié)構(gòu)異常越多，胎兒罹患染色體病風(fēng)險越大［12］。準(zhǔn)確評估超聲表型與各畸形相關(guān)染色體異常類型或不同類型染色體異常與可檢測超聲畸形關(guān)系至關(guān)重要。頸部異常［頸部淋巴瘤（nuchal translucency，NT）>0.25 cm，NF>0.60 cm］是公認(rèn)的較早超聲遺傳學(xué)指標(biāo)。Nicolaides指出早孕期和中孕早期，胎兒頸部超聲異常表型是目前提示胎兒染色體異常最敏感和最特異的超聲指標(biāo)［13］。PANDYA等［14］對1 015例因早孕期NT增厚進(jìn)行染色體檢測證實(shí)NT增厚發(fā)生染色體三體的風(fēng)險較高齡孕婦增加。20世紀(jì)80年代，許多研究報道中孕期胎兒頸部異常與非整倍體染色體異常，尤其性染色體異常有關(guān)。除與染色體三體相關(guān)報道外，一項(xiàng)NT增厚染色體核型正常報道證實(shí)NT異常與染色體微結(jié)構(gòu)異常相關(guān)。本研究頸部異常染色體核型變異率占14.9%（包括性染色體、21?三體及其它常染色體），微結(jié)構(gòu)變異率占2.1%，證實(shí)頸部異常不僅是21?三體有效標(biāo)志，亦是其它染色體缺陷的有效標(biāo)志，染色體致病率高，與既往報道一致。

本研究6例胎兒小于孕周（small for gestation?al，SGA），3例染色體核型未見異常，3例檢測出4個微結(jié)構(gòu)變異，分布于性染色體及常染色體上，均有胎兒發(fā)育遲滯致病報道。雖然超聲表型均為SGA，但臨床表型、預(yù)后各有差異。如Xp22.33區(qū)域缺失僅表現(xiàn)四肢發(fā)育異常，余片段變異均伴有不同程度智力及語言障礙；該片段變異引起的發(fā)育遲滯給予重組人生長激素治療可得到有效緩解［15?16］；Xq22.3q28區(qū)域重復(fù)因內(nèi)含F(xiàn)MR伴性腺發(fā)育異常等。除表型等差異外，對復(fù)發(fā)風(fēng)險評判亦有所差別，如X染色體微結(jié)構(gòu)變異多遺傳自女方攜帶者，女方多無任何臨床表現(xiàn)［17?18］。目前國內(nèi)SGA與染色體微結(jié)構(gòu)異常報道甚少，建議重視SGA患兒染色體微結(jié)構(gòu)檢測。同時，我們認(rèn)為“遺傳異質(zhì)性”的存在對超聲表型有影響，筆者染色體及微結(jié)構(gòu)變異致病時，應(yīng)明確片段長度、內(nèi)含致病基因及來源。

3.3 CMA在產(chǎn)前咨詢中的應(yīng)用 CMA技術(shù)可謂是產(chǎn)前診斷的一把“雙刃劍”，對小片段敏感性能增加檢測結(jié)果陽性率，降低染色體病缺陷患兒的出生，更可作為遺傳評估手段用于輔助生殖，使家庭再次生育健康孩子的愿望得以實(shí)現(xiàn)；但臨床意義不明或是復(fù)雜突變結(jié)果會導(dǎo)致孕產(chǎn)婦焦慮，甚至錯誤終止妊娠；能否準(zhǔn)確無誤對大數(shù)據(jù)檢測結(jié)果給予正確判讀給臨床咨詢醫(yī)生專業(yè)能力也提出了挑戰(zhàn)。本研究共檢測出11個拷貝變異位點(diǎn)，經(jīng)數(shù)據(jù)庫比對分析，親源染色體比對后，參照美國ACMG指南中將CMA檢測結(jié)果分為致病性、可能致病、未知意義的、可能良性和良性的分類方法進(jìn)行微結(jié)構(gòu)變異分類［2］。6個位點(diǎn)已有既往致病報道，且與臨床表型一致，歸類為致病位點(diǎn)。新發(fā)的1q44區(qū)域缺失目前未發(fā)現(xiàn)內(nèi)含致病基因，歸類為未知意義位點(diǎn)（variant unknown significance，VOUS）。對于這一類微結(jié)構(gòu)變異位點(diǎn)，不能完全排除致病意義，可能存在新發(fā)或罕見性，亦或是多變外顯率。6q26區(qū)域缺失、7q36.3區(qū)域缺失及2q13區(qū)域重復(fù)片段內(nèi)都涉及基因，但與本研究入選病例臨床無明顯相關(guān)性，歸類為可能良性位點(diǎn)［19］。1q22區(qū)域缺失內(nèi)含的DPM3與先天性糖基化異常1型相關(guān)，引起多臟器積液、損害及發(fā)育遲緩。與本研究臨床表型存在相關(guān)性，故歸類為可疑致病位點(diǎn)。當(dāng)然完善胎兒產(chǎn)前咨詢的同時有效的病例隨訪對于特殊微結(jié)構(gòu)變異位點(diǎn)有重要意義，同時應(yīng)將更多的特殊產(chǎn)前病例提交給ISCA/DEFAPHER數(shù)據(jù)庫，以構(gòu)建良好的交流平臺。

綜上所述，筆者認(rèn)為將傳統(tǒng)染色體核型分析與CMA共同用于超聲結(jié)構(gòu)異常胎兒染色體病檢測，二者“取長補(bǔ)短”，可以顯著提高檢出陽性率，充實(shí)中國人群CMA數(shù)據(jù)庫，明確致病結(jié)構(gòu)、片段來源及致病性，有效指導(dǎo)臨床產(chǎn)前咨詢并制定科學(xué)合理的診療方案。