李天博 高磊 王江寧

首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院矯形外科（北京100000）

我國是肝癌高發(fā)病的國家，由于其惡性程度高，其病死率在世界排首位［1-4］?；颊叱醮卧\斷時已進入腫瘤進展期，進展期肝細胞癌常發(fā)生骨轉移，且發(fā)生率逐年上升，給肝細胞癌患者造成劇烈骨骼疼痛和病理性骨損傷［5］。脊柱是骨腫瘤好發(fā)部位，調查顯示，脊柱骨腫瘤占全身骨腫瘤的7%左右，并且50%以上患者為轉移瘤［6-7］。良性脊柱骨腫瘤患者其臨床癥狀往往輕微，疾病進展緩慢，病程較長，發(fā)病人群多集中于青少年［8］；而惡性脊柱骨腫瘤患者則進展快速，腫瘤可累計椎體及附近組織，患者可見疼痛、局部腫塊、脊柱畸形以及神經(jīng)功能障礙等癥狀，部分患者還可見全身癥狀，嚴重威脅患者健康［9］。

肝細胞癌對骨骼系統(tǒng)的影響直到最近幾年才被報道，由于對骨轉移認識的欠缺，對發(fā)生肝細胞癌骨轉移的肝細胞癌患者，治療手段局限。骨骼被認為是各種腫瘤第三好發(fā)的部位，僅次于肺和淋巴結，肝細胞癌大約有20%的患者會發(fā)展成骨轉移［10］。

近年來，利用光學作為診斷治療的方式已經(jīng)成為研究的熱點［11］，近紅外熒光成像以及光熱治療發(fā)展迅速，有望為肝癌骨轉移的診療提供新的思路和方法。吲哚菁綠（indocyanine green，ICG）是被美國食品及藥物管理局（Food and Drug Adminis?tration，F(xiàn)DA）批準用于臨床的近紅外成像試劑之一［12］，已廣泛用于疾病的光學成像等多個方面［13-15］。同時，其也是1種優(yōu)良的光敏劑，能夠吸收可深入穿透組織但不產(chǎn)生明顯熱能的700～800 nm的光，但ICG水穩(wěn)定性差、易與脂蛋白結合，注射后24 h在腫瘤組織及其細胞內基本無滯留，因此在光熱治療中的應用受限［16-17］。研究發(fā)現(xiàn)將其包載入的納米顆?？煽朔鲜鰡栴}。納米顆粒的靶向研究一直是目前的研究熱點，精氨酸—甘氨酸—天冬氨酸整合素（Arg?Gly?Asp，iRGD）［18］作為整合素αvβ3的一種靶向配體，這種受體在腫瘤新生血管的內皮細胞及多種腫瘤細胞表面均有高表達，這種多肽鏈長較短，由精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸組成，易于修飾在納米材料表面用于靶向研究［19-20］。

本實驗利用仿生材料脂質體（Liposome，LIP）包載ICG修飾RGD，制成ICG/Lip納米探針，通過在肝癌細胞HepG?2骨轉移模型上診斷和治療的研究，證明ICG/Lip納米探針能夠用于提高肝癌骨轉移的診療。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 5～6周雄性BALB/c裸鼠，體質量約25 g（北京維通利華公司）。肝癌細胞HepG?2（協(xié)和細胞庫購買）；二棕櫚酰磷脂酰膽堿（Dipa?lmityl phosphatidylcholine，DPPC），生物素化磷脂酰乙醇胺（DSPE?PEG2000?Biotin），DC膽固醇（DC cholesterol，DC?chol）和鏈霉親和素均購買于美國Sigma公司，三氯甲烷（Trichloromethane，CCl3）和PBS購買于國藥集團，iRGD購于美國Abcam公司，注射用ICG購于遼寧天醫(yī)生物制藥股份有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 靶向脂質體納米顆粒的制備 將質量比5∶2∶1的DPPC、DSPE?PEG 2000?Biontin及DC?chol按照配制50 mg，加入25 mL CCl3中充分溶解后在55℃下減壓蒸發(fā)2 h，隨后加入10 mL PBS備用；將200μL ICG溶液與200μL PFP混勻后使用超聲震蕩15 min；將上述溶液混合后反應，離心洗滌即得到LIP?ICG；取200μL LIP?ICG加入10μL鏈霉親和素10μL iRGD 4℃孵育30 min，PBS離心洗滌2次，去除過量抗體，即得到靶向脂質體納米顆粒。

1.2.2 LIP?ICG 一般特征評價配置100μg/mL的LIP?ICG溶液，使用ZS90測定其粒徑及電位；在TEM下觀察其形態(tài)及分布情況。

1.2.3 光熱效應檢測 取2、4、6、8 mg/mL LIP?ICG各100μL，置于96孔板內，利用808 nm波段的激光器以1.4 W/cm2和2 W/cm2兩種功率激光在不同的時間（0、2、4、6、8、10 min）照射，并用紅外熱成像儀記錄其溫度。

1.2.4 細胞毒性驗證 將104個/孔HeptG?2細胞種在96孔板中24 h。將含有不同濃度納米粒的培養(yǎng)基（30、50、100、150、200、250、300、350、400μg/mL）加入到培養(yǎng)板中培育24 h。向每個孔加入20μL MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h。然后吸出所有培養(yǎng)基，每孔加入150μL二甲基亞砜，震蕩5 min后，檢測490 nm處的吸光度值。

1.2.5 動物模型構建 取5只BALB/C小鼠，向小鼠皮下注射100μL肝細胞癌HepG?2懸液（約2.5×106個細胞）注射到小鼠背脊，制備肝癌骨轉移的原位模型，用于光學成像；成像后去病理切片，驗證探針的靶向性。取18只BALB/C小鼠，向小鼠皮下注射100μL肝細胞癌HepG?2懸液（約含細胞2.5×106個）注射到小鼠皮下，制備皮下腫瘤模型，用于光熱治療。當平均腫瘤體積大約到達50 mm3時，隨機分為3組，每組6只：實驗組尾靜脈注射納米顆粒溶液并進行激光輻照，對照組1尾靜脈注射PBS并進行激光輻照，對照組2注射納米顆粒溶液不進行輻照。測量并記錄腫瘤大小和小鼠質量。

1.2.6 體外顯像實驗將 0.5 mg/mL的LIP?ICG通過尾靜脈注射肝癌骨轉移的原位模型鼠，利用光聲成像儀模式下采集納米粒的光聲顯影圖像。

2 結果

2.1 LIP?ICG一般特性 TEM顯示納米顆粒的透射形貌呈現(xiàn)球狀，如圖1A顯示為（93.85±17）nm；此外，該納米顆粒在細胞中Z平均電位為（-5.37±4.29）mV，說明其在體安全性高。通過紫外可見分光光度計驗證，該納米粒在808 nm處有很好的吸收峰（圖1B）。這些特性證明了LIP?ICG納米顆粒具有良好的分布及光學特性，能夠為后續(xù)活體的光聲成像及光熱治療提供良好的特性。

圖1 LIP-ICG納米顆粒的特性驗證Fig.1 The characteristics ofLIP-ICG nanoparticles

2.2 LIP?ICG 納米顆粒的光熱效應LIP?ICG納米顆粒的具有良好光熱效應。對1 mg/mL的LIP?ICG溶液，通過1.4 W/cm2808 nm的激光輻照時，溫度隨時間增大升高，在同一激光功率條件下，輻照不同濃度LIP?ICG，溫度隨濃度增加而升高（圖2A）。筆者針對不同的濃度下0（PBS）、2、4、6、8 mg/mL的LIP?ICG納米顆粒，利用1.4 W/cm2和2 W/cm2激光器進行輻照，通過12 min的溫度收集發(fā)現(xiàn)，溫度和時間在前2 min具有線性關系，2 min后，高濃度及強激光輻照的溶液，溫度升高較快。其中，在濃度6 mg/mL、功率1.4 W/cm2激光輻照2 min時，其溫度可升至55℃（圖2B），達到了細胞致死濃度，該溫度及功率適合用于腫瘤的治療。

圖2 LIP?ICG納米顆粒的光熱特性驗證Fig.2 Photothermal properties of LIP?ICG nanoparticles

2.3 LIP?ICG的細胞生物學安全性 納米顆粒的生物安全性是其引用語活體的重要指標，因此，通過細胞層面驗證了LIP?ICG的生物安全性。如圖3所示，不同濃度的納米顆粒作用于肝癌細胞HepG?2，作用時間為12 h，通過細胞學驗證可以發(fā)現(xiàn)，細胞整體存活率較高，但隨著LIP?ICG的濃度升高，細胞存活略有下降，這是由于細胞滲透壓等原因，因此，該數(shù)據(jù)證明，在無熒光輻照的環(huán)境下，該納米顆粒LIP?ICG具有良好的生物安全性，這為LIP?ICG在體治療提供了重要的安全性保障。

2.4 體外光聲顯影定位骨轉移的腫瘤位置 通過生物安全性驗證后，針對肝癌骨轉移原位腫瘤進行成像，旨在準確定位轉移病灶的位置，從而為治療提供可靠的位置信息。通過尾靜脈注射LIP?ICG后，利用光聲成像設備進行成像，如圖4A所示，箭頭指向為LIP?ICG富集區(qū)。取富集區(qū)邊緣組織進行蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin?eosin staining，HE）染色，從圖4B看出，該富集LIP?ICG區(qū)為腫瘤細胞所在，利用倒置熒光顯微鏡進行激發(fā)可以觀察到LIP?ICG對腫瘤組織進行了良好的定位（圖4C）。

圖3 不同濃度的LIP?ICG對細胞的殺傷毒性實驗Fig.3 Cytotoxicity of different concentrations of LIP?ICG

圖4 體外光聲顯影及腫瘤驗證Fig.4 Photoacoustic imaging in vitro

2.5 LIP?ICG對腫瘤的光熱治療研究 利用皮下瘤進行光熱治療的驗證。實驗組LIP?ICG通過尾靜脈注射到小鼠體內后，利用808 nm的激光器，在1.4 W/cm2條件下進行輻照，收集輻照時間0、1、2 min的溫度變化，如圖5A所示，發(fā)現(xiàn)體內能夠產(chǎn)生溫度的升高，2 min后可以升高到61.9℃，達到了腫瘤細胞死亡溫度。實驗組和對照組經(jīng)過治療3 d后的腫瘤圖片，其中利用LIP?ICG+808 nm激光輻照2 min的腫瘤已經(jīng)明顯開始腫瘤細胞凋亡并結痂；PBS+808 nm激光輻照2 min組腫瘤收到輻照后有輕微的凋亡和結痂，未經(jīng)過輻照的LIP?ICG組腫瘤沒有明顯變化（圖5B）。在治療后的20 d內，收集腫瘤體積數(shù)據(jù)，可以發(fā)現(xiàn)LIP?ICG+激光組能夠明顯的治療腫瘤（圖5C）。

圖5 光熱治療研究Fig.5 The study of photothermal therapy

3 討論

雙親性的磷脂雙分子定向排列組成的脂質體納米顆粒，由于具有良好的生物相容性，可廣泛應用于藥物載體及成像領域［21-22］。在水中溶解時可形成分散結構，可以組裝成為小尺度的顆粒。ICG是FDA批準的可用于臨床近紅外熒光成像的小分子造影劑，由于其具有熒光在820～840 nm近紅外譜段的特點，已經(jīng)廣泛使用與近紅外手術導航、眼底血管等多種近紅外成像技術中。由于ICG具有吸收近紅外光的特點，在本實驗中，筆者利用其吸光特性，利用光聲成像這種穿透深度更高的技術用于檢測肝癌骨轉移［21-23］。利用ICG能夠吸收近紅外光轉化為熱能的特點，進行局部激光輻照光熱治療肝癌骨轉移。筆者成功合成93 nm左右的LIP?ICG納米顆粒，表現(xiàn)出呈現(xiàn)負電位，根據(jù)電位優(yōu)勢，納米顆粒能夠在體安全性大大提高；此外，表面的iRGD能夠靶向到腫瘤新生血管進入腫瘤組織。由于ICG對808 nm的光具有較強的吸收產(chǎn)生聲信號，在光聲成像領域已得到廣泛應用；其雙親特性使其在脂質體中可達到較高包封率，LIP?ICG可以用于光聲成像及光轉化為熱治療。此外，光轉化為熱治療的治療方式是物理熱療，能夠大大降低由化學藥物治療產(chǎn)生的毒副作用。通過對輻照的功率以及給藥濃度的研究，選取最優(yōu)的參數(shù)用于活體應用。

納米顆粒的生物安全性是納米藥物以及納米造影劑在活體研究的重要指標。因此，本實驗在LIP?ICG成功合成后，活體研究前開展了細胞層面安全性驗證，通過在細胞中加入不同濃度的LIP?ICG，驗證細胞毒性。MTT實驗結果發(fā)現(xiàn)，LIP?ICG的具有低的生物毒性，細胞生長良好，高濃度環(huán)境下細胞活度略有下降，考慮為細胞滲透壓造成的活性降低。因此，LIP?ICG具有良好的生物安全性，可以用于活體應用。通過活體給藥之后，在肝癌骨轉移的模型中，利用光聲成像，能夠準確找到腫瘤位置。通過病理檢測發(fā)現(xiàn)，在光聲中顯影的組織同樣具有熒光信號，且為腫瘤區(qū)域。因此，筆者利用該納米顆?？捎糜诟伟┕寝D移靶向的特點，開展了腫瘤治療。通過光聲定位腫瘤位置后，利用近紅外激光進行定點照射，從而在腫瘤局部產(chǎn)生熱量，殺滅腫瘤細胞。結果也表明，這種方法具有一定的腫瘤殺滅效果。

本文利用一種生物安全性高的診療一體化納米顆粒LIP?ICG，通過光聲成像對腫瘤進行準確的定位，利用光熱作用開展腫瘤的治療，有望為肝癌骨轉移的腫瘤提供一種新的治療方式。