梁誠誠 李文桂

重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院傳染病寄生蟲病研究所（重慶400016）

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，Pa）是 一種常見的Gram陰性致病菌，具有基因組多樣性和多環(huán)境持續(xù)存在的特點，可引起廣泛的院內感染，如呼吸機相關性肺炎、敗血癥、尿路感染和器械相關性感染［1-3］。Pa還影響宿主的損傷修復機制，使細菌更易定植和更難清除，從而發(fā)展為遷延不愈的慢性感染，增加患者的死亡風險和經濟負擔。由于Pa生物膜形成、β-內酰胺酶產生和抗生素濫用等內在和獲得性的抗性機制［4-5］，使得耐藥菌株增多，世界衛(wèi)生組織已將其歸類為耐藥的優(yōu)先病原體，抗菌治療愈發(fā)艱難［6-7］。單一的抗生素化療往往不能解決問題，疫苗研制是有效的替代手段之一。

目前Pa疫苗的種類繁多，如外膜蛋白疫苗、脂多糖疫苗、鞭毛疫苗和菌毛疫苗等，但這些疫苗仍存在安全性或有效性等問題，因此，有必要研究新型疫苗［8］。外膜蛋白F-I（outer membrane protein F?I，OprF?I）是一種具有開發(fā)前景的疫苗分子［9］。RELLO等［10］將重組蛋白OprF?I免疫機械通氣的ICU患者，在初免后14 d發(fā)現(xiàn)血清IgG抗體升高，侵襲性感染率減低，提示該蛋白具有良好的免疫原性。兩歧雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidum，Bb）具有益生菌和穩(wěn)定表達外源抗原的作用，使其成為一種新型疫苗載體［11］。本研究在成功構建重組Bb（pGEX?OprF?I）疫苗的基礎上［12］，將其免疫小鼠，觀察其誘導的保護力及體液免疫應答，從而為研究其保護性免疫機制提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料 銅綠假單胞菌重組Bb（pGEX?OprF?I）疫苗由重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院傳染病寄生蟲病研究構建及保存，見文獻［12］；21只6～8周齡清潔級雌性BALB/c小鼠購自重慶醫(yī)科大學實驗動物中心。辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記羊抗鼠IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgE和IgA購自美國Southern Biotech公司；Pa抗原及感染的鼠血清由本研究所保存；LB（Luria?Ber?tani，LB）培養(yǎng)基和MRS（Man?Rogosa?Sharpe，MRS）固體和液體培養(yǎng)基由本研究所制備。酶標儀購自Scientific Thermo公司。本研究通過重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準，整個研究過程符合倫理學要求（倫理批準號：2018015）。

1.2 動物免疫及攻擊方案 將21只BALB/c小鼠隨機分為3組：疫苗組［rBb（pGEX?OprF?I）］、空載體對照組［rBb（pGEX?1λT）］和Bb對照組，每組7只，均口采用服灌胃免疫途徑。將5×108CFU疫苗重懸于100μL的MRS培養(yǎng)液，每日接種1次，每周連續(xù)3 d，共3周。在初次接種后4周，將5×107CFU PA01株重懸于10μL的LB培養(yǎng)液，進行1次性滴鼻攻擊。

1.3 肺細菌負荷計數(shù) 在攻擊感染后2周處死小鼠，無菌取1 g肺組織，勻漿稀釋涂皿，37℃培養(yǎng)48 h后計數(shù)肺細菌菌落。

1.4 常規(guī)ELISA檢測小鼠血清IgG及其亞類、IgE和IgA抗體水平 分別在接種前和初免后4周采集小鼠尾靜脈血，PA01株攻擊后2周摘除眼球取血，分離血清后-20℃凍存待查。常規(guī)ELISA法檢測IgG及其亞類、IgE和IgA抗體。以1μg/孔Pa抗原包被96孔酶標板（4℃過夜），封閉2 h后，先后加入小鼠血清（1∶100稀釋）和HRP標記的羊抗鼠IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgE和IgA（1∶5 000稀釋），反應結束后用酶標儀檢測血清A492 nm值。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 24.0軟件進行分析，實驗結果用均數(shù)±標準差表示，肺細菌計數(shù)用（Ig CFU/g）表示，多組間比較用單因素方差分析和LSD檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 肺細菌的菌落計數(shù) 疫苗免疫及PA01株攻擊后，小鼠的肺細菌菌落計數(shù)結果顯示疫苗組、空載體對照組和Bb對照組的菌落數(shù)分別為（7.43±0.03）Ig CFU/g、（8.86±0.05）Ig CFU/g和（8.87±0.05）Ig CFU/g。疫苗組的肺細菌菌落數(shù)明顯低于其余兩個對照組（F=2 476.634，P＜0.001），空載體對照組和Bb對照組間差異無統(tǒng)計學意義（t=0.016，P=0.878，表1）。

表1 疫苗免疫及PA01株攻擊后小鼠的肺細菌菌落數(shù)Tab.1 The number of bacteria colonies in the lung of mice immunized with rBb（pGEX?OprF?I）vaccine and challenged with PA01 strain ±s

表1 疫苗免疫及PA01株攻擊后小鼠的肺細菌菌落數(shù)Tab.1 The number of bacteria colonies in the lung of mice immunized with rBb（pGEX?OprF?I）vaccine and challenged with PA01 strain ±s

注：與空載體和Bb對照組比較，*P<0.01

組別疫苗組空載體對照組Bb對照組例數(shù)7 7 7肺細菌的菌落數(shù)（Ig CFU/g）7.43±0.03*8.86±0.05 8.87±0.05

2.2 免疫鼠血清IgG及其亞類、IgE和IgA的抗體水平 用常規(guī)ELISA法檢測小鼠免疫前、初免后4周和攻擊后2周的血清IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgE和IgA水平變化情況。結果如圖1（A、B、C、D、E）所示，同一時間點的不同組間比較，接種前的血清IgG及其亞類水平較低，且在3組間差異無統(tǒng)計學意義（IgG：F=0.310，P=0.738；IgG1：F=0.942，P=0.408；IgG2a：F=0.716，P=0.502；IgG2b：F=0.398，P=0.677；IgG3：F=0.112，P=0.895）；初免后4周和攻擊后2周的疫苗組血清IgG及其亞類水平較空載體對照組和Bb對照組均明顯增高（初免后4周和攻擊后2周的F值分別為：IgG：F1=100.551，F(xiàn)2=57.536；IgG1：F1=45.063，F(xiàn)2=51.186；IgG2a：F1=91.861，F(xiàn)2=122.183；IgG2b：F1=233.236，F(xiàn)2=306.465；IgG3：F1=97.414，F(xiàn)2=293.089，均P＜0.001）；不同時間點的同組間比較，與免疫前相比，初免后4周的疫苗組血清IgG及其亞類均顯著升高，在攻擊后2周達更高水平，差異有統(tǒng)計學意義（IgG：F=306.807；IgG1：F=99.553；IgG2a：F=206.512；IgG2b：F=1 585.056；IgG3：F=468.935，均P＜0.001）。而IgE和IgA在3組的所有時間點均未檢測出。

圖1 疫苗免疫及PA01株攻擊后小鼠血清IgG及其亞類抗體的水平變化Fig.1 Observation of sera IgG and IgG isotype distribution in mice immunied with rBb（pGEX?OprF?I）vaccine and challenged with PA01 strain

3 討論

檢測肺細菌負荷是評價疫苗保護力的關鍵指標。既往研究［15-16］表明，銅綠假單胞菌OprF或OprI蛋白疫苗可有效降低免疫小鼠的肺細菌負荷，增強清除Pa感染的能力。SAHA等［13］發(fā)現(xiàn)重組質粒pGACAG?OprF?I肌肉注射免疫的小鼠可抵抗銅綠假單胞菌D4株的鼻內攻擊，其肺組織和血清中的肺細菌菌落數(shù)明顯下降，存活率提高，顯示出一定的保護作用。本研究顯示rBb疫苗灌胃免疫及PA01株攻擊小鼠后，肺細菌菌落數(shù)明顯降低，與上述結果相似，表明該疫苗可誘導小鼠產生較好的保護力。

體液免疫是機體抵抗病原體的重要機制之一，抗體檢測是評價其體液免疫的主要指標。高水平的IgG抗體在急性肺部感染大鼠模型中顯示出較好的抗Pa感染的作用。LEE等［14］發(fā)現(xiàn)抗銅綠假單胞菌外膜蛋白IgG對其各型菌株具有交叉保護作用，并能激活吞噬細胞發(fā)揮調理吞噬作用。ZHANG等［15］將重組沙門氏菌的OprF?I融合蛋白疫苗以不同途徑接種小鼠，初免后6周免疫小鼠血清和肺組織中的IgG抗體均升高，但口服灌胃組的抗體水平明顯低于其他免疫組。本研究將rBb疫苗灌胃免疫及PA01株攻擊小鼠后，初免后4周的免疫鼠血清IgG抗體較接種前和相同時間點的對照組明顯升高，顯著高于重組沙門氏菌誘導的抗體水平，推測Bb是一種良好的疫苗載體，能將目的蛋白有效傳遞到腸道免疫系統(tǒng)，在抗原提呈細胞和Th細胞輔助下刺激漿細胞合成和分泌抗體，通過再循環(huán)途徑使血清IgG升高，激發(fā)更強烈的體液免疫應答，且口服灌胃是該載體疫苗較好的免疫途徑。IgG能與Pa的抗原分子結合發(fā)揮中和作用；與中性粒細胞和巨噬細胞上的Fc受體結合，促進其吞噬病原體；通過經典途徑激活補體，C3b和C4b等調理素可固定細菌，輔助IgG的調理作用；與NK細胞等殺傷細胞表面的Fc受體結合，活化的NK細胞可釋放穿孔素、絲氨酸蛋白酶等細胞毒物質殺傷Pa。

IgG亞類在保護性免疫機制中具有重要作用，其中IgG2a和IgG1是Th1和Th2型免疫應答的標志性抗體。在銅綠假單胞菌慢性感染的早期，IgG亞類抗體水平顯著增加。WEIMER等［16］將重組OprF?I融合蛋白肌肉注射免疫小鼠，血清抗體檢測顯示免疫小鼠可誘導高水平的IgG2a和IgG1，類似結果也出現(xiàn)在過往文獻［20］中。本研究顯示銅綠假單胞菌重組Bb（pGEX?OprF?I）疫苗免疫的小鼠在初免后4周血清IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3明顯升高，表明其可能參與疫苗誘導的保護性免疫應答，該疫苗表達的抗原可刺激CD4+T細胞增殖分化為輔助性Th細胞，Th1和Th2細胞分泌多種細胞因子，從而促進IgG亞類的合成和分泌。與上述研究比較，由于Bb存在佐劑效應，Bb介導的融合蛋白疫苗可較單純融合蛋白疫苗引起更為高效的保護性體液免疫應答。這些IgG1、IgG2a、IgG2b或IgG3亞類可激活補體、結合巨噬細胞和NK細胞表面的Fc受體，發(fā)揮調理和抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用，從而殺傷Pa。

記憶性B細胞可給機體提供長期且穩(wěn)定的體液免疫記憶，與疫苗的免疫效果密切相關［17］。BEHROUZ等［18］將二價鞭毛蛋白滴鼻免疫小鼠，PAK或PA01株攻擊后發(fā)現(xiàn)小鼠血清IgG及其亞類明顯升高，抗Pa感染的能力增強。本研究發(fā)現(xiàn)rBb疫苗免疫及PA01株攻擊后2周的免疫小鼠血清IgG及其亞類較初免后4周顯著升高，表明該疫苗可刺激宿主產生較好的免疫記憶，當機體再次接觸相同抗原時，記憶性B細胞可活化增殖并分化為漿細胞，使抗體滴度迅速升高，產生更強、更持久的體液免疫應答。

綜上，OprF?I融合蛋白是具有良好免疫原性的疫苗分子，以Bb為載體介導的OprF?I融合蛋白疫苗顯示出安全無毒、接種方便和產生較強保護力及體液免疫應答的優(yōu)點，為Pa疫苗的研制提供新的思路。本研究的不足之處在于只觀察了疫苗的免疫力和抗體水平，疫苗對小鼠的免疫保護效果還有待進一步觀察，如實驗動物的存活時間、組織切片以及體內細胞因子變化等，后續(xù)也將對疫苗的保護性免疫機制進行深入探討，此外還將探索疫苗接種的最佳劑量、途徑以及增強疫苗免疫效果的佐劑分子等諸多問題。