劉立 蓋金娜 尹作文 陳琴華

1華中科技大學(xué)協(xié)和深圳醫(yī)院（廣東深圳518000）；2湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心（湖北十堰442000）

結(jié)腸癌（colon cancer）是最常見的惡性腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)造成嚴(yán)重的人口和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［1-2］。近年來，隨著癌癥篩查和癌前腺瘤切除手術(shù)的改善，全球結(jié)腸癌的發(fā)病率和病死率水平基本穩(wěn)定，但結(jié)腸癌占全球惡性腫瘤發(fā)病、死亡的比例均有所增加［3-5］。免疫治療已成為近些年腫瘤研究的熱點(diǎn)［6-8］，為結(jié)腸癌的臨床治療提供了新的希望［9-10］。但目前尚無十分有效的治療靶點(diǎn)和治療策略。因此，進(jìn)一步了解結(jié)腸癌的免疫學(xué)分子機(jī)制，有助于尋找更加有效的新的免疫治療靶點(diǎn)。

白細(xì)胞介素-18（IL?18）的結(jié)構(gòu)與IL?1β相似，可由活化的免疫細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞、T和B淋巴細(xì)胞、自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞和中性粒細(xì)胞產(chǎn)生［11］。報(bào)道指出，IL?18與IL?12聯(lián)合應(yīng)用可激活細(xì)胞毒性T細(xì)胞（cytotoxic T cells，CTLs）和NK細(xì)胞［12］。IL?18也可調(diào)節(jié)Th2和Th17細(xì)胞反應(yīng)，以及CD8細(xì)胞毒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的活性［13］。此外，腫瘤來源的IL?18可誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生PD?1，與三陰性乳腺癌患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)［14-15］。而關(guān)于IL?18在結(jié)腸癌中的作用與機(jī)制尚無報(bào)道。本次研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌患者血清及腫瘤組織中IL?18的水平均顯著增高。此外，IL?18能激活PI3K/AKT與NF?κB信號通路并影響結(jié)腸癌的免疫水平。IL?18可能通過調(diào)控PI3K/AKT與NF?κB信號通路激活腫瘤免疫從而發(fā)揮抑制結(jié)腸癌的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本次研究共納入華中科技大學(xué)協(xié)和深圳醫(yī)院胃腸外科于2018年3月至2019年5月收治的96例結(jié)腸癌患者作為研究對象進(jìn)行回顧性研究；患者的平均年齡為（58.2±14.4）歲，介于41～80歲；所有患者中男56例，女40例。所有納入本次研究的患者均為首次被診斷為結(jié)腸癌，所有患者均經(jīng)病理學(xué)或影像學(xué)（或內(nèi)鏡）確診。排除標(biāo)準(zhǔn)：復(fù)發(fā)性結(jié)腸癌；有放化療史；并發(fā)其他惡性腫瘤；近期服用影響機(jī)體免疫藥物；伴有全身感染性疾??；臨床資料不全；伴有嚴(yán)重臟器功能障礙；妊娠期或哺乳期女性。另選取同期在我院進(jìn)行體檢的健康者30例作為對照組；平均年齡（57.8±15.1）歲，介于35～66歲；男18例，女12例。所有納入者均簽署知情同意書，均知曉本次研究的目的與方法，研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 材料與設(shè)備 本次研究的主要試劑包括人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29和小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞株CT26（武漢大學(xué)細(xì)胞庫）。DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）、胎牛血清（FBS）（美國Hyclone公司）。青霉素、鏈霉素（美國Hyclone公司）。人IL?18 ELISA試劑盒（武漢華美）。重組人IL?18蛋白（上海美迪西生物）。Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑（美國Thermo Fisher公司）。SDS?PAGE試劑（上海生工）。IL?18、p?ERK1/2抗體（美國Santa Cruz公司）；p?β?catenin抗體（美國Santa Cruz公司）；p?PI3K、p?AKT、p?NF?κB（美國CST公司）；β?catenin、PI3K、NF?κB抗體（美國Abcam公司）；ERK1/2、AKT、β?actin抗體（武漢三鷹）。流式抗體如下：FITC?CD4抗體、APC?CD8抗體、FITC?CD56抗體、PE?CD16抗體（美國BioLegend公司）。pLVX?Tight?Puro質(zhì)粒（美國Invitrogen公司）。Taq酶（武漢擎科生物）。內(nèi)切酶BamH I與EcoR I（美國Thermo Fisher公司）。T4 DNA連接酶（日本TaKaRa公司）。C57小鼠購自武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。主要設(shè)備有生物安全柜、CO2培養(yǎng)箱、垂直電泳儀、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)、流式細(xì)胞儀、Tecan酶標(biāo)儀等。

1.3 酶聯(lián)免疫檢測 分別抽取結(jié)腸癌患者和健康者的空腹靜脈血5 mL，置于促凝管中，自然凝固，1 000×g離心15 min，取上清儲存于-80℃?zhèn)溆?。使用商業(yè)化的IL?18 ELISA試劑盒檢測血清的IL?18水平，檢測過程嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。用Tecan酶標(biāo)儀測量450 nm處的OD值。

1.4 Western Blot檢測 患者腫瘤組織、癌旁正常組織或小鼠腫瘤組織經(jīng)碾磨、裂解、超聲后離心取上清。貼壁細(xì)胞用RIPA裂解液進(jìn)行裂解，超聲后離心取上清。用BCA試劑盒（上海生工）測蛋白濃度。SDS?PAGE電泳用5%的濃縮膠與12%的分離膠進(jìn)行。電泳后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%BSA封閉。分別加IL?18、β?catenin、PI3K、NF?κB抗體（1∶2 000）；ERK1/2、AKT抗體（1∶3 000）；p?ERK1/2、p?β?catenin、p?PI3K、p?AKT、p?NF?κB抗體（1∶1 000）；β?actin抗體（1∶5 000）4℃孵育過夜。洗滌，二抗（美國Abcam公司）室溫孵育，洗滌，DBA顯色。

1.5 免疫組織化學(xué)染色 采用SP法檢測組織中IL?18的表達(dá)。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，加0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液（pH 6.0），用高壓鍋進(jìn)行抗原熱修復(fù)，加3%H2O2室溫避光孵育30 min，PBS洗滌3次。滴加10%的正常非免疫羊血清，37℃孵育60 min，PBS洗滌3次。滴加IL?18一抗工作液（1∶50），4℃孵育過夜，PBS洗滌3次。滴加二抗工作液（稀釋比例為1∶200），37℃孵育60 min，PBS洗滌3次。滴加辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的鏈霉卵白素，37℃孵育60 min，PBS洗滌3次。用DAB顯色、蘇木素復(fù)染、脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。顯微鏡下每個(gè)切片隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行拍照。Image Pro Plus軟件計(jì)算陽性染色的平均光密度。根據(jù)染色結(jié)果，以所有患者的平均光密度值為分界值將所有患者分為IL?18高表達(dá)組（IL?18High）和IL?18低表達(dá)組（IL?18Low）。

1.6 質(zhì)粒構(gòu)建與穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株建立 根據(jù)人IL?18的mRNA序列（NM_001243211.2）和pLVX?Tight?Puro載體圖譜，設(shè)計(jì)上下游引物：上游引物5′?CC?GGGATCCATGATGGCTGCTGAACCAG?3′（BamHI）；下游引物5′?CCCGGTAGAATTCGTCTTCGTTTTGA?AC?3′（EcoR I）。從人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用BamH I和EcoR I酶對pLVX?Tight?Puro質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切。根據(jù)T4連接酶的說明書將cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物與酶切質(zhì)粒連接。質(zhì)粒構(gòu)建成功后根據(jù)說明書包裝慢病毒，感染HT29或CT26細(xì)胞，并用嘌呤霉素篩選。

1.7 小鼠移植瘤模型的建立 將30只C57小鼠隨機(jī)分為IL?18過表達(dá)組和對照組。將過表達(dá)IL?18或?qū)φ誄T26細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度至1.0×107/mL，無菌條件下接種于C57小鼠左前肢腋窩結(jié)合部皮下，每只0.1 mL。接種后第3天起隔天記錄各小鼠的腫瘤大小，持續(xù)記錄60 d。用Western Blot分析各組小鼠腫瘤組織中IL?18、p?PI3K、p?AKT與p?NF?κB的表達(dá)。用流式細(xì)胞術(shù)檢測移植瘤中CD4+T、CD8+T與CD56+CD16+NK細(xì)胞比例。

1.8 流式細(xì)胞術(shù) 分離小鼠結(jié)腸癌移植瘤組織，消化、研磨后過不銹鋼網(wǎng)，PBS洗滌后制成單細(xì)胞懸液。計(jì)數(shù)并將細(xì)胞濃度調(diào)整到1.0×107/mL，取0.5 mL細(xì)胞懸液加入離心管。根據(jù)說明書將待測抗體（CD4、CD8、CD56或CD16）以適當(dāng)比例加入離心管中。渦旋混勻后避光室溫孵育30 min。PBS洗滌后重懸，上流式細(xì)胞儀檢測。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0和Graph Pad Prism 5.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與作圖。計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)和百分比［例（%）］表示，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用t檢驗(yàn)或Mann?WhitneyU檢驗(yàn)分析兩獨(dú)立樣本之間的差異，采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法檢驗(yàn)進(jìn)行計(jì)數(shù)資料分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者的基本信息 研究初期共納入108例結(jié)腸癌患者，其中12例不符合納入標(biāo)準(zhǔn)。最終96例結(jié)腸癌患者中56例（58.3%）為男性，平均年齡（58.2±14.4）歲。對照組40例健康者中18例（60.0%）為男性，平均年齡（57.8±15.1）歲。兩組的年齡與性別相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）?；颊叩幕拘畔⒁姳?。

表1 結(jié)腸癌患者的基本信息Tab.1 Basic data of patients with colon cancer

2.2 結(jié)腸癌患者血清及組織IL?18水平分析ELISA分析顯示結(jié)腸癌患者的血清IL?18水平為（178.5±23.9）pg/L，顯著高于健康者的（32.8±6.1）pg/L（P＜0.05）。免疫組化分析顯示IL?18在正常腸腺細(xì)胞和結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞中均有陽性表達(dá)，Western Blot與免疫組化分析均顯示結(jié)腸癌腫瘤組織中的IL?18水平顯著高于癌旁正常組織（P＜0.05），見圖1。

2.3 腫瘤IL?18水平與臨床特征的關(guān)系 IL?18高表達(dá)組57例（59.4%），IL?18低表達(dá)組39例（40.6%）。結(jié)腸癌患者中IL?18高表達(dá)與IL?18低表達(dá)組的年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、N分期與組織學(xué)分型相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。IL?18低表達(dá)組患者的T分期、M分期與TNM分期均顯著高于IL?18高表達(dá)組（P＜0.05），見表2。

圖1 結(jié)腸癌患者腫瘤（T）與癌旁正常組織（N）中的IL?18水平分析Fig.1 Expression of IL?18 in tumor（T）and adjacent normal（N）tissues of patients with colon cancer

表2 腫瘤組織IL?18與臨床特征的關(guān)系Tab.2 Relation between IL?18 level in tumor tissues and clinical characteristics 例（%）

2.4 IL?18對結(jié)腸癌細(xì)胞信號通路的影響 IL?18過表達(dá)能顯著增加HT29與CT26細(xì)胞p?PI3K、p?AKT與p?NF?κB水平，而不影響p?ERK與p?β?catenin水平。進(jìn)一步分析顯示，重組IL?18蛋白（rIL?18）也能增加HT29與CT26細(xì)胞p?PI3K、p?AKT與p?NF?κB水平，見圖2。

2.5 小鼠模型的建立與分析 小鼠模型顯示IL?18過表達(dá)組小鼠的腫瘤生長曲線顯著低于對照組（P＜0.05），生存曲線顯著優(yōu)于對照組（P＜0.05）。IL?18過表達(dá)組小鼠腫瘤組織中p?PI3K、p?AKT與p?NF?κB的表達(dá)水平均顯著低于對照組。此外，IL?18過表達(dá)組小鼠腫瘤組織中CD4+T、CD8+T與CD56+CD16+NK細(xì)胞數(shù)量均顯著高于對照組（P＜0.05），見圖3。

3 討論

近期研究指出IL?18也參與了Th2的分化，這為IL?18對Th1和Th2炎癥反應(yīng)的雙重作用提供了新的線索［12-15］。本次研究的結(jié)果顯示，結(jié)腸癌患者血清與腫瘤組織中的IL?18水平均出現(xiàn)顯著升高。同時(shí)，IL?18過表達(dá)組結(jié)腸癌移植瘤小鼠的腫瘤生長曲線顯著低于對照組小鼠，生存曲線顯著優(yōu)于對照組小鼠。提示IL?18可能參與結(jié)腸癌的發(fā)生與發(fā)展機(jī)制。

IL?18能與IL?18Rα和IL?18Rβ形成三聚體，使MyD88與IL?18Rα和IL?18Rβ的Toll?IL?1受體（TIR）結(jié)構(gòu)域結(jié)合，激活NF?κB與ERK/MAPK信號通路，這些信號能誘導(dǎo)Th1細(xì)胞產(chǎn)生IFN?γ，促進(jìn)細(xì)胞增殖［16-17］。IL?18刺激還能誘導(dǎo)PI3K/Akt信號通路，該信號對NK細(xì)胞的增殖和存活以及對非免疫系統(tǒng)細(xì)胞的存活至關(guān)重要［18］。本研究中，IL?18過表達(dá)與重組IL?18蛋白處理均能顯著增加HT29與CT26細(xì)胞的p?PI3K、p?AKT與p?NF?κB的表達(dá)水平，不影響p?ERK與p?β?catenin的表達(dá)水平。

圖2 IL?18對結(jié)腸癌細(xì)胞信號通路的影響Fig.2 Effect of IL?18 on signal pathways of colon cancer cells

圖3 結(jié)腸癌移植瘤小鼠模型分析Fig.3 Analysis of xenograft model of colon cancer

腫瘤免疫治療近年來發(fā)展迅速，對多種癌癥的臨床療效顯著［9，19］。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（CTLA?4）的特異性抗體（Ipilimumab）已被用于晚期黑色素瘤患者一線或二線免疫治療［20］。2015年FDA批準(zhǔn)了程序性死亡受體-1（PD?1）抗體（nivolumab和pembrolizumab）用于晚期非小細(xì)胞肺癌的治療［21-22］。盡管迄今為止還沒有結(jié)腸癌的免疫療法獲批，人們已經(jīng)開發(fā)出不同的免疫導(dǎo)向療法，如基于DC的疫苗和基于基因工程的嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法［9］。一種基于免疫檢查點(diǎn)抑制劑的免疫治療已經(jīng)在結(jié)腸癌的治療中取得了可觀的二期臨床數(shù)據(jù)［23］。日益增多免疫學(xué)相關(guān)分子被發(fā)現(xiàn)，可能成為結(jié)腸癌免疫治療的潛在靶點(diǎn)，如GUCY2C、HHLA2、OR7C1和MAGE?D4等［24］。因此，尋找更多的用于結(jié)腸癌免疫學(xué)治療的靶點(diǎn)至關(guān)重要。本次研究中，IL?18過表達(dá)組結(jié)腸癌移植瘤小鼠的腫瘤組織中CD4+T、CD8+T與CD56+CD16+NK細(xì)胞的數(shù)量均顯著高于對照組。因此，IL?18可能發(fā)揮激活結(jié)腸癌腫瘤免疫的作用。

本次研究仍存在一定的局限性。首先，本次納入的患者缺乏生存期數(shù)據(jù)，IL?18與結(jié)腸癌患者生存預(yù)后的關(guān)系仍需進(jìn)一步研究。其次，本次研究關(guān)于IL?18抑制結(jié)腸癌的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步確認(rèn)和深入研究。盡管如此，本次研究仍為后續(xù)的研究提供了一定的思路和基礎(chǔ)。綜上所述，結(jié)腸癌患者腫瘤組織及血清中的IL?18水平均出現(xiàn)顯著升高，IL?18可能通過激活PI3K/AKT與NF?κB信號通路激活結(jié)腸癌的腫瘤免疫活性進(jìn)而發(fā)揮抑制結(jié)腸癌的作用。