朱恒 王超 張一馳

摘 要：以殼聚糖為制備原料，利用殼聚糖酶水解殼聚糖來制備殼寡糖。通過單因素試驗結果分析可以得出反應時間、殼聚糖酶添加量、溫度、pH等4個因素對酶解作用的影響。采用正交法設計4因素3水平的試驗，將殼寡糖產(chǎn)率作為檢測結果，做正交試驗分析，優(yōu)化工藝條件，從正交分析結果得到最佳工藝條件如下：反應時間4h、酶添加量2000U/g、溫度35℃、pH5.0。通過驗證試驗可以得到最佳工藝條件下還原糖濃度最高，即殼寡糖的產(chǎn)率最高，為1.884%。利用殼寡糖對清除羥自由基的能力試驗和還原能力試驗，驗證了殼寡糖具有一定的抵抗人體氧化衰老的能力。

關鍵詞：殼聚糖酶;殼寡糖;正交試驗;抗氧化

中圖分類號 TS201.3文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2020）06-0028-05

Abstract： In this experiment， chitosan was used as a raw material to prepare chitosan oligosaccharides by using chitosanase to hydrolyze chitosan. Observing the results of single factor experiments， we can conclude that the reaction time， the amount of chitosan enzyme， temperature， and pH affect the enzymatic hydrolysis. The orthogonal experiment was used to design the four-factor three-level experiment. The chitosan oligosaccharide yield was taken as the test result. The orthogonal experimental analysis was conducted to optimize the process conditions. The optimum process conditions from the orthogonal analysis results were as follows： reaction time 4 h， enzyme Adding amount 2000 U/g， temperature 35℃， Ph5.0. Through verification experiments， the highest concentration of reducing sugars can be obtained under the optimal conditions， that is， the highest yield of chitosan oligosaccharides is 1.884%. Experiments using the ability of chitosan oligosaccharides to scavenge hydroxyl radicals and experimental studies of reducing power have demonstrated that chitooligosaccharides have a certain ability to resist oxidative aging in humans.

Key words： Chitosanase; Chitosan oligosaccharide; Orthogonal test; Antioxidation

殼寡糖（Chitosan oligosaccharide），又名寡聚氨基葡糖、甲殼低聚糖，是2～10個氨基葡萄糖通過β-1，4糖苷鍵連接起來的小分子聚合物[1]。殼寡糖是殼聚糖的水解產(chǎn)物，其在水中的溶解度好，生物可利用度高，具有獨特的生理活性和功能，現(xiàn)已廣泛應用于食品、生物醫(yī)藥和化妝品中[2-3]。殼寡糖具有一定的還原性，由于還原能力越強，抗氧化衰老的能力就越強，使得其具有較強的抗氧化活性。殼寡糖抗氧化性的應用廣泛，目前已在動物飼料和食品安全，蔬果的貯藏和保鮮以及醫(yī)藥保健等方面發(fā)揮著重要的作用，尤其是在生物醫(yī)藥與保健領域。由于殼寡糖具有良好的抗氧化活性，為其在降脂、降糖以及肝功能保護方面提供了良好的應用前景[4]。但由于當前殼寡糖在制備方面還沒有多大的突破，產(chǎn)量過低，從而導致價格過高，因此，提高其制備產(chǎn)量的方法已成為了國內(nèi)外研究和開發(fā)的熱點。

目前，對殼聚糖的降解方法大致分為酸降解法、酶降解法和氧化降解法3大類[5]。其中，酸降解法的工藝繁瑣，反應產(chǎn)物單糖較多，殼寡糖產(chǎn)率較低，并且不易操作控制，對環(huán)境具有一定的污染;酶降解法反應條件溫和，無其他副反應，易操作控制，是工業(yè)化制備殼寡糖最具前景的方法。酶降解法一般可分為非專一性酶降解和專一性酶降解[6，8]，其中非專一性酶包括脂肪酶、纖維素酶[7]等對殼聚糖的降解不充分，對酶的消耗量大，產(chǎn)物復雜且很難分離;專一性酶包括殼聚糖酶、甲殼質(zhì)酶等的反應條件適宜，容易調(diào)控，是一種很好的殼寡糖制備方法。殼聚糖經(jīng)殼聚糖酶降解后生成殼寡糖，殼聚糖酶在降解殼聚糖多聚物，大規(guī)模生產(chǎn)殼寡糖中發(fā)揮著重要的作用[9-13]。

本試驗以殼聚糖作為原料，對其進行酶解制備殼寡糖，通過單因素試驗和正交試驗的結果構建制備殼寡糖工藝條件的數(shù)學模型，由此得出優(yōu)化的最佳工藝條件組合，再利用殼寡糖對清除羥自由基的能力的試驗和其還原能力的試驗來考察其抗氧化能力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 殼聚糖（脫乙酰度80%），北京中生瑞泰科技有限公司生產(chǎn);殼聚糖酶（酶活力40000U/g），諾維信生物科技有限公司生產(chǎn);三氯乙酸（分析純），上海展云化工有限公司生產(chǎn);D-氨基葡萄糖，SIGMA公司生產(chǎn);氫氧化鈉、無水亞硫酸鈉、乙酸鈉、乙酸、3，5-二硝基水楊酸、苯酚、鐵氰化鉀、磷酸二氫鉀等，國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn)。

1.2 儀器 DL-5低速大容量離心機，上海安亭科學儀器廠生產(chǎn);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52A，上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn);紫外-可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司生產(chǎn);DK-S22型電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司生產(chǎn);電熱鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司生產(chǎn);電子天平，上海?？惦娮觾x器廠生產(chǎn)。

1.3 試驗方法

1.3.1 還原糖標準曲線的繪制 參照劉玥等[14]的方法進行DNS試劑和氨基葡萄糖標準液（1.0mg/mL）的配制，得到標準曲線如圖1所示?；貧w方程為：y=0.7155x-0.0265，R2=0.9981，作為定量分析的標準曲線。

1.3.2 殼寡糖的制備 精密量稱量2.0g的殼聚糖于500mL燒杯中，加入一定量的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液（0.2mol/L），攪拌形成膠體溶液，固定底物濃度為2%（w/v），再加入一定量的殼聚糖酶酶解殼聚糖。通過加入緩沖溶液的體積不同，可以使燒杯中溶液置于不同pH值下。分別在不同溫度、不同pH、不同酶添加量下酶解一段時間，之后迅速把酶解液置于100℃沸水中，保持5min使酶滅活，然后離心取上清液，測出上清液中的還原糖濃度，計算殼寡糖的產(chǎn)率，然后將上清液過濾純化，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮過濾液，當濃縮掉2/3過濾液后，將剩余的過濾液使用無水乙醇洗滌后，烘干得到殼寡糖。

1.3.3 還原糖含量的檢測 酶解液中還原糖含量的測定方法與上述標準曲線的制定方法一致，將氨基葡萄糖標準溶液改為待測樣品，其他步驟不變，得到相應的還原糖濃度。殼寡糖提取率的計算公式如下：

殼寡糖產(chǎn)率（%）=還原糖含量/殼聚糖含量×100

1.3.4 清除羥基自由基的能力測定 取5支試管，編號為1～5，準確量取0.2mL的FeSO4-EDTA混合液（10.0mmol/L）加入到每支試管中，并再分別向每支試管加入0.5mL的2-脫氧核糖溶液（10.0mmol/L）、0.5mL磷酸緩沖液（0.1mol/L pH7.4）、0.2mL的H2O2溶液（10.0mmol/L）和0.6mL一定濃度的殼寡糖溶液（濃度梯度分別為0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL），混合均勻，放入37℃水浴鍋中水浴1h后，向每支試管加1.0mL的2.8%（w/w）三氯乙酸溶液，在離心速度為4000r/min和離心溫度4℃條件下離心20min，均量取上清液2.0mL相對應的放入編號①～⑤的試管中，向編號①～⑤的每支試管加入1.0mL的1.0%（w/w）硫代巴比妥酸溶液后，混合均勻，在沸水中水浴15min，冷卻后稀釋5倍，將可見紫外分光光度計的波長調(diào)為532nm，分別測出編號①～⑤的每支試管溶液的吸光度。羥自由基清除率的計算公式如下：

清除率（%）=（Ac-As）/（Ac-A0）×100

式中：Ac：不加殼寡糖的吸光度;As：加殼寡糖的吸光度;A0：試劑空白的吸光度。

1.3.5 還原能力的測定 準確量取0.6mL 200mmol/L的pH6.6磷酸緩沖溶液加入到燒杯中，再分別加入0.6mL一定濃度的殼寡糖溶液（濃度梯度分別為0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL）和2.5mL 1%鐵氰化鉀（質(zhì)量分數(shù)為1%），混合均勻，在50℃水浴鍋中水浴20min，快速冷卻，加入0.6mL三氯乙酸（質(zhì)量分數(shù)為10%），在離心速度為4000r/min和離心溫度4℃條件下離心10min，量取上清夜1mL，分別加入1mL的水和0.2mL三氯化鐵（質(zhì)量分數(shù)為0.1%），混勻后靜置10min，將可見紫外分光光度計的波長調(diào)為700nm，測定吸光度。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 溫度對酶解制備殼寡糖效果的影響 在酶濃度為1600U/g，反應時間2h，pH5.4的酶解條件下，得到殼聚糖酶在不同溫度下水解殼聚糖的效果，結果如圖2所示。從圖2可以看出，還原糖濃度隨溫度的上升而呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢。其中，在30～35℃，還原糖濃度隨溫度的上升而緩慢增加;在35～40℃，還原糖濃度隨溫度的上升而急劇增加，且在40℃還原糖濃度達到最高;當溫度高于40℃，還原糖濃度開始下降，且隨著溫度的持續(xù)增加，還原糖濃度越來越低。因此，溫度在40℃左右時，制備殼寡糖的效果最好。該酶在酶添加量1600U/g，反應時間2h，pH5.4的酶解條件下的最適溫度為40℃。其原因可能是隨溫度的不斷增加，酶的活性也隨之增加，酶解的速率加快，提高了還原糖濃度。而當溫度高于40℃時，酶的活性開始出現(xiàn)下降趨勢，導致還原糖濃度下降。

2.1.2 pH對酶解制備殼寡糖效果的影響 在酶濃度為1200U/g，反應時間2h，溫度40℃的酶解條件下，得到殼聚糖酶在不同pH下水解殼聚糖的效果，其結果如圖3所示。從圖3可以看出，還原糖濃度隨pH的增加而呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。其中，在pH3.8～4.2，還原糖濃度隨pH的上升而緩慢增加;在pH4.2～5.0，還原糖濃度隨pH的上升而急劇增加，并且在pH5.0時還原糖濃度達到最高;當pH超過pH5.0，還原糖濃度開始逐漸下降。因此，pH在5.0左右的范圍，酶解效果較好。這說明，pH對酶解制備殼寡糖效果具有極顯著的影響，并且殼聚糖酶降解的最適pH為5.0。其可能原因是隨pH的增加且未到達最適pH之前，酶活性逐漸增加，反應速率加快;當pH過高，超過最適pH，酶的活性開始下降直至酶失活，酶解速率下降。

2.1.3 反應時間對制備殼寡糖酶解作用的影響 在酶濃度1600U/g，pH5.0，溫度40℃的酶解條件下，得到殼聚糖酶在不同反應時間下水解殼聚糖的效果，其結果如圖4所示。從圖4可以看出，隨著反應時間的增加，還原糖濃度也逐漸增加，在1～3h范圍內(nèi)還原糖濃度上升速率較快，而在3～4h范圍內(nèi)上升緩慢，在酶解4h時，降解效果最好，還原糖濃度升到最高，隨著酶解時間的不斷增加，還原糖濃度有小范圍的下降。因此，酶解時間4h為最優(yōu)選擇。

2.1.4 酶添加量對制備殼寡糖酶解作用的影響 在反應時間2h，pH5.0，溫度40℃的酶解條件下，得到殼聚糖酶在不同殼聚糖酶濃度下水解殼聚糖的效果，其結果如圖5所示。所用殼聚糖酶酶活性為40000U/g，固定底物濃度為2%（w/v），改變殼聚糖酶用量觀察酶濃度對酶解效果的影響。從圖5可以看出，在400～800U/g，還原糖濃度變化不明顯，有緩慢上升;在800～2000U/g，還原糖濃度上升較快;當酶添加量超過2000U/g時，還原糖濃度開始有小范圍的下降。由此可見，酶添加量對制備殼寡糖的酶解效果產(chǎn)生了影響，可能的原因是當酶添加量沒有達到酶與底物的結合飽和之前，隨酶添加量的增加，酶解的反應速率也會加快，還原糖濃度升高，當酶與底物的結合達到飽和后，無論酶添加量再如何增加，還原糖濃度也不會增加。

2.2 正交試驗及結果

2.2.1 正交試驗設計 根據(jù)上述單因素的分析結果，選擇溫度、反應時間、殼聚糖酶添加量、pH4個因素作為考察因素，各取3個水平，進行[L9]（[34]）正交試驗設計，優(yōu)化酶解工藝條件，不考慮各因素間的相互影響，正交試驗因素水平表如表1所示。

2.2.2 正交試驗結果 在單因素試驗的基礎上，通過正交實驗結果分析可得出不同水平的溫度、pH、反應時間、酶添加量的組合對殼聚糖酶降解殼聚糖的降解效果不同，其結果見表2。從表2可以看出，在正交試驗的9組不同因素組合的實驗中，A2B1C2D3組合的酶解效果最好，其酶解液中的還原糖濃度最高。并且由極差結果分析可知影響酶解殼聚糖效果的因素為pH>酶添加量>反應時間>溫度。由均值1、均值2、均值3聯(lián)合分析可知，利用殼聚糖酶降解殼聚糖制備殼寡糖的最優(yōu)工藝組合為A1B1C2D2，即溫度35℃、pH5.0、酶添加量2000U/g、反應時間4h。

對上述正交試驗數(shù)據(jù)進行方差分析，可得方差分析結果如表3所示。從表3可以看出，pH對殼聚糖的酶解效果有著極強的顯著性，說明pH對殼聚糖酶法降解的影響極其顯著;而殼聚糖酶濃度對殼聚糖的酶解效果有顯著性，但不是很強，說明殼聚糖酶濃度對殼聚糖酶法降解的影響顯著，但無法與pH相比，溫度和反應時間對殼聚糖的酶解效果都無顯著性，說明溫度和反應時間對殼聚糖酶法降解有一定的影響，但影響較小。

2.3 驗證試驗 根據(jù)正交試驗得到的殼聚糖酶法降解的最優(yōu)工藝條件，與實際可操作條件結合，選取溫度35℃，殼聚糖酶濃度2000U/g，反應時間4h，pH5.0條件進行3次平行試驗，其結果見表4。從表4可以看出，在上述正交試驗結果分析得出的最優(yōu)的酶解工藝組合A1B1C2D2下，還原糖濃度為0.379mg/mL，殼寡糖產(chǎn)率為1.884%，高于正交試驗的第4組實驗A2B1C2D3的還原糖濃度0.352mg/mL，且產(chǎn)率穩(wěn)定，驗證了實驗的可行性和可重復操作性。

2.4 抗氧化試驗 不同濃度的殼寡糖對羥基自由基的清除活性和還原能力如圖6和圖7所示。從圖6可以看出，殼寡糖對羥基自由基具有一定的清除效果，并且清除效果隨殼寡糖濃度的上升而不斷增強，且呈現(xiàn)一定的劑量效應關系。當殼寡糖濃度為1mg/mL時，清除率為51.52%。

還原能力表示的是抗氧化物質(zhì)提供電子能力的重要指標[19]，可提供可阻斷二價鐵離子向三價鐵離子轉(zhuǎn)變的電子，使自由基變成穩(wěn)定的物質(zhì)。因此，可以通過顯色反應來判斷還原程度，反應后吸光度越大，還原能力越強，抗氧化能力也越強[20]。從圖7可以看出，在一定的殼寡糖濃度范圍內(nèi)，殼寡糖的還原能力隨著濃度的增加而增大，也進一步說明了殼寡糖具有一定的抗氧化活性。

3 結論

本研究以溫度、pH、殼寡糖酶添加量、反應時間為因素，分析了酶解殼聚糖制備殼寡糖的最佳工藝條件。根據(jù)單因素試驗結果，將溫度、pH、殼寡糖酶添加量、反應時間作為考察因素，進行正交試驗。由正交試驗結果分析可以得出，酶添加量和pH均對酶解殼聚糖制備殼寡糖產(chǎn)生了較大的影響，其中pH的影響最為顯著;影響酶解效果的因素主次依次為：pH>酶添加量>反應時間>溫度;利用殼聚糖酶降解殼聚糖制備殼寡糖的最優(yōu)工藝組合為A1B1C2D2，即溫度35℃、pH5.0、酶添加量2000U/g、反應時間4h。在此條件下，對最優(yōu)工藝組合進行驗證，證實了優(yōu)化工藝是合理的，具有可重復操作性。另外，為了研究酶解殼聚糖制備的殼寡糖的體外抗氧化活性，通過其對羥基自由基的有一定的清除能力和還原能力，表明殼寡糖具有一定的抗氧化衰老能力。

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（責編：張宏民）