吳琪瑞 王艷華 柴麗芬 張輝 李淑霞 劉林英 石青吳凱 張慧萍，4，5

寧夏醫(yī)科大學(xué)1臨床醫(yī)學(xué)院，2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（銀川750004）；3寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院（銀川750004）；4國家衛(wèi)生健康委代謝性心血管疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（銀川750004）；5寧夏血管損傷與修復(fù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（銀川750004）

子癇前期（preeclampsia，PE）是妊娠過程中的一種特發(fā)疾病，其主要癥狀包括妊娠20周后出現(xiàn)高血壓和腎功能障礙［1］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界3%～7%的孕婦會(huì)發(fā)生PE，然而其發(fā)病機(jī)制至今仍不明確［2］。自噬是一種高度保守的自我消化過程，可通過降解細(xì)胞器和蛋白質(zhì)等來維持細(xì)胞功能和生存，從而使細(xì)胞在營養(yǎng)缺乏、缺氧等惡劣環(huán)境中繼續(xù)生長；但當(dāng)自噬過度時(shí)，則會(huì)引起細(xì)胞的程序性死亡［3］。研究［4-5］證明，滋養(yǎng)細(xì)胞自噬在PE的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，但作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是一類具有穩(wěn)定環(huán)狀結(jié)構(gòu)的非編碼RNA，其參與調(diào)控細(xì)胞自噬、增殖、凋亡等多種生理或病理過程［6］。前期文獻(xiàn)［7］報(bào)道circRNA RBM39在PE胎盤組織中差異性表達(dá)，但關(guān)于其在PE發(fā)生、發(fā)展過程中的具體作用尚未進(jìn)一步探討。本研究以滋養(yǎng)細(xì)胞株HTR?8/SVneo為實(shí)驗(yàn)對象，觀察缺氧誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞自噬的變化情況，進(jìn)一步分析circRNA RBM39及其結(jié)合的miR?5088?5p的變化，旨在探討PE的發(fā)病機(jī)制，為PE早期預(yù)測及診斷提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人源胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞株（HTR?8/SVneo）來源于上海復(fù)旦細(xì)胞庫（上海瑞鹿生物科技有限公司）；胎牛血清、RPMI?1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；青鏈霉素、胰蛋白酶消化液（碧云天生物技術(shù)研究所）；總蛋白提取試劑盒（上海貝博生物科技公司）；LC3B兔抗人一抗（CST公司，2775）；P62兔抗人一抗（abcam公司，ab109012）；β?actin（Santa公司，sc?47778HRP）；RNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒（Takara生物公司）；PARISTMKit（Invitrogen公司）；circRNA RBM39和miR?5088?5p引物由廣州銳博公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 滋養(yǎng)細(xì)胞采用含10%胎牛血清、100μg/mL青鏈霉素的RPMI?1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育，每2～3天用0.25%胰蛋白酶消化傳代1次，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及分組 待培養(yǎng)瓶中細(xì)胞長至60%～70%融合度時(shí)分為2組：（1）正常組：在37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)；（2）缺氧組：在NAPCO Series 8000WJ培養(yǎng)箱中以37℃、1%O2和5%CO2的條件下培養(yǎng)。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收取細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 使用TargetScan生物信息學(xué)軟件對circRNA靶基因miRNAs進(jìn)行預(yù)測，選取特異性miRNAs，檢測其在缺氧誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)。

1.2.4 Western Blot測定LC3B和p62的蛋白表達(dá) 收集正常組和缺氧組細(xì)胞，按照總蛋白提取試劑盒說明提取蛋白，定量，加入上樣緩沖液煮沸變性。每孔取30μg蛋白樣品進(jìn)行SDS?PAGE凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)、5%脫脂奶粉封閉2 h后，PBST洗膜10 min×3次，分別加入按比例稀釋后LC3B（1：1 000）、p62（1∶10 000）、β?actin（1∶10 000）一抗，4℃搖床孵育過夜，第2天用PBST洗膜10 min×3次，然后辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶10 000）室溫下?lián)u床孵育2 h，PBST洗膜10 min×3次，ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色，應(yīng)用Image Lab軟件對檢測結(jié)果的灰度值進(jìn)行分析。分別以LC3BⅡ灰度值與LC3BⅠ灰度值比值作為LC3B蛋白的表達(dá)量，p62灰度值與內(nèi)參β?actin灰度值比值作為p62蛋白的表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 Real?time PCR檢測 按照總RNA提取試劑盒說明書提取正常組和缺氧組細(xì)胞的總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，置于熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，總體系為20μL。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火34 s，共40個(gè)循環(huán)；熔解曲線95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s，結(jié)果使用2-ΔΔCt法表示基因的相對表達(dá)量，ΔΔCt=（Ct缺氧組目的基因－Ct缺氧組內(nèi)參基因）－（Ct正常組目的基因－Ct正常組內(nèi)參基因）。

1.2.6 circRNA的胞核、胞漿定位 按照胞漿胞核RNA分離試劑盒說明書提取正常組和缺氧組細(xì)胞的胞漿、胞核RNA，并用分光光度計(jì)測定RNA濃度和純度，然后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，置于熒光定量PCR儀上擴(kuò)增進(jìn)行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，結(jié)果以表示，用Prism 7.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較正常組和缺氧組自噬相關(guān)蛋白LC3B、p62和circRNA?RBM39、miR?5088?5p表達(dá)水平的差異，相關(guān)性分析采用pearson相關(guān)系數(shù)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 缺氧誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞后自噬的改變 與正常組相比，HTR?8/SVneo經(jīng)缺氧處理48 h后，自噬標(biāo)志蛋白LC3BⅡ/Ⅰ表達(dá)水平明顯升高，而p62表達(dá)水平則明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），提示缺氧誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞自噬升高，見圖1。

2.2 circRNA RBM39在缺氧誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá) HTR?8/SVneo經(jīng)缺氧處理48 h后，使用circRNARBM39特異性引物在缺氧誘導(dǎo)的滋養(yǎng)細(xì)胞中檢測發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，缺氧組中的circRNA RBM39表達(dá)上調(diào)（P<0.05），提示缺氧促進(jìn)了滋養(yǎng)細(xì)胞中circRNA RBM39的表達(dá)，見圖2。

圖1 缺氧誘導(dǎo)HTR?8/Svneo細(xì)胞后自噬的改變Fig.1 Changes of autophagy in HTR?8/Svneo cells induced by hypoxia

圖2 缺氧誘導(dǎo)HTR?8/Svneo細(xì)胞后circRNA RBM39的表達(dá)Fig.2 Expression of circRNA RBM39 in HTR?8/Svneo cells induced by hypoxia

2.3 circRNA RBM39的胞漿胞核定位分析 cir?cRNA發(fā)揮功能主要取決于其在細(xì)胞中的位置，位于細(xì)胞核的circRNA主要起轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，而位于細(xì)胞漿的circRNA主要起轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)作用。以GAPDH基因作為胞漿RNA的標(biāo)志物，U6基因作為胞核RNA標(biāo)志物，對circRNA RBM39進(jìn)行胞漿胞核定位分析發(fā)現(xiàn)，circRNA RBM39主要在胞漿中表達(dá)，見圖3。

2.4 生物信息學(xué)分析circRNARBM39與miR?5088?5p的結(jié)合關(guān)系 為進(jìn)一步研究circRNA RBM39轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制，使用TargetScan生物信息學(xué)軟件分析發(fā)現(xiàn)，circRNA RBM39與miR?5088?5p存在互補(bǔ)配對序列，提示circRNA RBM39可競爭結(jié)合miR?5088?5p，見圖4。

圖3 胞漿胞核分離實(shí)驗(yàn)檢測circRNA RBM39在滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)的分布Fig.3 Detection of circRNA RBM39 distribution in trophoblasts by cytoplasmic nucleus isolation assay

圖4 circRNA RBM39與miR?5088?5p的預(yù)測結(jié)合位點(diǎn)Fig.4 Predictive binding sites between circRNA RBM39 and miR?5088?5p

2.5 miR?5088?5p在缺氧誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá) 基于TargetScan生物信息學(xué)分析的結(jié)果，qRT?PCR檢測發(fā)現(xiàn)與正常組比較，缺氧組中的miR?5088?5p表達(dá)下調(diào)，與circRNA RBM39表達(dá)趨勢正好相反，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖5。

2.6 circRNA RBM39及miR?5088?5p與自噬標(biāo)記蛋白LC3B和p62的相關(guān)性分析 如圖6所示，cir?cRNA RBM39表達(dá)水平與自噬標(biāo)記蛋白LC3B呈正相關(guān)（r=0.783 2）；而與p62呈負(fù)相關(guān)（r=-0.792 8）。相反，miR?5088?5p表達(dá)水平與LC3B呈負(fù)相關(guān)（r=-0.846 6），與p62呈正相關(guān)（r=0.838），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），以上提示circRNA RBM39的表達(dá)水平與自噬水平呈顯著正相關(guān)，而miR?5088?5p的表達(dá)水平與自噬水平呈顯著負(fù)相關(guān)。

圖5 缺氧誘導(dǎo)HTR?8/Svneo細(xì)胞后miR?5088?5p的表達(dá)Fig.5 Expression of miR?5088?5p in HTR?8/Svneo cells induced by hypoxia

3 討論

圖6 滋養(yǎng)細(xì)胞中circRNA RBM39和miR?5088?5p的表達(dá)與自噬標(biāo)記蛋白LC3B和p62的相關(guān)性分析Fig.6 Analysis of the relationship between the expression of circRNA RBM39 and miR?5088?5p and autophagy marker proteins LC3B and p62 in trophoblasts

目前，PE的病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確，終止妊娠是治療PE的唯一方法［8］。因此，探討PE發(fā)病機(jī)制、制定防治策略成為產(chǎn)科亟待解決的問題之一?，F(xiàn)有研究表明，妊娠早期階段，胚胎發(fā)育及胎盤形成是在相對缺氧的條件下進(jìn)行的，滋養(yǎng)細(xì)胞阻塞子宮螺旋動(dòng)脈造成缺氧環(huán)境，可以促進(jìn)血管重鑄、滋養(yǎng)細(xì)胞分化侵襲，從而保證正常妊娠的進(jìn)行；但當(dāng)缺氧過度時(shí)，則會(huì)使妊娠后期胎盤慢性缺血缺氧，導(dǎo)致PE、胎兒生長受限、流產(chǎn)、死胎等不良妊娠結(jié)局［9-10］。自噬作為近些年來研究的熱點(diǎn)，能在營養(yǎng)缺乏、缺氧時(shí)維持細(xì)胞正常功能，越來越多的證據(jù)表明，自噬不僅在正常妊娠的胎盤形成過程中發(fā)揮重要作用，而且在PE、胎兒宮內(nèi)生長受限等產(chǎn)科并發(fā)癥中亦不可或缺［11-13］。既往研究表明，體外缺氧誘導(dǎo)人滋養(yǎng)細(xì)胞后自噬增加，同時(shí)與PE患者胎盤組織自噬水平一致；另外，NAKASHIMA等［14］通過敲除自噬相關(guān)基因，在缺氧培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，滋養(yǎng)細(xì)胞自噬減弱，侵襲力降低，這進(jìn)一步說明缺氧誘導(dǎo)的自噬在維持滋養(yǎng)細(xì)胞功能發(fā)揮重要作用。因此，本研究利用缺氧在體外誘導(dǎo)人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞模擬PE發(fā)生發(fā)展微環(huán)境，發(fā)現(xiàn)與正常組相比，缺氧組自噬水平增加，這與文獻(xiàn)報(bào)道的一致，暗示自噬參與了PE的發(fā)病過程，但具體機(jī)制仍存在爭議，需要進(jìn)一步研究。

circRNA是最近發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新的非編碼RNA成員，因具有普遍性、穩(wěn)定性、特異性等特點(diǎn)，成為近些年研究的熱點(diǎn)［15］。目前已發(fā)現(xiàn)，circRNA可通過作為miRNA的海綿體、調(diào)節(jié)可變剪接、與RNA結(jié)合蛋白結(jié)合及調(diào)節(jié)親本基因轉(zhuǎn)錄等方式參與自噬、凋亡、發(fā)育、穩(wěn)態(tài)維持等多種生物學(xué)過程，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［16-18］。研究表明，PE患者胎盤組織較正常妊娠孕婦存在大量差異性表達(dá)的circRNA，提示circRNA可能參與PE發(fā)病機(jī)制的調(diào)控［19-20］。到目前為止，只有少數(shù)circRNA在PE中的作用被研究，仍有大量circRNA在PE發(fā)生發(fā)展中的作用尚不清楚。因此，筆者通過qRT?PCR檢測circRNA RBM39發(fā)現(xiàn)，circRNA RBM39在缺氧誘導(dǎo)的滋養(yǎng)細(xì)胞自噬中上調(diào)，提示該基因可能參與自噬過程。為進(jìn)一步探究circRNA RBM39在缺氧誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞自噬中的作用，首先對其表達(dá)位置進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)該基因主要在胞漿中表達(dá)，提示其主要在轉(zhuǎn)錄后發(fā)揮調(diào)控功能。

miRNAs是一類在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的短非編碼RNA，越來越多的證據(jù)表明，circRNA能夠競爭性結(jié)合miRNAs位點(diǎn)，從而影響miRNAs及下游靶基因的表達(dá)［21］。最近一項(xiàng)研究［22］發(fā)現(xiàn)，在PE胎盤中circRNA TNRC18表達(dá)上調(diào)，其通過上調(diào)Grhl2抑制miR?762，從而導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。因此，作者通過對circRNA RBM39進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，其可競爭性結(jié)合miR?5088?5p，同時(shí)，miR?5088?5p在缺氧誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，這正好驗(yàn)證了circRNA與其結(jié)合的miRNAs表達(dá)水平的負(fù)性調(diào)控關(guān)系。最后，分別將circRNA RBM39及miR?5088?5p表達(dá)水平與自噬蛋白LC3B和p62表達(dá)水平作相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，circRNA RBM39與自噬水平呈正相關(guān)，而miR?5088?5p呈負(fù)相關(guān)。因此，筆者推測circRNA RBM39可能通過結(jié)合miR?5088促進(jìn)自噬相關(guān)基因在PE患者胎盤中高表達(dá)，因此自噬標(biāo)記蛋白LC3B表達(dá)增高，p62表達(dá)降低。但是，人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞株并不能完全替代PE原代滋養(yǎng)細(xì)胞，且在PE發(fā)生發(fā)展過程中胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞受到多種因素的調(diào)控，因此，后續(xù)筆者將分離原代滋養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行驗(yàn)證，并在動(dòng)物模型中進(jìn)一步探索circRNA RBM39在PE發(fā)生發(fā)展中的具體機(jī)制。

綜上所述，本研究結(jié)果提示了circRNA RBM39及miR?5088?5p與滋養(yǎng)細(xì)胞自噬水平升高密切相關(guān)，而circRNA RBM39可能通過競爭性結(jié)合miR?5088?5p在調(diào)節(jié)缺氧誘導(dǎo)的滋養(yǎng)細(xì)胞自噬中發(fā)揮重要作用，進(jìn)而引起PE的發(fā)生發(fā)展。這為PE的發(fā)病機(jī)制提出了一個(gè)新的方向，為進(jìn)一步探究PE胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞自噬過程中circRNA的調(diào)控機(jī)制提供了新的線索，并且由于circRNA的組織特異性及穩(wěn)定性，circRNA RBM39有望成為PE的預(yù)防和診斷的分子標(biāo)記物。