魯義 姚嘉茵 王保 陳陳燕 勞俊銘 劉棟 堯新華

1廣州市中醫(yī)醫(yī)院麻醉科（廣州510130）；2中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院（廣州510126）

糖尿病周圍神經(jīng)痛（diabetic peripheral neurop?athy，DPN）以疼痛、感覺(jué)障礙、感覺(jué)喪失為特征，是糖尿病患者最為常見的并發(fā)癥［1-2］。其發(fā)病機(jī)制未完全明確，治療手段有限，是目前麻醉鎮(zhèn)痛領(lǐng)域中極具挑戰(zhàn)的研究［3-4］。龍膽苦苷是從中草藥龍膽草中分離得到的一種環(huán)烯醚類化合物。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，龍膽苦苷（gentiopicroside，Gent）對(duì)中樞系統(tǒng)有一定的鎮(zhèn)痛作用，但機(jī)制不明確［5］。作者前期研究已成功通過(guò)四氧嘧啶鏈脲佐菌素（STZ）構(gòu)建糖尿病神經(jīng)痛大鼠動(dòng)物模型［6-8］，并且證實(shí)龍膽苦苷對(duì)DPN大鼠模型有確證的鎮(zhèn)痛作用。然而，其鎮(zhèn)痛的機(jī)制尚不明確。神經(jīng)傳導(dǎo)以及運(yùn)動(dòng)功能的有效實(shí)現(xiàn)依賴神經(jīng)血流供應(yīng)，糖尿病患者通常合并血脂代謝紊亂，血脂沉積在血管壁導(dǎo)致管腔狹窄，影響外周神經(jīng)血供，從而影響神經(jīng)功能。這是目前廣泛認(rèn)可的血脂代謝在DPN致病中的作用，而PPAR?γ/AMPK/ACC是體內(nèi)血脂代謝的重要信號(hào)通路。龍膽苦苷保護(hù)周圍神經(jīng)的作用是否通過(guò)調(diào)節(jié)此通路影響血脂代謝而實(shí)現(xiàn)，這個(gè)問(wèn)題亟需解答。因此，本研究將延續(xù)STZ誘導(dǎo)的DPN大鼠動(dòng)物模型，以血脂代謝紊亂、神經(jīng)傳導(dǎo)功能為切入點(diǎn)，探索營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)血流以及其相關(guān)的PPAR?γ/AMPK/ACC信號(hào)通路的內(nèi)在聯(lián)系，從而探討龍膽苦苷治療DPN的可能分子機(jī)制，為有效防治DPN提供新的理論和藥物新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 SPF級(jí)雄性SD大鼠共45只（根據(jù)成組設(shè)計(jì)定量資料的樣本含量計(jì)算公式，計(jì)算出每實(shí)驗(yàn)組需要大鼠15只），體質(zhì)量180～220 g，稱重量后進(jìn)行編號(hào)，隨機(jī)均分為3組，實(shí)驗(yàn)分組如下：空白對(duì)照組（15只）；STZ誘導(dǎo)的DPN模型組（15只）；龍膽苦苷治療組（20 mg/kg·d Gent灌胃+STZ）（15只）。

1.2 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備 采用鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ；Sigma，St.Louis，MO，USA）法構(gòu)建DPN大鼠模型，禁食不禁水24 h，禁食12 h后按55 mg/kg腹腔注射STZ溶液。腹腔注射48 h后用血糖分析儀（北京中生生物）測(cè)定大鼠尾靜脈血糖>16.7 mmol/L的大鼠成為DPN大鼠模型，共得到30只DPN大鼠，全部大鼠造模成功。龍膽苦苷治療組在造模成功后給予龍膽苦苷20 mg/（kg·d）灌胃，大鼠劑量計(jì)算公式=（X mg/kg×70 kg×0.018）/0.2 kg=6.3 X mg/kg。X代表人體有效藥物劑量，70 kg是人的標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量，0.2 kg是大鼠的標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量，0.018是大鼠與人根據(jù)體表面積比的換算系數(shù)［9］?？瞻讓?duì)照組則腹腔注射相同體積檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖液，共得到15只。空白對(duì)照組以及DPN模型組大鼠均使用相同體積的生理鹽水灌胃處理。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.3.1 行為學(xué)分析 在造模后第1、7、14天，觀察3組大鼠有無(wú)自發(fā)性疼痛行為。內(nèi)容包括歩態(tài)、抬腳、舔腳、腿著地性或抗重力行為、自殘等。

1.3.2 刺激試驗(yàn)（1）熱輻射刺激。采用HARG?REAVES等［10］所描述的方法，在造模成功后第1、7、14天每組大鼠均接受熱輻射熱刺激試驗(yàn)3次，間隔5 min，持續(xù)30 s。觀察并記錄大鼠后肢抬腳的潛伏期。（2）冷板試驗(yàn)。在造模成功后第1、7、14天進(jìn)行冷板試驗(yàn)。使用JASMIN等［11］所描述的方法。冷板（PanlabHavard LE?7420，Spain）溫度為4℃。觀察并記錄大鼠足趾縮腿反應(yīng)潛伏期，同時(shí)記錄5 min內(nèi)總縮腿次數(shù)。（3）觸覺(jué)過(guò)敏試驗(yàn)。在造模成功后第1、7、14天進(jìn)行觸覺(jué)過(guò)敏試驗(yàn)。將大鼠放置于鐵網(wǎng)上，下方使用Semmes?Weinstein Monofilaments A 835儀器（Sammons Preston，USA）代表不同壓力的Von Frey針刺激足底，使用DETLOFF等［12］所改良的上下調(diào)整法，記錄最小能誘發(fā)其縮腿的閾值。

1.3.3 激光多普勒血流儀檢測(cè)下肢血流 在造模后第14天采用多普勒激光測(cè)速儀（Perimed 5000，Sweden）檢測(cè)下肢血流。大鼠腹腔麻醉后，下肢剔毛，取其足踝內(nèi)側(cè)上方2 cm處，測(cè)定血液灌注量（Perfusion，PU），每次連續(xù)測(cè)定5 min，得出PU平均值。

1.3.4 采集坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度 在使用激光多普勒血流儀檢測(cè)完下肢血流后直接手術(shù)分離坐骨神經(jīng)。采用生物信號(hào)采集系統(tǒng)（Medlab?U/4C，USA）測(cè)定運(yùn)動(dòng)及感覺(jué)神經(jīng)傳導(dǎo)速度。刺激點(diǎn)定位在坐骨結(jié)下0.5 cm，刺激強(qiáng)度從弱開始，緩慢增強(qiáng)到強(qiáng)刺激。計(jì)算復(fù)合動(dòng)作電位出現(xiàn)的潛伏期與傳導(dǎo)距離的比值來(lái)表示神經(jīng)傳導(dǎo)速度。

1.3.5 采用RT?PCR檢測(cè)PPAR?γ/AMPK/ACC信號(hào)通路各因子定位表達(dá) 完成以上實(shí)驗(yàn)后，小心完整取出大鼠腰膨大組織，采用RT?PCR檢測(cè)各組大鼠腰膨大脊髓組織各因子表達(dá)的變化。采用Gel?Pro Analyzer 4.0軟件（Media Cybernetics，USA）根據(jù)電泳條帶的面積和亮度計(jì)算出每個(gè)條帶的積分光比值，該比值表示該細(xì)胞因子mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異采用t檢驗(yàn)分析，計(jì)數(shù)資料采用率表示，χ2檢驗(yàn)分析組間差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為學(xué)分析以及刺激試驗(yàn) 造模后每天觀察各組大鼠行為學(xué)變化。在造模后第7天開始，DPN模型組大鼠比空白對(duì)照組和龍膽苦苷治療組大鼠顯得最為煩躁不安，少動(dòng)，到第14天這種組間大鼠行為學(xué)差異尤為明顯。本研究進(jìn)一步在造模后第7、14天采用刺激試驗(yàn)量化各組大鼠的冷刺激、熱刺激以及機(jī)械刺激的疼痛閾值。結(jié)果提示，與對(duì)空白對(duì)照組相比較，DPN模型組以及龍膽苦苷治療組大鼠的冷刺激、熱刺激以及機(jī)械刺激的疼痛閾值明顯下降（P<0.05）；龍膽苦苷藥物干預(yù)后，各刺激試驗(yàn)的疼痛閾值較DPN模型組升高，結(jié)果說(shuō)明DPN大鼠存在痛覺(jué)過(guò)敏，而龍膽苦苷有效緩解疼痛，提高疼痛耐受閾值（圖1）。

2.2 各組大鼠血脂水平比較 DPN模型組大鼠總甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）以及低密度脂蛋白（LDL）較空白對(duì)照組大鼠顯著升高（P<0.05）；低密度脂蛋白（HDL）較空白對(duì)照組下降（P<0.05）。結(jié)果提示DPN大鼠存在血脂代謝紊亂。龍膽苦苷干預(yù)后，有效下調(diào)TG、TC及LDL，上調(diào)HDL的水平（P<0.05）。龍膽苦苷有效糾正DPN大鼠的血脂代謝紊亂。見圖1。

圖1 各組大鼠血脂水平以及刺激試驗(yàn)比較Fig.1 Blood fat level and stimulation tests in each group

2.3 各組大鼠下肢脛前動(dòng)脈神經(jīng)血流速度比較采用多普勒彩超評(píng)估營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)的血流速度，結(jié)果提示，DPN模型組大鼠神經(jīng)血流速度顯著下降，龍膽苦苷治療后神經(jīng)血流速度較DPN模型組升高（表1）。大鼠神經(jīng)傳導(dǎo)速度與營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)的血流速度有顯著正相關(guān)性，龍膽苦苷有效增加神經(jīng)血流速度，營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)，從而改善神經(jīng)傳導(dǎo)功能。

2.4 各組大鼠干預(yù)后坐骨神經(jīng)運(yùn)動(dòng)與感覺(jué)傳導(dǎo)速度的比較 通過(guò)檢測(cè)運(yùn)動(dòng)以及感覺(jué)神經(jīng)傳導(dǎo)速度，可以反應(yīng)神經(jīng)傳遞功能變化。結(jié)果顯示，DPN模型組大鼠不管感覺(jué)還是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)的傳導(dǎo)速度均較對(duì)照組明顯下降，存在神經(jīng)功能損傷。龍膽苦苷干預(yù)后，感覺(jué)及運(yùn)動(dòng)神經(jīng)的傳導(dǎo)速度較DPN模型組增加（P<0.05），但仍低于空白對(duì)照組（P<0.05，表1）。結(jié)果說(shuō)明，龍膽苦苷一定程度上改善神經(jīng)功能，但未能完全逆轉(zhuǎn)糖尿病周圍神經(jīng)病變導(dǎo)致的神經(jīng)損傷。

表1 各組大鼠神經(jīng)血流速度、運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)神經(jīng)傳導(dǎo)速度的比較Tab.1 Blood flow velocity，motor and sensory nerve conduction velocity in each group ±s

表1 各組大鼠神經(jīng)血流速度、運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)神經(jīng)傳導(dǎo)速度的比較Tab.1 Blood flow velocity，motor and sensory nerve conduction velocity in each group ±s

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

神經(jīng)血流速度運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度感覺(jué)神經(jīng)傳導(dǎo)速度空白對(duì)照組181.46±14.84#58.4±8.34#42.73±3.30#DPN模型組63.66±10.49*40.73±3.15*16.40±2.35*龍膽苦苷治療組166.00±11.27*#50.67±9.91*#38.20±4.18*#

2.5 各組大鼠腰膨大脊髓組織PPAR?γ/AMPK/ACC各因子表達(dá)的變化 采用RT?PCR檢測(cè)大鼠脊髓組織PPAR?γ/AMPK/ACC各因子基因表達(dá)量的變化。結(jié)果顯示，DPN模型組大鼠PPAR?γ與AMPK表達(dá)量較對(duì)照組下降，而ACC表達(dá)量較對(duì)照組升高（P<0.05）。龍膽苦苷治療組大鼠PPAR?γ與AMPK表達(dá)量較DPN模型組升高，而ACC表達(dá)量較DPN模型組下降。其中，龍膽苦苷組大鼠ACC表達(dá)量高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，圖2）。

圖2 各組大鼠腰膨大脊髓組織PPAR?γ/AMPK/ACC各因子表達(dá)的變化Fig.2 Expression of genes in PPAR?γ/AMPK/ACC signaling pathway in each group

3 討論

DPN對(duì)于患病時(shí)間較長(zhǎng)的糖尿病患者而言，是最為常見并發(fā)癥［13］。根據(jù)KISOZI等［14］報(bào)道，50%以上的糖尿病患者會(huì)出現(xiàn)周圍神經(jīng)病變，主要表現(xiàn)為下肢疼痛、肢端麻木，極大地影響糖尿病患者的生存質(zhì)量，部分患者因?yàn)殚L(zhǎng)期慢性疼痛的刺激與困擾甚至?xí)霈F(xiàn)失眠、抑郁，耗費(fèi)大量的醫(yī)療與社會(huì)資源。因此，預(yù)防以及治療DPN是麻醉鎮(zhèn)痛領(lǐng)域中的新挑戰(zhàn)。

目前DPN的發(fā)病機(jī)制尚不明確，慢性高血糖、繼發(fā)血脂代謝紊亂以及由此導(dǎo)致的無(wú)菌性慢性炎癥導(dǎo)致外周神經(jīng)的功能障礙是DPN致病的重要因素［15］。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)更為關(guān)注神經(jīng)損傷本身［16-17］。外周神經(jīng)的兩大功能包括感覺(jué)傳導(dǎo)以及運(yùn)動(dòng)傳導(dǎo)功能的正常運(yùn)作是基于神經(jīng)結(jié)構(gòu)以及血流供應(yīng)正常的情況下實(shí)現(xiàn)的。但長(zhǎng)期高血糖、血脂紊亂導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)的血管管腔脂質(zhì)沉積，管腔變窄，神經(jīng)血流速度變慢，從而影響神經(jīng)的血供，導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙［18-20］。本研究從最新的血脂代謝紊亂、神經(jīng)血供角度，探索DPN的致病機(jī)制。結(jié)果提示，DPN模型大鼠的確存在顯著的血脂代謝紊亂以及神經(jīng)功能異常，表現(xiàn)為感覺(jué)傳導(dǎo)速度以及運(yùn)動(dòng)傳導(dǎo)速度顯著下降，與行為學(xué)和刺激實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相符合。筆者進(jìn)一步通過(guò)多普勒彩超監(jiān)測(cè)神經(jīng)血流速度，結(jié)果顯示DPN模型大鼠下肢脛前動(dòng)脈神經(jīng)血流速度下降，與神經(jīng)功能障礙成顯著相關(guān)性，從而驗(yàn)證了神經(jīng)血流速度與神經(jīng)功能的關(guān)系，與國(guó)外研究結(jié)果一致。

DPN的有效治療藥物非常有限。臨床常用的藥物包括抗抑郁藥、抗驚厥藥、抗痙攣藥，但上述藥物都具有一定的毒副作用，而且緩解疼痛的效果欠佳，限制了其在臨床的廣泛應(yīng)用。由于缺乏有效的藥物，大約有50%～60%的患者最終被迫選擇了神經(jīng)離斷術(shù)以緩解疼痛。近年來(lái)，隨著祖國(guó)醫(yī)學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展，中醫(yī)中藥在治療疼痛痹癥上取得明顯突破［21］。基于“消渴痹證”、“血痹”、“厥證”等理念，中醫(yī)在治療DPN上多以活血化瘀、健脾補(bǔ)腎、益氣養(yǎng)陰等治療手段。龍膽苦苷是龍膽瀉肝湯的主要活性成分，而且其化學(xué)結(jié)構(gòu)已經(jīng)明確。本鎮(zhèn)痛研究中心既往研究數(shù)據(jù)顯示，龍膽苦苷對(duì)DPN患者有治療作用。本文進(jìn)一步采用龍膽苦苷干預(yù)DPN大鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，龍膽苦苷有效改善DPN大鼠外周神經(jīng)的運(yùn)動(dòng)以及感覺(jué)傳導(dǎo)功能，增加冷熱刺激以及機(jī)械刺激的疼痛閾值，有效發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。

然而龍膽苦苷的治療DPN的分子機(jī)制仍未明確，本文結(jié)果提示龍膽苦苷治療組大鼠的外周神經(jīng)血流速度較DPN模型組增加，通過(guò)改善神經(jīng)血供實(shí)現(xiàn)神經(jīng)保護(hù)作用可能是龍膽苦苷的治療機(jī)制。既然血脂代謝紊亂導(dǎo)致血管脂質(zhì)沉積會(huì)直接影響血管管腔直徑，乃至血流速度的變化，本研究進(jìn)一步從血脂代謝的分子機(jī)制探索龍膽苦苷的神經(jīng)保護(hù)作用。PPAR?γ/AMPK/ACC信號(hào)通路是比較成熟的血脂代謝通路。PPAR?γ通過(guò)促進(jìn)AMPK，抑制ACC共同調(diào)節(jié)血脂代謝平衡。已有研究報(bào)道，糖尿病患者存在胰島素抵抗，PPAR?γ表達(dá)量顯著下降，使用羅格列酮，PPAR?γ的激動(dòng)劑可以有效改善胰島素抵抗，同時(shí)改善血脂紊亂［22］。本研究結(jié)果表明，龍膽苦苷藥物干預(yù)可以促進(jìn)腰膨大脊髓組織中PPAR?γ以及下游AMPK的基因表達(dá)，抑制ACC的基因表達(dá)，起到與羅格列酮相類似的作用。因此，龍膽苦苷對(duì)DPN大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用可能是通過(guò)PPAR?γ/AMPK/ACC信號(hào)通路介導(dǎo)。

本研究存在一定的局限性，對(duì)于PPAR?γ/AMPK/ACC信號(hào)通路的研究?jī)H局限在基因水平。因此，未來(lái)將進(jìn)一步深入研究，完善信號(hào)通路蛋白水平的檢測(cè)，開展離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，通過(guò)添加PPAR?γ、AMPK、ACC各自的激動(dòng)劑與抑制劑深入探索信號(hào)通路的內(nèi)在關(guān)系。本研究結(jié)果表明龍膽苦苷可有效治療DPN大鼠模型，其神經(jīng)保護(hù)機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)PPAR?γ/AMPK/ACC信號(hào)通路，維持血脂代謝平衡，增加營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)血流而實(shí)現(xiàn)的。