王振杰 谷詩濃 劉毓佳 周凡萍 黃賽娥

1福建中醫(yī)藥大學(xué)（福州350122）；2福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院（福州350003）；3福建省康復(fù)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（福州350003）；4武漢科技大學(xué)附屬孝感市中心醫(yī)院（武漢432000）

腦卒中后認(rèn)知障礙（post?stroke cognitive im?pairment，PSCI）是指急性腦血管病導(dǎo)致的各種類型和不同程度的認(rèn)知功能減退，是血管性認(rèn)知障礙的重要組成部分［1-2］。microRNAs（miRNAs）是一種單鏈非編碼含有20～24個核苷酸的小分子RNA，通過與信使RNA（mRNA）的3‘UTR或5′UTR結(jié)合，促進(jìn)或抑制mRNAs的翻譯，從而達(dá)到對機(jī)體功能的調(diào)節(jié)［3-4］。研究［5-7］表明，miR?191?5p和miR?20a?5p都與改善腦卒中后缺氧狀態(tài)下神經(jīng)元細(xì)胞死亡，促進(jìn)神經(jīng)元突觸可塑性形成，緩解認(rèn)知障礙相關(guān)。因此，血清miR?191?5p和miR?20a?5p具備成為診斷PSCI的生物標(biāo)記物的潛能。綜上所述，本研究主要目的是探討miR?191?5p聯(lián)合miR?20a?5p對于PSCI患者的診斷價(jià)值，分析臨床意義。

1 資料與方法

1.1 受試者及納排標(biāo)準(zhǔn) 2017年10月至2018年4月從福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院招募了72例卒中患者和37例年齡匹配對照（age?matched control，AMC）受試者。卒中患者和對照者的年齡，性別和受教育程度相匹配。所有受試者年齡在45歲至75歲之間，本研究已經(jīng)通過福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)，所有研究對象已簽署知情同意書。

PSCI入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）受試者有神經(jīng)影像學(xué)（CT或MRI）提供的腦血管疾病證據(jù)，且CT或MRI提示病變部位在基底節(jié)區(qū)，無廣泛性病灶；（2）蒙特利爾認(rèn)知評估量表（montreal cognitive assessment，MoCA）評分<26（對于受過教育不超過12年的人的評分進(jìn)行1分校正）；（3）所述卒中是患者首次發(fā)生并且在本研究前1年內(nèi)發(fā)生；（4）患者生命體征穩(wěn)定。腦卒中后認(rèn)知正常（post?stroke cognitive normal，PSCN）組納入標(biāo)準(zhǔn)與PSCI組標(biāo)準(zhǔn)相同，但MoCA評分≥26。AMC組納入標(biāo)準(zhǔn)包括：（1）受試者主訴沒有認(rèn)知功能障礙。（2）MoCA評分≥26 PSCI組排除標(biāo)準(zhǔn)是：（1）存在其他可引起認(rèn)知障礙的疾病，如阿爾茨海默病、額顳葉癡呆等腦退行性疾病者；腦腫瘤、腦外傷或腦寄生蟲病及其他原發(fā)性認(rèn)知功能障礙性疾?。唬?）醫(yī)生或家屬確認(rèn)患者卒中前長期表現(xiàn)出認(rèn)知功能障礙或在卒中前使用過與認(rèn)知功能障礙有關(guān)的藥物；（3）影響認(rèn)知檢查的嚴(yán)重言語，視力，聽力障礙或精神障礙的癥狀；（4）貝克抑郁量表（beck depression inventory BDI）得分>13；（5）酒精或藥物濫用；（6）存在以下任何一種情況：心力衰竭，呼吸衰竭或其他器官衰竭；（7）孕婦和哺乳期婦女。PSCN組排除標(biāo)準(zhǔn)與PSCI組相同。AMC組排除標(biāo)準(zhǔn)包括6個條件：（1）阿爾茨海默癥、額顳葉癡呆、腦血管疾病和其他可引起認(rèn)知障礙的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾??；（2）另外5個條件與PSCI組的最后5個條件一致。

1.2 血清樣本 在受試者住院后3 d內(nèi)，在每個受試者的無添加劑的真空血液管中收集血液樣品（5 mL）。將試管垂直保持30 min以形成凝塊，之后在室溫（15～25℃）下以3 000 r/min離心10 min，然后在4℃下以13 000 r/min離心10 min。收集處理后的血清并儲存在-80℃直至進(jìn)一步分析。

1.3 RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄 使用miRNA純化試劑盒（北京艾德萊公司，RN4601），按照其中的使用說明書來分離提取miRNA。使用NanoDrop2000c分光光度計(jì)（德國，Thermo）檢測RNA濃度和純度。RNA濃度范圍為20～102 ng/L。通過測量260～280 nm處的吸光度來檢測RNA純度，其范圍為1.81～2.01。使用miRNAcDNA試劑盒（cwbiotech，CW2141）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。內(nèi)參選擇miR?16（序列：TAG CAG CAC GTA AAT ATT GGC GT）。

1.4 實(shí)時熒光定量PCR 使用實(shí)時熒光定量（qRT?PCR）檢測miRNAs，使用ChamQTM SYBR qPCR Master Mix（MR101?02）（南京諾唯贊生物科技有限公司），把cDNA濃度按照1∶3稀釋。具體操作按照相應(yīng)的使用說明書。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件包（IBM）進(jìn)行所有統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)由均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。3組間比較，符合正態(tài)分布使用單因素方差分析，不符合正態(tài)分布使用Kruskal?Wallis H（K）檢驗(yàn)。兩組間比較符合正態(tài)分布使用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分析使用Mann?WhitneyU檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料由χ2檢驗(yàn)。通過Spearman進(jìn)行相關(guān)分析以估計(jì)miR?191?5p和miR?20a?5p水平分別與MoCA評分之間的相關(guān)性，得到相關(guān)系數(shù)r。一般認(rèn)為，r>0是正相關(guān)，r<0是負(fù)相關(guān)，r=0是非線性相關(guān)（零相關(guān)）。如果|r|≥0.7表明兩者高度相關(guān)；如果曲線0.7>|r|≥0.4表明兩者中度相關(guān)；如果0.4>|r|≥0.2表明兩者低度相關(guān)［8］。產(chǎn)生ROC曲線，并分析曲線下面積（area under curve，AUC）以評估m(xù)iR?191?5p和miR?20a?5p的診斷性能。根據(jù)ROC曲線獲得最佳診斷值（Cut?off point），并計(jì)算所有4個計(jì)數(shù)，即真陽性數(shù)量（true positive，TP），假陽性數(shù)量（false positive，F(xiàn)P），真陰性數(shù)量（true negative，TN）和假陰性數(shù)量（false negative，F(xiàn)N）。筆者計(jì)算靈敏度，特異性如下：靈敏度=TP/（TP+FN）；特異度=TN/（TN+FP）。一般認(rèn)為，AUC在0.5～1.0的區(qū)間內(nèi)，AUC位于0.5～0.7之間，具有較低的診斷價(jià)值；AUC在0.7～0.9之間，具有中等的診斷價(jià)值；AUC在0.9～1.0之間，具有較高的診斷價(jià)值［8］。

2 結(jié)果

2.1 患者特點(diǎn) 顯示了miR?191?5p和miR?20a?5p的人口學(xué)信息、生化數(shù)據(jù)和CT值；患者的一般資料在AMC、PSCN和PSCI之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。以miR?16為內(nèi)對照，各組間miR?16 Ct值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.724，表1、2）。

2.2 血清miRNA相對表達(dá)水平 miR?191?5p和miR?20a?5p表達(dá)水平在3組中顯著不同（P<0.05）。（1）miR?191?5p在PSCI組表達(dá)最高，然后是PSCN組和AMC組，在PSCI和PSCN組（P<0.05）與PSCI和AMC組（P<0.05）之間的成對比較中檢測到PSCI組的miR?191?5p表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與其他兩組相比，PSCI患者血清中miR?191?5p的相對表達(dá)顯著上調(diào)。（2）miR?20a?5p在PSCI組表達(dá)最高，然后是AMC組和PSCN組，在PSCI和PSCN組與PSCI和AMC組之間的成對比較中檢測到PSCI組的miR?20a?5p表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與其他兩組相比，PSCI患者血清中miR?20a?5p的相對表達(dá)顯著上調(diào)（表2）。

表1 PSCI、PSCN和AMC組人口學(xué)數(shù)據(jù)的分布Tab.1 Distribution of demographic data in PSCI,PSCN and AMC groups ±s

表1 PSCI、PSCN和AMC組人口學(xué)數(shù)據(jù)的分布Tab.1 Distribution of demographic data in PSCI,PSCN and AMC groups ±s

注：a，計(jì)量資料且有一組不符合正態(tài)分布，3組間比較采用Kruskal?Wallis H（K）檢驗(yàn)；b，計(jì)量資料且均符合正態(tài)分布，方差齊，兩組間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；c，計(jì)量資料且有一組不符合正態(tài)分布，兩組間采用Mann?Whitney U檢驗(yàn)；d，計(jì)數(shù)資料，χ2檢驗(yàn)

特征年齡（歲）a受教育水平（年）a病程（d）b MOCA評分c性別（例）d男 女腦卒中類型（例）d腦梗死腦出血高血壓病史（例）dd糖尿病史（例）dd高脂血癥史（例）dd心臟疾病史（例）dd吸煙史（例）dd PSCI組（n=36）64.31±1.228 6.67±0.352 50.53±0.762 12.92±0.814 21 15 15 21 22 17 16 9 18 PSCN組（n=36）65.00±1.247 6.56±0.489 50.94±0.656 26.56±0.151 21 15 16 20 23 17 17 9 17 AMC組（n=37）62.27±0.968 6.65±0.345 28.30±0.133 17 20 19 14 19 10 17 P值0.382 0.943 0.560<0.01 0.470 0.812 0.519 0.646 0.838 0.974 0.939

表2 AMC、PSCN和PSCI組兩種血清相對表達(dá)量及miR?16Ct值Tab.2 Relative expression and miR-16Ct value of two kinds of serum in AMC,PSCN and PSCI groups ±s

表2 AMC、PSCN和PSCI組兩種血清相對表達(dá)量及miR?16Ct值Tab.2 Relative expression and miR-16Ct value of two kinds of serum in AMC,PSCN and PSCI groups ±s

注：對數(shù)值進(jìn)行對數(shù)運(yùn)算log102?ΔCt進(jìn)而轉(zhuǎn)變成規(guī)范的Ct值，miR?16用作內(nèi)部參照。a，計(jì)量資料且至少有一個不符合正態(tài)分布，3組比較用Kruskal?Wallis H（K）檢驗(yàn)；b，PSCI組和AMC組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；c，PSCI組和PSCN組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；d，AMC組和PSCN組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）

miR?16Ct值a miR?191?5pa miR?20a?5pa AMC（n=37）29.788±0.470-0.577±0.672 0.331±0.061 PSCN（n=36）29.379±0.454-0.577±0.094 0.166±0.103 PSCI（n=36）29.517±0.390-0.250±0.098bcd 0.743±0.076bcd P值0.724 0.047<0.001

2.3 認(rèn)知功能與miRNAs水平相關(guān)性 筆者分析了MoCA評分與血清miR?191?5p和miR?20a?5p水平之間的相關(guān)性。（1）PSCI組和PSCN組中Spearman相關(guān)分析結(jié)果表明miR?191?5p的相對表達(dá)與MoCA評分之間呈中等強(qiáng)度負(fù)相關(guān)（r=-0.488，P<0.01）；（2）PSCI組和PSCN組中Spearman相關(guān)分析結(jié)果表明miR?20a?5p的相對表達(dá)與MoCA評分之間呈中等強(qiáng)度負(fù)相關(guān)（r=-0.624，P<0.01）。見表3。

表3 MoCA得分與miRNAs相對表達(dá)量間的相關(guān)分析Tab.3 Correlation analysis between MoCA score and relative expression of miRNAs

2.4 miRNAs篩選PSCI的診斷性能 通過ROC分析來比較血清miR?191?5p和miR?20a?5p以及兩者聯(lián)合對于PSCI的診斷能力。miR?191?5p聯(lián)合miR?20a?5p的AUC（95%CI），靈敏度和特異度均明顯高于miR?191?5p或miR?20a?5p單獨(dú)的AUC，靈敏度和特異度（P<0.05）。見表4、圖1。

表4 miR?191?5p、miR?20a?5p以及兩者聯(lián)合的ROC曲線分析Tab.4 ROC curve analysis of miR?191?5p,miR?20a?5p,and their combination

圖1 ROC曲線Fig.1 ROC curve

3 討論

腦卒中有著極大的危害，我國腦卒中發(fā)病率持續(xù)上升，平均每年增長8.3%，發(fā)病率為403.09/10萬［9］，PSCI的的發(fā)病率達(dá)到80.97%［10］。PSCI對于患者和家庭造成了極大的困難，因此對于PSCI客觀有效診斷具有極其重要的意義。MoCA是通過循證醫(yī)學(xué)驗(yàn)證的的認(rèn)知障礙篩查，已獲得國際專家的認(rèn)可［11］，該篩選量表由NASREDDINE等［12］改進(jìn)和建立。與簡易精神狀態(tài)檢查（mini?mental state examination，MMSE）相比，MoCA更加重視執(zhí)行功能和注意力的評估，并且敏感度更高，因此是一種重要的臨床認(rèn)知功能工具［12］。然而，MoCA結(jié)果受性別，年齡和教育水平的影響，也受到患者主觀因素的影響。目前對于PSCI缺乏比較客觀的診斷指標(biāo)。因此本課題針對腦卒中患者，探究了聯(lián)合血清miR?191?5p和miR?20a?5p水平對PSCI診斷的價(jià)值，為臨床實(shí)踐提供了客觀有效的參考指標(biāo)。

有研究［13-14］顯示，miRNA能夠在血循環(huán)中穩(wěn)定存在，且其表達(dá)能夠隨著機(jī)體病理生理的改變而發(fā)生上調(diào)或下調(diào)。目前研究［14-15］表明miRNA參與調(diào)控了腦高級功能（如學(xué)習(xí)，記憶和情緒等）。而先前的研究也報(bào)道了miRNA的表達(dá)與神經(jīng)元突觸可塑性以及認(rèn)知相關(guān)的疾病有關(guān)［16-17］，其主要是通過提高基因表達(dá)或者減少蛋白的翻譯進(jìn)而調(diào)控神經(jīng)元突觸的可塑性［18］。LILY等［19］研究發(fā)現(xiàn)，miR?191?5p過度表達(dá)能夠抑制腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）的水平，進(jìn)而抑制突觸可塑性。BEVERIDGE等［20］研究表明miR?20a?5p上調(diào)可降低抗凋亡蛋白B細(xì)胞淋巴瘤2（BCL 2）等促進(jìn)神經(jīng)元分化因子的表達(dá)，提示miR?20a?5p是腦發(fā)育和神經(jīng)元分化過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，對于神經(jīng)突觸可塑性有著重要作用。miR?191?5p和miR?20a?5p不僅跟神經(jīng)元細(xì)胞突觸可塑性有關(guān)，而且與認(rèn)知學(xué)習(xí)記憶認(rèn)知有關(guān)。DU等［5］研究顯示，miR?191?5p過度表達(dá)會促進(jìn)細(xì)胞死亡，抑制miR?191?5p可以降低中腦動脈閉塞大鼠的梗死面積，并且能夠緩解因缺血缺氧導(dǎo)致的細(xì)胞死亡，從而改善認(rèn)知功能障礙。這與本研究相一致，PSCI患者血清中的miR?191?5p含量明顯高于PSCN患者。miR?191?5p的下調(diào)不僅能夠緩解缺血缺氧導(dǎo)致的神經(jīng)元細(xì)胞死亡，而且HU等［6］在研究中發(fā)現(xiàn)miR?191?5p的下調(diào)與維持小鼠海馬結(jié)構(gòu)重建密切相關(guān)，有利于改善記憶和認(rèn)知障礙。此外，POITZ等［7］實(shí)驗(yàn)表明，miR?20a?5p通過調(diào)節(jié)缺氧誘導(dǎo)因子1a（hif?1a）的表達(dá)，減少卒中后缺氧狀態(tài)下神經(jīng)細(xì)胞死亡。綜上所述，miR?20a?5p和miR?191?5p的下調(diào)似乎都與緩解缺血缺氧狀態(tài)下的神經(jīng)元細(xì)胞死亡相關(guān)，從而改善認(rèn)知障礙。不僅如此，MYRRHE等［21］發(fā)現(xiàn)miR?191?5p和miR?20a?5p均與海馬神經(jīng)元發(fā)育和神經(jīng)元活動變化有關(guān)，表明兩者可能參與調(diào)控神經(jīng)元突觸可塑性形成，甚至腦高級活動功能。因此，miR?191?5p和miR?20a?5p可能都與緩解缺血缺氧狀態(tài)下神經(jīng)細(xì)胞死亡，促進(jìn)神經(jīng)元突觸可塑性形成以及記憶等腦高級活動功能有著密切的聯(lián)系，但是目前的研究多集中于基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，臨床研究較少，而本研究觀察了兩者聯(lián)合對于PSCI的診斷價(jià)值，其研究是具有一定臨床意義。

本研究結(jié)果顯示在PSCI組中，miR?191?5p和miR?20a?5p的表達(dá)水平均高于PSCN組和AMC組，進(jìn)一步通過ROC曲線分析表明miR?191?5p聯(lián)合miR?20a?5p對于診斷PSCI的AUC、靈敏度和特異度均高于單一診斷，提示miR?191?5p和miR?20a?5p聯(lián)合診斷的可能更具診斷價(jià)值，有望成為PSCI早期鑒別診斷的血清生物學(xué)標(biāo)記物。