余 婕閆夢(mèng)真陳桂婷周婷婷李世剛,2

(1.三峽大學(xué) 醫(yī)學(xué)院,湖北 宜昌443002；2.湖北省長(zhǎng)盛川青磚茶研究所,湖北 宜昌443000)

非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指除酒精和其他明確的肝損傷因素引起,以肝細(xì)胞內(nèi)脂肪聚積和脂肪變性為主要特征的臨床病理綜合癥.NAFLD 已成為世界上最常見的慢性肝病,影響了我國(guó)約15%～20%的普通人群,在西方國(guó)家的患病率高達(dá)30%以上,且近年來(lái)有年輕化的趨勢(shì)[1-2].它包括一系列肝臟表現(xiàn),從非酒精性脂肪肝(也稱為脂肪變性)到非酒精性脂肪性肝炎,肝纖維化和肝硬化,最終可能發(fā)展為肝細(xì)胞癌[3-4],嚴(yán)重威脅著人類的健康.但是,目前各種抗NAFLD 藥物正處于臨床前開發(fā)階段,尚未有用于治療NAFLD 的特效藥物.因此,探索新穎高效且具有最小毒副作用的藥物,對(duì)防治NAFLD 具有理論及臨床應(yīng)用價(jià)值.

茶葉是我國(guó)常見的的飲品.其中,黑茶作為中國(guó)六大茶類之一,通常歸屬于后發(fā)酵茶,主產(chǎn)于湖南、湖北、四川、廣西等省地[5].黑茶含有較多有益的特有成分,能夠改善人體健康,并且具有良好的降脂減肥作用[6].青磚茶是我國(guó)黑茶中的一種,其保健功效顯著而深受人們喜愛,是西北高脂飲食地區(qū)少數(shù)民族的生活必需品[7].近年來(lái)研究表明,青磚茶具有明顯的抗氧化和降脂作用[8-9],但大多是宏觀水平的研究,其具體作用機(jī)理不明.NAFLD的重要特征是甘油三酯(Triglyceride,TG)的堆積,因此可通過(guò)建立體外脂肪變性模型來(lái)研究NAFLD.本研究旨在探討青磚茶水提物(green brick tea water extract,GBT-WE)對(duì)Hep G2細(xì)胞脂肪變性的影響,以期對(duì)其機(jī)制有進(jìn)一步的了解,為NAFLD 的治療提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青磚茶(湖北省長(zhǎng)盛川青磚茶研究所提供)；Hep G2細(xì)胞(上海賽百慷生物技術(shù)股份有限公司)；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(浙江天杭生物科技有限公司)；MEM培養(yǎng)基(上海源培生物科技股份有限公司)；胰蛋白酶(吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)；青鏈霉素混合液(HyClone公司,美國(guó))；辛伐他汀(＞99%,細(xì)胞培養(yǎng)級(jí))(大連美侖生物技術(shù)有限公司)；CCK-8 活力檢測(cè)試劑盒(Dojindo公司,日本)；油紅O 染液(南京建成科技有限公司)；TG 酶法測(cè)定試劑盒、總膽固醇(Total cholesterol,TC)酶法測(cè)定試劑盒、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒(均北京普利萊基因技術(shù)有限公司)；β-actin抗體(武漢谷歌生物科技有限公司)；固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c(Sterolregulatory element binding proteins 1c,SREBP1c)抗體(Santa Cruz Biotechnology公司,美國(guó))；脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase,FAS)抗體(Cell Signaling Technology公司,美國(guó))；HRP標(biāo)記羊抗兔二抗和HRP標(biāo)記羊抗鼠二抗(均武漢賽維爾科技有限公司)；ECL顯影液(碧云天生物技術(shù)有限公司).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 青磚茶水提物的制備

將青磚茶敲碎,按照1∶15的質(zhì)量比,將青磚茶在100℃沸水中熬煮40 min,將煮好的茶湯通過(guò)液體濃縮分離罐濃縮至原濃度的16倍,最后將濃縮后的茶湯-80℃過(guò)夜,次日進(jìn)行冷凍干燥,得到青磚茶水提物粉末,并將其置于4℃冰箱保存待用.

1.2.2 細(xì)胞的培養(yǎng)

用含10%FBS 的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG2 細(xì)胞,置于CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、37℃培養(yǎng)箱中,3～5 d傳代,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn).

1.2.3 Hep G2細(xì)胞脂肪變性模型的建立

設(shè)置正常對(duì)照組和模型組,模型組分別利用含有30%、50%、70%的FBS培養(yǎng)液培養(yǎng),采用CCK-8法、ELISA 法(測(cè)定TG、TC)以及油紅O染色來(lái)確定造模劑量.

1.2.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖

Hep G2細(xì)胞以每孔4 000 個(gè)細(xì)胞接種于96 孔板,待細(xì)胞過(guò)夜貼壁后加藥.將GBT-WE設(shè)置4個(gè)質(zhì)量濃度,分別為120μg/m L、240μg/m L、360μg/m L、480μg/m L,每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)5個(gè)平行孔,2個(gè)空白對(duì)照孔,24 h后依照CCK-8試劑盒說(shuō)明書每100μL 完全培養(yǎng)基加10μL CCK-8試劑,于CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、37℃培養(yǎng)箱中作用2h 后,用酶標(biāo)儀測(cè)定A450 nm 值.以對(duì)照組為基礎(chǔ),計(jì)算實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖率.

1.2.5 GBT-WE干預(yù)Hep G2細(xì)胞脂肪變性

干預(yù)實(shí)驗(yàn)分為5組:1)空白對(duì)照組(Control)；2)模型組(Model)；3)GBT-WE 低劑 量 組；4)GBT-WE高劑量組；5)Simvastatin組.Simvastatin是一種降脂藥,臨床上常用來(lái)治療NAFLD,主要用來(lái)觀察GBTWE的降脂能力是否與常規(guī)藥物效果一致[10].且質(zhì)量濃度設(shè)置為5μg/m L[11].除正常對(duì)照組外,其余各組均利用高質(zhì)量濃度FBS造模(濃度依據(jù)1.2.3所確定的劑量)48 h；除正常對(duì)照組和模型組外,其余各組造模成功后分別加入不同質(zhì)量濃度的藥物(依照1.2.4節(jié)CCK-8結(jié)果確定的對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒性的藥物質(zhì)量濃度)干預(yù)24 h(正常對(duì)照組和模型組則加入含有10%FBS的培養(yǎng)基).

1.2.6 油紅O 染色

將HepG2細(xì)胞以密度為2×105個(gè)/m L 接種于6孔板中,待細(xì)胞過(guò)夜貼壁后,造模孵育,加藥24 h時(shí)終止培養(yǎng),棄上清培養(yǎng)液,無(wú)磷酸鈣的PBS洗3遍.而后用4%的多聚甲醛固定40 min,加入油紅O 染色1 h,水性封固劑封片,顯微鏡下觀察拍照,用Image Pro Plus分析平均光密度值.

1.2.7 TG、TC含量的測(cè)定

棄去培養(yǎng)基加入PBS 洗滌細(xì)胞3 次,加入0.2 m L裂解液進(jìn)行裂解,混勻后室溫靜置10 min,以2 000 g的轉(zhuǎn)速離心5 min取適量上清,用TG、TC 測(cè)定試劑盒分別測(cè)定TG、TC含量.余下上清用于BCA法蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量,最后以每克蛋白濃度校正TG、TC含量,單位為mmol/gprot.

1.2.8 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白SREBP1c、FAS的表達(dá)

用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞3次,最后一次徹底吸干殘留液,加入細(xì)胞裂解液(使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑),迅速將細(xì)胞刮下收集細(xì)胞.冰浴30 min,期間用移液器反復(fù)吹打,確保細(xì)胞完全裂解,12 000 rpm,4℃,離心10 min,收集上清,即得到總蛋白溶液.采用BCA 法測(cè)定細(xì)胞裂解后的蛋白濃度.將蛋白溶液按照4∶1的比例加入蛋白上樣緩沖液,100℃變性5 min.每組取50μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE 電泳,轉(zhuǎn)至PVDF 膜上,常溫下用5%的脫脂奶粉搖床上封閉1 h,按照1∶1 000的稀釋比例分別加入β-actin、SREBP1c、FAS一抗,4℃孵育過(guò)夜,TBST 洗膜3次.而后加入相應(yīng)的二抗稀釋液(1∶5000),室溫孵育1 h,TBST 洗膜3次.ECL 發(fā)光顯影,用β-actin作內(nèi)對(duì)照標(biāo)化來(lái)表示各組中SREBP1c和FAS的相對(duì)表達(dá)量.

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示,兩組間的比較采用t 檢驗(yàn),多組間的比較采用單因素方差分析,以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn).

2 結(jié)果

2.1 HepG2細(xì)胞脂肪變性模型的建立

為了研究不同濃度的FBS對(duì)細(xì)胞脂肪變性程度的影響,對(duì)不同組細(xì)胞進(jìn)行油紅O染色,結(jié)果觀察到,對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)可見少許紅色脂滴.隨著血清濃度的上升,細(xì)胞內(nèi)聚積的脂滴逐漸增多,與對(duì)照組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05).其中,30%FBS組紅色脂滴數(shù)量增多,但脂滴大小較對(duì)照組無(wú)明顯差異；而50%FBS 組則出現(xiàn)數(shù)量多,面積大的脂滴堆積,呈泡狀性；70%FBS組脂滴數(shù)量也較多,但是存在部分細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象.證明50%的FBS可致Hep G2細(xì)胞脂肪變性,如圖1所示.

圖1不同濃度的FBS處理細(xì)胞后的油紅O 染色

同時(shí),隨著FBS濃度的逐漸增加,HepG2細(xì)胞中的TG 和TC 含量也在不斷增加,當(dāng)FBS 濃度達(dá)到50%以上時(shí),與對(duì)照組相比表現(xiàn)出明顯的差異性(P＜0.05),且TG 的增長(zhǎng)相對(duì)于TC 更為顯著(P＜0.01).另外,根據(jù)CCK-8實(shí)驗(yàn),當(dāng)胎牛血清濃度達(dá)到70%時(shí),細(xì)胞增殖受到抑制,可能歸因于高濃度的胎牛血清中游離脂肪酸含量過(guò)高對(duì)細(xì)胞造成了毒性作用,與油紅O 染色觀察到的現(xiàn)象一致.而50%的FBS就足以造成細(xì)胞脂肪變性,確定50%的FBS濃度為造模劑量.且根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),24 h不足以使脂質(zhì) 積聚,確定造模時(shí)間為48 h,見表1.

表1不同濃度的FBS對(duì)細(xì)胞增殖率和TG、TC的影響

2.2 GBT-WE對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響

高濃度的GBT-WE 會(huì)抑制細(xì)胞生長(zhǎng),對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生一定的毒性作用.因此需要通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)選取無(wú)毒性的藥物濃度進(jìn)行后續(xù)干預(yù)細(xì)胞脂肪變性模型的實(shí)驗(yàn).藥物作用24 h后可觀察到,隨著GBT-WE質(zhì)量濃度的上升,細(xì)胞的存活率下降,當(dāng)質(zhì)量濃度超過(guò)240μg/m L時(shí),GBT-WE對(duì)細(xì)胞的抑制作用明顯.因此,為了實(shí)現(xiàn)各組之間的差異性,通過(guò)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)確定后續(xù)用于干預(yù)實(shí)驗(yàn)的GBT-WE低劑量組為60μg/m L,GBT-WE高劑量組為240μg/m L.

圖2 GBT-WE對(duì)HepG2細(xì)胞增殖能力的影響

2.3 GBT-WE改善HepG2細(xì)胞脂肪變性

2.3.1 GBT-WE干預(yù)Hep G2細(xì)胞脂肪變性后的油紅O 染色

油紅染色顯示,與對(duì)照組相比,模型組細(xì)胞發(fā)生脂肪變性,細(xì)胞內(nèi)聚集了大量的紅色脂滴(P＜0.01),并存在脂滴融合現(xiàn)象,說(shuō)明脂肪變性模型建立成功；經(jīng)GBT-WE 干預(yù)后,與模型組相比,GBT-WE與Simvastatin處理后細(xì)胞中的紅色脂滴均有所降低(P＜0.01),說(shuō)明GBT-WE 可以有效地改善細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)積累,如圖3所示.

2.3.2 GBT-WE 抑制Hep G2細(xì)胞脂肪變性后TG和TC含量的增加

與正常對(duì)照組相比,模型組的TG、TC顯著升高.而加入不同質(zhì)量濃度的GBT-WE處理24 h之后,隨著茶濃度的增加,Hep G2細(xì)胞內(nèi)的TG、TC值相較于模型組都在逐漸下降,且劑量依賴性下降(P ＜0.01).特別地,240μg/m L 的GBT-WE 干預(yù)模型后細(xì)胞內(nèi)TG、TC水平與陽(yáng)性藥物Simvastatin效果相似,相較于對(duì)照組無(wú)明顯差異性(P＞0.05),見表2.

圖3 GBT-WE干預(yù)后各組細(xì)胞的油紅O 染色

表2 GBT-WE對(duì)各組細(xì)胞TG、TC表達(dá)的影響

2.3.3 GBT-WE抑制脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白SREBP1c、FAS的表達(dá)

SREBP1c是脂肪生成過(guò)程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,其下游目標(biāo)FAS主要調(diào)控脂肪酸的生物合成,在脂質(zhì)代謝中起到重要作用.Western blot法測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn):與對(duì)照組相比,模型組SREBP1c和FAS呈高表達(dá)(P＜0.01)；GBT-WE干預(yù)后,與模型組相比,SREBP1c和FAS的蛋白表達(dá)量降低,并且隨著GBT-WE的質(zhì)量濃度增加,其表達(dá)量逐漸降低,呈現(xiàn)藥物劑量-效應(yīng)關(guān)系.表明GBT-WE 改善細(xì)胞脂肪變性可能是通過(guò)SREBP1c/FAS信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的.如圖4所示.

圖4 GBT-WE對(duì)各組細(xì)胞SREBP1c、FAS蛋白表達(dá)的影響

3 討論

肝臟是脂質(zhì)代謝的重要器官[12].通過(guò)4 種主要途徑調(diào)節(jié):循環(huán)脂質(zhì)的攝取,從頭脂肪生成(De novo lipogenesis,DNL),脂肪酸氧化以及極低密度脂蛋白的脂質(zhì)輸出[13].NAFLD 的發(fā)生是由脂質(zhì)獲取和脂質(zhì)處理之間的不平衡引起的,一種或多種途徑的破壞都可能導(dǎo)致肝臟內(nèi)脂肪的聚集.研究表明,NAFLD患者的重要特征是DNL異常升高[14].在NAFLD 肥胖患者中,大約26%的肝甘油三酯來(lái)自DNL,這進(jìn)一步證實(shí)了DNL在NAFLD 中的重要性,表明DNL是潛在的治療靶標(biāo)[15].

DNL作為脂質(zhì)代謝的重要途徑,主要調(diào)節(jié)糖酵解,飽和脂肪酸以及TG的合成[16].SREBP1c 是DNL的轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)鍵因子,主要參與調(diào)控脂肪酸、TG 合成相關(guān)酶基因(乙酰輔酶A 羧化酶,FAS和硬脂酰輔酶A 去飽和酶等)的表達(dá)[17].其中,FAS是脂肪酸生物合成的限速酶,SREBP1c可與FAS的啟動(dòng)子結(jié)合以啟動(dòng)TG合成[18].這些肝臟脂肪生成轉(zhuǎn)錄因子的高表達(dá)可激活脂肪酸鏈合成,導(dǎo)致TG 過(guò)量合成和肝臟脂質(zhì)積聚.有研究發(fā)現(xiàn)SREBP1c表達(dá)在NAFLD 患者和動(dòng)物模型中增高,升高的SREBP1c促進(jìn)FAS 表達(dá)增加[19-20],而SREBP1c敲除小鼠中FAS則表達(dá)下降[21-22],也就是說(shuō)SREBP1c/FAS 系統(tǒng)在NAFLD 的發(fā)生與發(fā)展中起到關(guān)鍵作用.因此,阻斷SREBP1c/FAS的高表達(dá)將降低肝臟中TG的合成.

在周紅宇,陽(yáng)學(xué)風(fēng)[23]的實(shí)驗(yàn)中,用含有50%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)人肝L-O2細(xì)胞24 h后建立肝細(xì)胞脂肪變性模型,提示血清蛋白的過(guò)量使用能增加細(xì)胞內(nèi)TG的含量.所以在本實(shí)驗(yàn)中選擇Hep G2細(xì)胞為研究對(duì)象[24],用加入含有50%FBS的MEM培養(yǎng)基來(lái)處理Hep G2 細(xì)胞48 h,結(jié)果顯示細(xì)胞中的脂質(zhì)積累和TG 含量顯著增加,與脂肪肝細(xì)胞的形態(tài)學(xué)具有相似性,證實(shí)FBS誘導(dǎo)的Hep G2細(xì)胞脂肪變性模型適合于體外評(píng)估NAFLD.

盡管黑茶都具有一定的降脂減肥效果,但由于不同黑茶之間功能物質(zhì)組成及比例的差異,降脂減肥的作用效果也必定存在一定的差異.黑茶主要包括普洱茶、青磚茶、茯磚茶、千兩茶、黑磚茶、六堡茶等數(shù)十個(gè)品種.其中,大量關(guān)于普洱茶的研究顯示,普洱茶能夠降低PPAR-γ和SREBP-1c及其下游基因FAS、ACC的表達(dá),抑制肝臟脂肪酸吸收和脂肪合成,改善大鼠NAFLD 脂肪變性[25].傅冬和等對(duì)茯磚茶各部分萃取,發(fā)現(xiàn)對(duì)PPAR-γ、PPAR-δ均有激活作用,對(duì)FXR有抑制作用,從而實(shí)現(xiàn)降脂減肥功效[26].TG在肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的積累是NAFLD 的標(biāo)志[22].在以前的研究中同樣發(fā)現(xiàn)青磚茶的降脂作用顯著[9,27],但具體機(jī)制不明.在本研究中將青磚茶GBT-WE 用于干預(yù)肝脂肪變性模型從而評(píng)價(jià)GBT-WE青磚茶對(duì)體外NAFLD 的影響.同時(shí),使用Simvastatin作為抗脂質(zhì)積累的陽(yáng)性對(duì)照,已知Simvastatin不僅降低膽固醇,還可降低甘油三酯.在臨床研究中,Simvastatin可有效降低血清甘油三酯水平[28].研究結(jié)果顯示高濃度的FBS可刺激SREBP1c高表達(dá)并增強(qiáng)下游FAS表達(dá)導(dǎo)致脂肪過(guò)量合成.而GBT-WE則顯著減少了Hep G2細(xì)胞中脂質(zhì)的過(guò)度積累,降低了細(xì)胞內(nèi)TG、TC水平,極大地抑制了脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白SREBP1c及其下游目標(biāo)FAS 的表達(dá).由此可見,GBT-WE可通過(guò)SREBP1c/FASBS 信號(hào)通路減少?gòu)念^脂肪生成,從而抑制TG 的合成,最終對(duì)NAFLD 的發(fā)展起到保護(hù)作用,GBT-WE有望開發(fā)成為治療NAFLD的有效藥物.因此,后續(xù)還需進(jìn)行相關(guān)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步闡述其機(jī)制.