李改 胡兵 張會(huì)敏

1河南南陽(yáng)南石醫(yī)院檢驗(yàn)科（河南南陽(yáng)473000）；2新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院（河南新鄉(xiāng)453000）

高血壓性腦出血（HICH）屬于臨床危重癥，發(fā)病率高，占全部腦出血類型的70%左右［1］，致死致殘率高，預(yù)后差，嚴(yán)重威脅人類的生命健康。近年來，臨床常采用評(píng)分量表預(yù)測(cè)HICH患者預(yù)后，但仍缺乏準(zhǔn)確可靠的實(shí)驗(yàn)室預(yù)測(cè)指標(biāo)。病理生理研究表明［2］，HICH發(fā)病過程涉及炎癥、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等多種機(jī)制，其中炎癥反應(yīng)與急性腦損傷及預(yù)后關(guān)系密切。已有研究證實(shí)［3］，核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（NLRP3）的激活可介導(dǎo)白介素-18（IL?18），從而參與炎癥反應(yīng)，進(jìn)而損傷腦組織。瘦素是一種分泌型多肽，結(jié)構(gòu)與IL?18、IL?6等相似，屬于細(xì)胞因子，在多種炎性疾病中均有重要生物學(xué)效應(yīng)［4］。上述研究均提示瘦素、IL?18、NLRP3均參與炎癥反應(yīng)，與腦出血病情嚴(yán)重程度有關(guān)，但關(guān)于三者在HICH預(yù)后評(píng)估中應(yīng)用較少，因此，了解HICH后炎癥相關(guān)因子瘦素、IL?18、NLRP3的表達(dá)與疾病嚴(yán)重程度及預(yù)后的關(guān)系，對(duì)指導(dǎo)臨床治療及改善預(yù)后有重要意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 采用前瞻性隨機(jī)對(duì)照研究方法，選取2018年1-12月醫(yī)院收治的132例HICH患者，設(shè)為疾病組，其中男79例，女53例；年齡35～79歲，平均（58.50±6.41）歲；高血壓病程1～20年，平均（8.50±1.34）年；發(fā)病至手術(shù)時(shí)間1～24 h，平均（15.71±2.14）h；出血部位：皮質(zhì)33例，基底節(jié)69例，丘腦17例，小腦13例；出血量10～85 mL，平均（32.17±5.10）mL；入院高血壓分級(jí)［5］：Ⅰ級(jí)29例，Ⅱ級(jí)66例，Ⅲ級(jí)37例；入院格拉斯哥昏迷（GCS）評(píng)分［6］：13～15分60例，9～12分44例，≤8分28例；臨床神經(jīng)功能缺損程度［7］：輕型62例，中型44例，重型26例；合并糖尿病29例；手術(shù)方式：小骨窗開顱術(shù)37例，骨瓣開顱血腫清除術(shù)65例，腦室外引流術(shù)30例；同時(shí)選取同時(shí)期體檢中心收入的50例健康受試者，設(shè)為健康組，男30例，女20例；年齡35～75歲，平均（57.83±6.24）歲；疾病組和健康組性別構(gòu)成比、年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）疾病組均符合HICH診斷標(biāo)準(zhǔn)［8］，且經(jīng)顱腦影像學(xué)證實(shí)、首發(fā)病例、均接受手術(shù)治療；（2）健康組經(jīng)體檢合格；（3）均簽署知情同意書；排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）疾病組排除動(dòng)靜脈畸形、顱腦內(nèi)腫瘤等其他原因引起的出血；（2）疾病組排除腦干出血、雙側(cè)腦疝等；（3）均合并機(jī)體重要臟器功能嚴(yán)重不全者；（4）健康組排除心血管、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病或骨關(guān)節(jié)病者。本次研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)審批。

1.2 方法

1.2.1 瘦素、IL?18檢測(cè) 收集患者入院24 h內(nèi)及健康受試者空腹靜脈血3 mL（不含抗凝劑的真空采血管），靜止自然分層后，2 800 r/min離心10 min，收集上層血清，應(yīng)用瘦素酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒、IL?18 ELISA試劑盒（上?？道噬锟萍加邢薰荆z測(cè)血清瘦素、IL?18水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟操作，于酶標(biāo)儀下測(cè)定吸光光度值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本濃度。

1.2.2 NLRP3 mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用含乙二胺四乙酸（EDTA）的真空采血管，采集疾病組和健康組受試者空腹靜脈血5 mL，2 800 r/min離心10 min，收集上層血漿1 mL，加入等體積磷酸鹽緩沖液（PBS）混勻，加入2 mL淋巴細(xì)胞分離液，2 000 r/min離心20 min，取第二層液體，即為外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs），PBS重懸再次離心2次，取下層沉淀；沉淀采用Trizol法提取總核糖核酸（RNA），逆轉(zhuǎn)錄獲得互補(bǔ)鏈脫氧核糖核酸（cDNA），然后應(yīng)用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒（日本TakaRa公司）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT?qPCR），按照試劑盒說明書設(shè)定反應(yīng)體系，以β?actin為管家基因，2?△△CT為目的基因的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取Ct平均值。

1.2.3 預(yù)后判定 患者入院后確診為HICH 6個(gè)月后，以復(fù)診或電話方式隨訪，采用格拉斯哥預(yù)后（GOS）評(píng)分［9］評(píng)估患者預(yù)后情況，預(yù)后共分5級(jí)：5級(jí)為恢復(fù)良好，有輕度缺陷但可正常生活；4級(jí)為輕度殘疾，但可獨(dú)立生活或保護(hù)下工作；3級(jí)為重度殘疾，神志清醒但不能獨(dú)立生活；2級(jí)為植物生存；1級(jí)為死亡。1～3級(jí)為預(yù)后不良，4～5級(jí)為預(yù)后良好。

1.2.4 臨床資料調(diào)查及危險(xiǎn)因素賦值 根據(jù)預(yù)后情況將患者分為預(yù)后良好組和預(yù)后不良組，收集2組臨床資料，包括性別、年齡、高血壓病程、發(fā)病至手術(shù)時(shí)間、神經(jīng)功能缺損程度、出血部位、是否破入腦室、出血量、入院高血壓分級(jí)、GCS評(píng)分、是否合并糖尿病、手術(shù)方式及外周血瘦素、IL?18、NLRP3 mRNA相對(duì)表達(dá)量。將上述可能導(dǎo)致預(yù)后不良的因素進(jìn)行賦值，并以之為自變量，以預(yù)后是否不良（否=0、是=1）為因變量進(jìn)行Logistic回歸分析（表1）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 SPSS 24.0處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料均用表示，兩兩樣本比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多樣本計(jì)量資料比較用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK?q檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用［例（%）］表示并用檢驗(yàn)，等級(jí)計(jì)數(shù)資料用秩和檢驗(yàn)；應(yīng)用Logistic回歸分析法分析導(dǎo)致預(yù)后不良危險(xiǎn)因素的比值比（odds ratio，OR）及95%置信區(qū)間（confidence interval，CI）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 Logistic回歸分析賦值Tab.1 Logistic regression analysis assignments

2 結(jié)果

2.1 健康組和不同嚴(yán)重程度患者瘦素、IL?18、NLRP3對(duì)比 健康組、不同嚴(yán)重程度疾病組外周血瘦素、IL?18、NLRP3比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；不同嚴(yán)重程度疾病組外周血瘦素、IL?18、NLRP3均高于健康組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且重型組大于輕型和中型組，中型組大于輕型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表2）。2.2 預(yù)后良好組和預(yù)后不良組瘦素、IL?18、NL?RP3對(duì)比 預(yù)后良好率為68.18%（90/132）；預(yù)后不良組瘦素、IL?18、NLRP3均高于預(yù)后良好組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表3）。

2.3 預(yù)后良好組和預(yù)后不良組可能影響因素的差異對(duì)比 預(yù)后不良組性別、高血壓病程、發(fā)病至手術(shù)時(shí)間、出血部位、入院高血壓分級(jí)、合并糖尿病、不同手術(shù)方式患者構(gòu)成比比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；預(yù)后不良組年齡＞60歲、重型神經(jīng)功能缺損、破入腦室、出血量＞30 mL、入院GCS評(píng)分≤8分患者構(gòu)成比均高于預(yù)后良好組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表4）。

2.4 Logistic回歸分析法分析導(dǎo)致預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素 經(jīng)Logistic回歸分析，年齡＞60歲、破入腦室、出血量＞30 mL、瘦素＞16.2 ng/mL、IL?18＞220 ng/L、NLRP3 mRNA相對(duì)表達(dá)量＞3.1、重型神經(jīng)功能缺損、入院GCS評(píng)分≤8分均是導(dǎo)致預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素（P＜0.05，表5）。

表2 健康組和不同嚴(yán)重程度患者瘦素、IL?18、NLRP3對(duì)比Tab.2 Comparison of leptin，IL?18，NLRP3 in healthy groups and patients with different severity ±s

表2 健康組和不同嚴(yán)重程度患者瘦素、IL?18、NLRP3對(duì)比Tab.2 Comparison of leptin，IL?18，NLRP3 in healthy groups and patients with different severity ±s

注：與健康組比，*P＜0.05；與輕型比，△P＜0.05；與中型比，▲P＜0.05

組別健康組疾病組輕型中型重型F值P值例數(shù)50 62 44 26瘦素（ng/mL）4.12±0.80 10.09±2.12*28.62±5.37*△48.44±7.21*△▲887.058<0.001 IL-18（ng/L）80.05±9.31 167.19±23.02*242.42±32.18*△361.08±55.82*△▲566.643<0.001 NLRP3 mRNA相對(duì)表達(dá)量1.01±0.12 2.35±0.26*3.01±0.45*△4.28±0.59*△▲546.861<0.001

表3 不同嚴(yán)重程度患者瘦素、IL?18、NLRP3對(duì)比Tab.3 Comparison of leptin，IL?18，NLRP3 in patients with different severity ±s

表3 不同嚴(yán)重程度患者瘦素、IL?18、NLRP3對(duì)比Tab.3 Comparison of leptin，IL?18，NLRP3 in patients with different severity ±s

組別預(yù)后良好組預(yù)后不良組t值P值例數(shù)90 42瘦素（ng/mL）15.70±2.06 46.12±6.95 38.222<0.001 IL?18（ng/L）202.18±25.44 291.05±30.18 17.598<0.001 NLRP3 mRNA相對(duì)表達(dá)量2.71±0.30 3.46±0.42 11.721<0.001

2.5 瘦素、IL?18、NLRP3對(duì)預(yù)后不良的預(yù)測(cè)效果分析 ROC結(jié)果顯示，瘦素、IL?18、NLRP3對(duì)預(yù)后不良預(yù)測(cè)最佳截?cái)帱c(diǎn)分別為41.7、265.4 ng/L、3.3，AUC分別為0.755、0.801、0.852（表6、圖1）。

圖1 瘦素、IL?18、NLRP3預(yù)測(cè)預(yù)后不良ROC曲線Fig.1 ROC curves of poor prognosis predicted by leptin，IL?18，and NLRP3

表4 預(yù)后良好組和預(yù)后不良組可能影響因素的差異對(duì)比Tab.4 Comparison of possible influencing factors between good prognosis group and poor prognosis group 例（%）

表5 Logistic回歸分析法分析導(dǎo)致預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素Tab.5 Analysis of risk factors leading to poor prognosis by Logistic regression analysis

表6 瘦素、IL?18、NLRP3對(duì)預(yù)后不良的預(yù)測(cè)效果分析Tab.6 Prediction effect analysis of leptin，IL?18，NLRP3 on poor prognosis

3 討論

HICH是由高血壓引發(fā)的源于腦實(shí)質(zhì)的顱內(nèi)出血，具有起病急、病情復(fù)雜、進(jìn)展迅速等特點(diǎn)，在給予及時(shí)有效的治療措施的同時(shí)，尋找可靠的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)對(duì)預(yù)后做出客觀和準(zhǔn)確的評(píng)估，對(duì)患者治療策略的調(diào)整有重要意義。高血壓和腦動(dòng)脈粥樣硬化是導(dǎo)致HICH首要原因［10-11］，血壓驟升導(dǎo)致腦動(dòng)脈破裂，隨之血腫形成及血腫占位效應(yīng)可直接和繼發(fā)性損傷腦組織，一方面，腦出血后補(bǔ)體、凝血酶等血腫成分直接損傷腦細(xì)胞；另一方面血腫占位效應(yīng)可激活周圍血管系統(tǒng)的防御反應(yīng)及全身系統(tǒng)炎癥反應(yīng)，以及時(shí)清除細(xì)胞碎片及凋亡細(xì)胞。繼發(fā)性腦損傷是影響HICH預(yù)后的關(guān)鍵，而炎癥反應(yīng)是繼發(fā)損傷的重要部分［12-13］。因此，本研究對(duì)既往收治的HICH患者的臨床資料進(jìn)行回顧，通過分析瘦素、IL?18、NLRP3在外周血中的表達(dá)情況，重點(diǎn)分析其與預(yù)后的關(guān)系，探討其在HICH預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值。

本研究發(fā)現(xiàn)，不同嚴(yán)重程度疾病組外周血瘦素、IL?18、NLRP3均高于健康組，且重型組大于輕型和中型組，中型組大于輕型組，提示外周血瘦素、IL?18、NLRP3與HICH患者病情嚴(yán)重程度關(guān)系密切。瘦素主要由脂肪細(xì)胞分泌，研究表明，中樞系統(tǒng)中廣泛存在瘦素受體，HICH后機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)，脂肪細(xì)胞大量合成和釋放，導(dǎo)致外周血中瘦素水平升高，瘦素可通過血腦屏障與瘦素受體結(jié)合，通過下丘腦-神經(jīng)肽通過參與病情進(jìn)展［14］。另有研究證實(shí)［15］，瘦素是導(dǎo)致HICH發(fā)病的危險(xiǎn)因素，主要通過激活交感神經(jīng)系統(tǒng)、促進(jìn)脂肪細(xì)胞血管緊張素原表達(dá)、與血管內(nèi)皮細(xì)胞中瘦素受體結(jié)合改變血管張力等途徑引起血壓升高，參與HICH發(fā)生、發(fā)展。本研究中HICH患者外周血瘦素水平隨病情嚴(yán)重程度加重而升高，提示瘦素水平與HICH病情嚴(yán)重程度有關(guān)。NLRP3是廣泛分布于細(xì)胞質(zhì)中的感受器蛋白，當(dāng)識(shí)別危險(xiǎn)信號(hào)時(shí)，其蛋白結(jié)構(gòu)改變，與銜接蛋白（ASC）、效應(yīng)蛋白半胱氨酸天冬氨酸酶1前體（Pro?caspase1）組成蛋白復(fù)合物，即炎癥小體，激活的炎癥小體通過促進(jìn)IL?18合成和分泌，誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡［16-17］。高血壓和腦動(dòng)脈粥樣硬化導(dǎo)致的腦出血發(fā)生后，NLRP3炎癥小體激活，內(nèi)皮細(xì)胞、腦膠質(zhì)細(xì)胞合成和分泌大量IL?18，IL?18可破壞血腦屏障進(jìn)入外周血，加速細(xì)胞程序性死亡過程，病情加重。

此外，本研究中，預(yù)后不良組年齡＞60歲、重型神經(jīng)功能缺損、破入腦室、出血量＞30 mL、入院GCS評(píng)分≤8分患者構(gòu)成比、瘦素、IL?18、NLRP3均高于預(yù)后良好組，且經(jīng)Logistic回歸分析證實(shí)均是導(dǎo)致預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素，提示瘦素、IL?18、NL?RP3是HICH預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素。瘦素最初常作為調(diào)節(jié)能量消耗的激素，與肥胖關(guān)系密切［18-19］，隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)瘦素參與多系統(tǒng)功能調(diào)節(jié)。BOUZIANA等研究發(fā)現(xiàn)［20］，腦卒中患者外周血瘦素水平異常較高，且與病灶大小、GCS評(píng)分關(guān)系密切，本研究采用回歸分析證實(shí)瘦素是HICH預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素，應(yīng)用ROC曲線判定預(yù)后不良瘦素最佳截?cái)帱c(diǎn)為41.7 ng/mL，并在預(yù)測(cè)6個(gè)月預(yù)后時(shí)呈現(xiàn)出較高的靈敏度和特異度，提示瘦素在HICH預(yù)后評(píng)估中較高的應(yīng)用價(jià)值。HICH后繼發(fā)性神經(jīng)炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致腦細(xì)胞損傷，增加腦水腫等并發(fā)癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。研究表明［21］，HICH后早期腦血腫周圍組織內(nèi)NLRP3信號(hào)通路處于激活狀態(tài)，促進(jìn)其下游IL?18的合成和釋放，且通過參與補(bǔ)體誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，加重腦損傷，增加遲發(fā)性腦損傷風(fēng)險(xiǎn)，不利于預(yù)后神經(jīng)功能恢復(fù)。本研究ROC曲線辨別外周血IL?18、NLRP3最佳截?cái)帱c(diǎn)分別為265.4 ng/L、3.3，HICH預(yù)后不良AUC分別為0.801、0.852，說明IL?18、NLRP3在HICH預(yù)后評(píng)估中有重要應(yīng)用價(jià)值，可作為HICH預(yù)后評(píng)價(jià)的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。

綜上所述，外周血瘦素、IL?18、NLRP3與HICH患者病情嚴(yán)重程度有關(guān)，有助于早期判斷HICH患者的預(yù)后，在預(yù)后評(píng)估中有重要應(yīng)用價(jià)值，提示臨床中應(yīng)加強(qiáng)HICH患者外周血瘦素、IL?18、NLRP3水平的檢測(cè)，并及時(shí)實(shí)施有效治療策略，以期最大限度改善患者預(yù)后。本研究不足之處在于納入樣本量較少，且由于研究成本的局限性，僅開展了單中心研究，在進(jìn)一步的研究中應(yīng)擴(kuò)大樣本量并開展多中心、前瞻性研究，為本研究結(jié)論提供更充分的數(shù)據(jù)支持。