張 婷 曹文齋 羅 斌 鐘 森

腦梗死在全世界范圍內(nèi)，是導(dǎo)致患者致死、致殘的主要原因之一。在美國，每年發(fā)病人數(shù)超過790 000例，平均每4分鐘即有一人死于腦卒中[1]。腦梗死的死亡率目前在西方世界已出現(xiàn)下降的趨勢，可能是由于腦梗死的早期診斷，及時給予溶栓或介入治療，減少了患者致死、致殘率。腦梗死的診斷主要依賴于影像學(xué)檢查，CT對于缺血性梗死超早期的腦梗死價值有限，MRI由于檢查時間長，限制了在腦梗死早期診斷的應(yīng)用。因此，發(fā)現(xiàn)腦梗死早期診斷的標(biāo)志物，對于進一步降低患者死亡率極為重要。近年來研究表明，微小核糖核酸(microRNA，miRNA)可能是一個很有潛在價值的生化標(biāo)志物[2]，其可穩(wěn)定表達于血液中，并呈現(xiàn)組織特異性。miRNA在神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育和病理過程中亦發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[3]。在既往關(guān)于急性腦梗死的研究中發(fā)現(xiàn)[4-6]，在患者血液中能檢測到異常表達的miRNA，提示miRNA可能是急性腦梗死發(fā)病時的標(biāo)志物。但是這些研究普遍存在樣本量較小、受試對象不同、檢測技術(shù)的系統(tǒng)誤差，導(dǎo)致各研究結(jié)果間存在較大差異的問題，不能得出肯定的結(jié)果。本文通過Meta分析，對miRNA在急性腦梗死中的診斷效能進行系統(tǒng)評估，以期為臨床實踐和應(yīng)用提供參考。

資料與方法

1.文獻檢索策略 應(yīng)用計算機檢索Medline、PubMed、Embase、Cochrane Library Database、萬方數(shù)據(jù)庫、中國學(xué)術(shù)期刊網(wǎng)全文數(shù)據(jù)庫(CNKI)和維普數(shù)據(jù)庫(VIP)，檢索語種為中文和英文。主要的中英文檢索詞為腦梗死(cerebral infarction、brain infarction)、腦缺血(cerebral ischemia、brain ischemia)、微小RNA(microRNA、miRNA)、中風(fēng)(stroke)。通過閱讀題目及摘要，篩選納入研究的中英文文獻。以PubMed為例，具體檢索策略見如下：Search ((((((brain infarction[MeSH Major Topic]) OR cerebral ischemia[MeSH Major Topic]) OR stroke[MeSH Major Topic])) OR ((cerebral ischemia[Title/Abstract]) OR brain ischemia[Title/Abstract]))) AND ((MicroRNA[MeSH Major Topic]) OR miRNA[Title/Abstract])。檢索時限均為建庫至2018年12月，并追溯納入文獻的參考文獻。

2.文獻的納入級排除標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①評價miRNA在腦梗死診斷中的價值的文獻；②腦梗死的診斷以影像學(xué)(CT/MRI)為金標(biāo)準(zhǔn)；③研究提供足夠的數(shù)據(jù)滿足 2 × 2 四格表的構(gòu)建；④研究類型包括隊列研究和病例對照研究；⑤研究中每組病例數(shù)≥4。

(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①非人體試驗；②無對照組的試驗；③綜述、會議摘要；④不能提供完整數(shù)據(jù)的文獻；⑤重復(fù)發(fā)表的文獻

3.文獻資料的篩選、提取及評價 (1)文獻的篩選及提取 由2名研究者共同制定文獻的篩選標(biāo)準(zhǔn)，分別篩選、閱讀原始文獻標(biāo)題、摘要，在排除明顯不符合納入標(biāo)準(zhǔn)的文獻后對可能符合納入標(biāo)準(zhǔn)的文獻認真閱讀全文，以確定是否真正符合納入標(biāo)準(zhǔn)，最后2名研究者交叉核對文獻，如遇分歧可由第三者決定是否納入研究。提取內(nèi)容包括：①納入研究的基本信息：研究文獻題目、第一作者、發(fā)表年限等；②納入研究的基線特征：研究人群及地區(qū)、研究對象的例數(shù)、檢測方法及手段等；③診斷性試驗的相關(guān)指標(biāo)：靈敏度(SEN)及特異度(SPE)、或者真陽性值(true positive, TP)、假陽性值(false negative, FN)、真陰性值(true negative, TN)、假陰性值(false negative, FN)；④偏倚風(fēng)險評價關(guān)鍵要素。

(2)質(zhì)量評價 采用質(zhì)量評價工具(quality assessment of diagnostic accuracy studies,QUADAS)標(biāo)準(zhǔn)[7]進行文獻質(zhì)量評定，包括14個條目：疾病譜組成、選擇標(biāo)準(zhǔn)、金標(biāo)準(zhǔn)、疾病進展偏倚、部分參照偏倚、多重參照偏倚、混合偏倚、待評價試驗的實施、金標(biāo)準(zhǔn)的實施、試驗解讀偏倚、金標(biāo)準(zhǔn)解讀偏倚、臨床解讀偏倚、難以解釋的試驗結(jié)果和退出病例。評分細則為：若認為所選擇研究符合條目，則評價為“是”。若所選研究的選擇標(biāo)準(zhǔn)沒有明確報告，那么應(yīng)評價為“否”。若研究僅報告了部分選擇標(biāo)準(zhǔn)，并且現(xiàn)有信息不足以將該條目評價為“是”，則應(yīng)評價為“不清楚”。每一條目評價結(jié)果為“是”的記為1分，總分14分。

4.統(tǒng)計學(xué)方法 該研究采用Stata 14和Meta-Disc 1.4對納入文獻進行統(tǒng)計學(xué)分析。選取靈敏度、特異度、陽性似然比、陰性似然比和ROC效應(yīng)指標(biāo)進行該診斷試驗的Meta分析。采用Q統(tǒng)計量和I2檢驗評估異質(zhì)性，如果P<0.05(Q統(tǒng)計)或I2>50%，則采用隨機效應(yīng)模型計算合并效應(yīng)量，否則采用固定效應(yīng)模型。對于發(fā)表偏倚，采用Deek’s檢驗來評估納入的研究。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.納入研究的基本情況 初檢共獲得相關(guān)文獻982篇，經(jīng)過逐層篩選，最終納入的19篇文獻[4-6，8-23]，篩選流程圖見圖1。納入文獻包含26組miRNA，研究組和對照組共2580例，其中病例組1543例，對照組1037例。所有的患者都根據(jù)臨床癥狀結(jié)合影像學(xué)CT/MRI診斷為腦梗死，對照組為多數(shù)為健康的志愿者或體檢者。研究涉及24種miRNA的亞型。其中研究有17個在中國進行，1個在德國，1個在美國。所有研究采用qRT-PCR方法檢測miRNA表達水平。提取的相關(guān)信息參見表1。

表 1 納入 Meta 分析研究的文獻基本信息

圖1 文獻篩選的流程圖

2.納入研究的方法學(xué)質(zhì)量評價 利用QUADAS對19篇研究做出評價，文獻評價得分中位數(shù)： 11分，納入所有研究文獻評分均≥10分，文獻整體質(zhì)量較好。

3.異質(zhì)性分析和閾值效應(yīng) 采用Spearman檢驗計算真陽性率的對數(shù)值與假陽性率的對數(shù)值之間的相關(guān)系數(shù)和P值來排除閾值效應(yīng)。Spearman 相關(guān)系數(shù)為-0.030，P=0.881，提示不存在閾值效應(yīng)。診斷比值比的Cochran-Q值為132.17，I2值為80.3%，P<0.1，表明研究間存在異質(zhì)性，可能與對照人群、試驗方法等有關(guān)。因此，在該Meta分析中應(yīng)用DerSimonian-Laird法。

圖2 miRNA在急性腦梗死中的敏感度

圖3 miRNA在急性腦梗死中的特異度

圖4 miRNA在急性腦梗死中的陽性似然比

圖5 miRNA在急性腦梗死中的陰性似然比

圖6 miRNA在急性腦梗死中的診斷比值比

4.診斷價值評價 從合并的數(shù)據(jù)所做的森林圖看，異質(zhì)性較為明顯(I2>70%，P<0.1)，因此，采用隨機效應(yīng)模型用于評價miRNA在急性腦梗死中的診斷價值。整體miRNA診斷急性腦梗死的靈敏度為0.82(95%CI：0.80～0.83，圖2)，特異度為0.81(95%CI：0.79～0.83，圖3)，陽性似然比為5.19(95%CI：3.61～7.47，圖4)，陰性似然比是0.24(95%CI：0.20～0.30，圖5)，診斷比值比為24.01(95%CI：14.92～38.64，圖6)。SROC曲線的AUC為0.89，SROC 曲線顯示Q 值為0.82(圖7)。上述結(jié)果表明，miRNA對急性腦梗死具有較好的診斷價值。然而，由非閾值引起的異質(zhì)性能夠在診斷指標(biāo)的森林圖中清晰地觀察到，筆者試圖利用meta回歸(如種族人群、對照選擇和樣本來源等)來探索研究的特點。 因為在納入的研究中，miRNA均取采用qRT-PCR進行檢測，因此，檢測方法不是異質(zhì)性的來源。采用種族人群、對照選擇、樣本來源和miRNA類型進行meta回歸(P>0.05)，表明未找到異質(zhì)性的來源(表2)。研究采用Fagan列線圖描述miRNA對急性腦梗死的診斷效果(圖8)。結(jié)果表明，臨床檢測使用miRNA，檢測結(jié)果為陽性時，患者被診斷為急性腦梗死的概率由驗前概率20%上升至驗后概率59%，然而檢測結(jié)果陰性時，檢測者被診斷為非腦梗死患者的概率由驗前概率20%下降至驗后概率5%。由此可見，使用miRNA診斷腦梗死的精確性顯著提高。

圖7 miRNA在急性腦梗死中的SROC曲線

5.發(fā)表偏倚 發(fā)表偏倚被認為是影響診斷準(zhǔn)確性的又一因素。采用Deek’s檢驗用于評估納入文獻是否存在發(fā)表偏倚。納入19篇研究基本均勻分布在回歸線兩側(cè)。Deek’s檢驗的P=0.18，提示無明顯的發(fā)表偏移(圖9)。

圖8 miRNA診斷急性腦梗死的Fagan列線圖

圖9 采用Deek’s法檢驗納入研究的發(fā)表偏倚

表2 Meta回歸檢測異質(zhì)性的潛在來源

討 論

目前，腦血管造影是診斷腦血管疾病的金標(biāo)準(zhǔn)，但是由于其有創(chuàng)性及花費時間長，不利于在急性腦梗死中應(yīng)用。目前2018年美國心臟學(xué)會及卒中學(xué)會(AHA/ASA)[24]仍然推薦常規(guī)CT或MRI作為急性腦梗死的影像學(xué)檢查。然而，對于超急性期和急性期腦梗死，常規(guī)頭顱CT 很難發(fā)現(xiàn)缺血灶。且重癥患者行CT和MRI檢查存在轉(zhuǎn)運不便，過程中風(fēng)險較大的問題，有些醫(yī)療機構(gòu)不能提供及時的頭顱CT或MRI檢查，這些都限制了急性腦梗死的早期診斷。Chernyshev等[25]所做的研究發(fā)現(xiàn)，目前的急性腦梗死的診斷方法導(dǎo)致21%的非腦梗死患者錯誤接受了rt-PA的溶栓治療。因此，很多研究試圖發(fā)現(xiàn)更好的針對急性腦梗死的診斷方法。Brunser等[26]對DWI用于急性缺血性腦卒的診斷價值進行研究，發(fā)現(xiàn)DWI診斷腦梗死的靈敏度為87.3%，特異度為99%。但是由于MRI花費時間長，限制了其應(yīng)用。某些血清生物標(biāo)志物(包括S100 蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(Cystatin C)和神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)的變化可以反映急性腦梗死的嚴重程度、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸。然而，這類蛋白質(zhì)生物標(biāo)記物由于組成復(fù)雜，且易受環(huán)境影響降解、變性，缺乏特異性[27-29]。所以，其在臨床應(yīng)用亦存在局限性。

miRNA是一類小子非編碼RNA，它調(diào)節(jié)廣泛基因的表達，并在各種生物功能中發(fā)揮重要作用。miRNA與腦梗死的相關(guān)證據(jù)主要來源于動物模型中調(diào)控機制研究及臨床研究中的表達差異[23, 30]，提示miRNA可能成為急性腦梗死的新型生物學(xué)標(biāo)志物和治療靶點，但是由于缺乏大量的臨床研究樣本，其診斷效果仍不明確。本研究發(fā)現(xiàn)在急性腦梗死患者和對照人群血液中整體miRNA的表達水平不一致，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。通過篩選，共納入19篇文章，2 580例研究對象。結(jié)果顯示：采用miRNA診斷急性腦梗死的SEN為0.82，SPE為0.81，說明漏診率為18%，誤診率19%。PLR為5.19，提示急性腦梗死患者miRNA檢測陽性的概率比正常人群檢測陽性的概率高5.19倍。NLR為0.24，提示miRNA檢測結(jié)果為陰性的人群中，24%的人有可能是患有急性腦梗死的，因而不能完全排除急性腦梗死。DOR值為24.01，提示miRNA具有較高的鑒別急性腦梗死的能力。AUC值為0.89，表明其診斷效能較高。本研究結(jié)果顯示在診斷人群中，miRNA的SEN變化范圍不大(0.80 ～0.83)，提示該診斷穩(wěn)定性較好，又因miRNA檢查方便快捷，所以miRNA是診斷急性腦梗死較好的手段。

本研究不足之處在于:首先miRNA檢驗急性腦梗死的研究近年來才剛剛起步，相關(guān)報道較少，雖然盡可能采取多種途徑廣泛收集國內(nèi)外文獻，但由于本文只檢索了中、英文文獻，所以部分國家及地區(qū)的文獻不能納入，可能造成了一些文獻的缺失。此外，本研究的對照人群，多數(shù)為健康對照，可能與現(xiàn)實世界中的急性腦梗死的相似人群有差異，因此在應(yīng)用本研究的結(jié)論時需要特別注意。另外，不同的研究中，樣本處理及儲存的時間、方式的不同，診斷試驗所用試劑和儀器的不同，實驗者的不同及腦梗死患者梗死部位及嚴重程度的不同，都使各研究存在一定的異質(zhì)性，影響了Meta分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。在今后的診斷性試驗研究中，應(yīng)明確應(yīng)明確研究對象的選擇標(biāo)準(zhǔn)，還應(yīng)保證試驗過程中的盲法。

綜上所述，miRNA檢測對急性腦梗死有較好的預(yù)測作用。但受納入研究數(shù)量和質(zhì)量的限制，上述結(jié)論尚待更多高質(zhì)量研究予以驗證。