吳永紅 陳軍 羅洲

四川省簡(jiǎn)陽(yáng)市人民醫(yī)院1重癥醫(yī)學(xué)科，2呼吸內(nèi)科（四川簡(jiǎn)陽(yáng)641400）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmo?nary disease，COPD，簡(jiǎn)稱慢阻肺）是一種嚴(yán)重危及人類健康的慢性疾病，2018年中國(guó)40歲以上的成人慢阻肺的患病率高達(dá)13.7%，為主要醫(yī)療負(fù)擔(dān)之一［1］。目前普遍認(rèn)為COPD的主要病理基礎(chǔ)是慢性非特異性炎癥，炎癥細(xì)胞及細(xì)胞因子在其中起著重要作用［2］。腸道菌群是近年研究的熱點(diǎn)內(nèi)容之一，目前逐漸認(rèn)識(shí)到腸道微生態(tài)失衡可能與COPD慢性氣道炎癥間存在密切關(guān)聯(lián)［3］。本研究旨在進(jìn)一步明確COPD腸道微生態(tài)的多樣性與慢性氣道炎癥的相關(guān)性，為COPD防控提供新的思路。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 2018年2月至2019年4月在我院呼吸內(nèi)科病房或門診新入院未治療的慢阻肺急性加重患者（A組）30例，慢阻肺穩(wěn)定期（S組）30例，并在我院體檢中心選取正常人對(duì)照組（N組）30例。所有入選患者均要求近4周未使用過(guò)抗生素和激素，且無(wú)腸道疾病。

1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn) （1）年齡18～80歲；（2）COPD診斷標(biāo)準(zhǔn)均符合2018年中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)會(huì)制定的COPD診斷標(biāo)準(zhǔn)［1］；（3）呼吸內(nèi)科病房或門診新來(lái)院尚未開始治療的慢阻肺加重期患者及穩(wěn)定期患者。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) （1）惡性腫瘤；（2）活動(dòng)性結(jié)核；（3）其他的呼吸道疾??；（4）腸道疾病的患者；（5）妊娠期哺乳期婦女；（6）病情危重，需要?dú)夤懿骞軝C(jī)械通氣患者；（7）合并多種疾病，病情不穩(wěn)定患者；（8）其他原因不能配合本研究者。正常對(duì)照組為來(lái)自我院體檢中心近4周未使用過(guò)抗生素與激素的無(wú)肺部感染性疾病和腸道疾病的健康體檢人員。本研究經(jīng)患者本人及家屬知情并簽字同意，醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)。

1.2 研究方法

1.2.1 一般資料 所有入選患者均詢問(wèn)病史及查體，行實(shí)驗(yàn)室檢查及肺功能檢查。一般資料的指標(biāo)有：性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）、吸煙指數(shù)（包年）、COPD癥狀評(píng)分（COPD assessment test，CAT）［4］；實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)有：血常規(guī)、降鈣素原（procalcitonin，PCT）、C反應(yīng)蛋白（C?reactive protein，CRP）等。肺功能檢查采用德國(guó)Jaeger公司肺功能儀，測(cè)定第1秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in 1 s，F(xiàn)EV1）、用力肺活量（forced vital capacity，F(xiàn)VC）和一秒率（forced expiratory volume in 1 s/forced vital capacity，F(xiàn)EV1/FVC）：測(cè)定時(shí)間均在早上8：00-12：00進(jìn)行。測(cè)定方法參考中華醫(yī)學(xué)會(huì)發(fā)布的肺功能指南的程序和標(biāo)準(zhǔn)［5］。

1.2.2 糞便標(biāo)本的收集與保存 患者來(lái)院24 h內(nèi)留取新鮮糞便標(biāo)本，厭氧低溫保存后轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)-80℃冰箱保存，直至使用糞便DNA微型試劑盒（MOBIO Laboratories）提取來(lái)自糞便樣品的DNA。

1.2.3 血清炎癥因子的測(cè)定 在開始治療前清晨采集所有患者空腹靜脈血5 mL，分離血漿，置于-20℃冰箱中凍存。采用ELISA法檢測(cè)血漿中腫瘤壞死因子α（TNF?α）、白介素（IL?6）及白介素-8（IL?8）水平，試劑盒均購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，具體步驟依據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.4 糞便中DNA提取和測(cè)序 抽提糞便中的DNA后用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度和濃度，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。細(xì)菌多樣性鑒定對(duì)應(yīng)區(qū)域：16S V3?V4區(qū)（引物343F和798R）343F前端引物：5′?TACGGRAGGCAGCAG?3′；后端引物：798R?5′?AGGGTATCTAATCCT?3′，對(duì)V3?V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，Qubit檢測(cè)對(duì)PCR產(chǎn)物定量。純化后產(chǎn)物送上海歐易公司測(cè)序，由Illumina Miseq測(cè)序。

1.2.5 生物信息學(xué)分析 使用Trimmomatic軟件［6］對(duì)原始雙端序列進(jìn)行去雜，采用Vsearch軟件［7］，對(duì)參數(shù)為序列相似度≥97%被歸為一個(gè)操作分類單元（operational Taxonomic Unit，OTU）。使用QIIME軟件包的挑選出各個(gè)OTU的代表序列，并將所有代表序列與Silva（version123）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)注釋［8］。用組間差異顯著物種分析（LEfSe）軟件［9］，確定組間相對(duì)豐度差異的菌群。用冗余分析（redundancy analysis，RDA）方法，找出差異菌群與炎癥因子及臨床指標(biāo)的相關(guān)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。重復(fù)測(cè)量方差分析，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，正態(tài)分布數(shù)據(jù)用表示，用Spearman進(jìn)行相關(guān)性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 本研究共納入A組、S組、N組患者各30例，最后完成實(shí)驗(yàn)且標(biāo)本合格者80例，其中A組29例，S組29例，N組22例。A組與S組患者在年齡、性別、吸煙指數(shù)、CAT指數(shù)、肺功能指標(biāo)等臨床指標(biāo)上基線一致，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。而BMI、嚴(yán)重程度分級(jí)、炎性指標(biāo)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.2 血清炎癥因子指標(biāo)比較及相關(guān)性分析

2.2.1 3組患者血清炎癥因子水平 IL?8，TNF?α與IL?6差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中A組患者高于S組，且均高于N組，見表2。

2.2.2 相關(guān)性分析 IL?8、IL?6與TNF?α三者之間呈正相關(guān)（r=0.748、0.591、0.753，P<0.05），且炎癥指標(biāo)與CAP評(píng)分、疾病嚴(yán)重程度分級(jí)與肺功能均存在相關(guān)性，見表3。

2.3 3組患者腸道菌群LEfSe分析 該分析主要是找到組間在豐度上有顯著差異的物種，不同顏色表示不同分組，可以觀察3組中存在顯著差異的物種，見圖1。

2.4 菌群相對(duì)豐度與炎癥指標(biāo)相關(guān)性分析

2.4.1 A組患者腸道菌群相對(duì)豐度與炎癥指標(biāo)的相關(guān)性分析 在A組患者中，霍氏真桿菌、厭氧棒狀菌屬、毛螺旋菌屬、雙歧桿菌、布勞特氏菌屬、柯林斯菌屬、Subdoligranulum菌與TNF?α、IL?8、IL?6、CAT評(píng)分和嚴(yán)重程度分級(jí)均呈負(fù)相關(guān)，但與FEV1%呈正相關(guān)。相反，普雷沃菌屬-9、腸球菌、Lachnoclostridium菌和副擬桿菌則與炎性因子、CAT評(píng)分、嚴(yán)重程度分級(jí)呈正相關(guān)，而與FEV1%呈負(fù)相關(guān)，見表4。

表1 兩組患者臨床資料比較Tab.1 Comparison of clinical data between the two groups ±s

表1 兩組患者臨床資料比較Tab.1 Comparison of clinical data between the two groups ±s

臨床指標(biāo)性別［男（%）］年齡（歲）吸煙指數(shù)（包/年）BMI（kg/㎡）WBC（×109/L）NEU（%）GOLD分級(jí)［例（%）］1級(jí)2級(jí)3級(jí)4級(jí)CAT評(píng)分FEV1%FEV1/FVC PO2（kPa）PCO2（kPa）PCT（pg/mL）CRP（mg/L）A組（n=29）17（58.61）64.14±8.04 18.07±13.24 21.47±1.46 8.53±2.43 73.72±10.18 0（0）16（55.17）7（24.14）6（20.69）19.58±6.22 46.73±13.83 54.28±11.47 10.01±2.79 6.16±2.42 0.28±0.51 48.37±66.12 S組（n=29）18（62.08）64.93±8.42 19.24±13.61 22.69±1.43 6.48±1.59 68.42±4.68 0（0）17（58.62）4（13.79）8（27.59）18.54±6.58 50.42±15.27 55.08±11.29 9.68±1.83 5.96±1.19 0.07±0.04 12.48±11.17 t/χ2值0.827 0.793 0.621 1.318 2.057 5.31 88.6 0.616 3.65 1.60 0.427 0.126 5.439 8.969 P值0.658 0.779 0.431 0.001<0.001 0.005<0.001 0.436 0.263 0.537 0.46 0.75 0.006<0.001

表2 3組患者血清炎癥因子指標(biāo)比較Tab.2 Comparison of serum inflammatory factors among the three groups ±s

表2 3組患者血清炎癥因子指標(biāo)比較Tab.2 Comparison of serum inflammatory factors among the three groups ±s

組別A組S組N組F值P值例數(shù)29 29 22 IL?8（pg/mL）60.96±26.80 41.33±9.76 30.13±5.89 24.972<0.001 IL?6（pg/mL）55.90±32.70 41.65±17.69 11.82±5.07 31.276<0.001 TNF?α（pg/mL）31.22±11.46 24.92±7.97 11.12±4.41 42.923<0.001

表3 血清炎癥因子與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析Tab.3 The relativity analysis of serum inflammatory factors and clinical indicators

圖1 LEfSe分析差異物種注釋分支例圖Fig.1 Example diagram of annotation branches for LEfSe analysis of different species

表4 A組患者腸道菌群相對(duì)豐度與炎癥指標(biāo)相關(guān)系數(shù)Tab.4 Correlation analysis between the abundance of intestinal flora and inflammatory indicators in group A

2.4.2 S組患者腸道菌群相對(duì)豐度與炎癥指標(biāo)的相關(guān)性分析 在S組患者中，雙歧桿菌和Fusi?catenibacter菌豐度與IL?8水平呈負(fù)相關(guān)，Lachno?clostridium菌的豐度與IL?8及TNF?α水平均呈正相關(guān)，雙歧桿菌與CAT評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，與FEV1%呈正相關(guān)；雙歧桿菌、Anaerostipes菌和Fusicateni?bacter與BMI呈正相關(guān)，見表5。

2.4.3 N組患者腸道菌群相對(duì)豐度與炎癥指標(biāo)的相關(guān)性分析 在N組患者中，霍氏真桿菌豐度與患者CAT評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，與FEV1%呈正相關(guān)；羅斯氏菌豐度與IL?8水平及嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，F(xiàn)u?sicatenibacter菌的豐度與TNF?α水平均呈正相關(guān)，見表6。

表5 S組患者腸道菌群相對(duì)豐度與臨床指標(biāo)及炎癥因子的相關(guān)系數(shù)Tab.5 Correlation analysis between the abundance of intestinal flora and inflammatory indicators in group S

表6 N組患者腸道菌群相對(duì)豐度與臨床指標(biāo)及炎癥因子的相關(guān)系數(shù)Tab.6 Correlation analysis between the abundance of intestinal flora and inflammatory indicators in group N

3 討論

慢阻肺是一種由多種炎癥細(xì)胞因子參與的慢性氣道炎癥性疾病，穩(wěn)定期COPD患者仍然存在氣道和全身的慢性炎癥反應(yīng)［1-2］。在COPD發(fā)病機(jī)制中，TNF?α、IL?8、IL?6是重要的致炎因子，通過(guò)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞聚集、黏附及脫顆粒，激化氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，參與或加重COPD氣道炎癥反應(yīng)過(guò)程［10-11］。腸道菌群微生態(tài)失衡引起的內(nèi)毒素及炎性介質(zhì)釋放，直接或間接促進(jìn)COPD的發(fā)生發(fā)展。腸道和肺部通過(guò)微生物、免疫功能相互影響，實(shí)現(xiàn)雙向調(diào)節(jié)，稱為腸-肺軸［12］。肺與腸存在相同的結(jié)構(gòu)來(lái)源，哺乳動(dòng)物肺上皮起源于胚胎腸內(nèi)胚層，是從前腸內(nèi)胚層的共同的祖先細(xì)胞衍生而來(lái)［13］。而且，腸源性有害因素是通過(guò)腸道到達(dá)肺部和全身循環(huán)淋巴管［14］。而腸道益生菌則可能改善COPD病理改變。HERB等［15］研究證明，短雙歧桿菌和鼠李糖乳桿菌可以改變COPD模型小鼠肺部病理特征，降低巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)［16］。另有研究發(fā)現(xiàn)，攝入能夠增加短鏈脂肪酸生成的膳食可以預(yù)防彈性蛋白酶誘導(dǎo)的炎癥和肺氣腫的出現(xiàn)［17］。由上可知，腸道微生態(tài)與肺部之間可能通過(guò)代謝及免疫調(diào)節(jié)等信號(hào)通路相互影響［18］。

本研究中慢阻肺急性加重期患者的TNF?α，IL?8，IL?6高于穩(wěn)定期患者，且均高于正常對(duì)照，表明COPD患者存在明顯的炎癥反應(yīng)，炎癥因子可能參與了COPD發(fā)病及發(fā)展過(guò)程。IL?8、IL?6、TNF?α三者間存在正相關(guān)，說(shuō)明炎癥因子的升高可能觸發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，啟動(dòng)炎癥反應(yīng)及刺激其他炎癥介質(zhì)［19］，因此血清中的多種炎癥因子均會(huì)出現(xiàn)異常升高。炎癥因子升高與患者的嚴(yán)重程度和CAP評(píng)分存在正相關(guān)，與肺功能指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明炎癥因子的升高可能產(chǎn)生對(duì)氣道、肺泡壁和肺血管的慢性損傷［20］，從而引起氣流受限，提示炎癥因子對(duì)于判斷和預(yù)測(cè)COPD急性加重及病情的嚴(yán)重程度均有一定的價(jià)值。

本研究中3組患者腸道菌群存在明顯差異，用LEfSe分析進(jìn)一步確定組間在豐度上有顯著差異的物種，A組差異的物種有擬桿菌屬、芽孢桿菌屬、變形菌、腸球菌、普雷沃氏菌科；S組有差異的物種有：放線菌門、雙歧桿菌屬；N組有差異的物種有綠菌門、毛螺菌屬、厚壁菌門、布勞特氏菌等。提示這些差異物種可能可作為慢阻肺分期的生物標(biāo)志物。差異菌與炎癥因子及臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，在慢阻肺急性加重期患者中，霍氏真桿菌、Anaerostipes菌、毛螺旋菌屬、雙歧桿菌、布勞特氏菌屬、柯林斯菌屬、Subdoligranulum菌與炎癥因子、CAP評(píng)分及嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，與肺功能指標(biāo)FEV1%呈正相關(guān)，而普雷沃菌屬-9、腸球菌、Lachnoclostridium菌和副擬桿菌卻恰好相反。霍氏真桿菌、Anaerostipes菌、雙歧桿菌等可產(chǎn)生豐富的短鏈脂肪酸，維護(hù)腸黏膜免疫系統(tǒng)的平衡，抑制炎癥因子，減輕慢阻肺患者的慢性炎癥損傷，從而改善患者的臨床癥狀與肺功能［21］。普雷沃菌屬-9、腸球菌、Lachnoclostridium菌和副擬桿菌等豐度的升高引起炎癥因子的高表達(dá)，從而促進(jìn)慢阻肺的發(fā)生發(fā)展。在穩(wěn)定期的慢阻肺患者及正常對(duì)照組中，菌群的豐度與炎癥因子及臨床指標(biāo)的相關(guān)性較弱，雙歧桿菌、Fusicatenibacter菌與羅斯氏菌與氣道炎癥因子呈負(fù)相關(guān)，而與FEV1呈正相關(guān)，而Lachnoclostridium菌則同樣得出相反的結(jié)果。進(jìn)一步提示霍氏真桿菌、雙歧桿菌、布勞特氏菌屬等菌種可能減輕慢阻肺患者氣道炎癥，而普雷沃菌-9、腸球菌、Lachnoclostridium菌等則可能引起炎癥因子升高，而與慢阻肺急性加重和臨床指標(biāo)的惡化有關(guān)。

綜上所述，本研究揭示了慢阻肺患者在不同時(shí)期腸道微生態(tài)和炎癥因子的變化，以及微生態(tài)與炎癥因子及臨床指標(biāo)的相關(guān)性，找出不同分期存在的差異菌群。提示有些菌群，如霍氏真桿菌，Anaerostipes菌，毛螺旋菌屬，雙歧桿菌等可抑制慢阻肺的慢性炎癥，或許可作為慢阻肺患者的有益菌；而普雷沃菌屬-9、腸球菌、Lachnoclostridium菌和副擬桿菌等則與炎癥因子高表達(dá)有關(guān)，可能促進(jìn)慢阻肺的發(fā)生與進(jìn)展。隨著高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)一步發(fā)展，通過(guò)改變腸道不同菌群的豐度，對(duì)慢阻肺的發(fā)生發(fā)展及急性加重的預(yù)防進(jìn)行調(diào)控，可能可作為下一步的研究方向。本研究存在以下不足：腸道菌群影響因素多，研究結(jié)果可能會(huì)受到混雜因素的影響；樣本量少；研究的菌種尚有限。以后尚需開展大規(guī)模的更精準(zhǔn)的研究才能提供更多的證據(jù)。