魏躍　陳景景　鄭宏偉　許建　顏志明　孫朋朋

摘要：為創(chuàng)制矮牽牛三倍體種質(zhì)并對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞學(xué)研究，以矮牽牛二倍體、四倍體為親本進(jìn)行正反雜交，對(duì)雜交后代進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)并與雙親進(jìn)行農(nóng)藝性狀、解剖學(xué)比較，采用常規(guī)壓片法對(duì)三倍體花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)行觀察。結(jié)果表明：（1）以二倍體、四倍體為親本進(jìn)行正反雜交可獲得三倍體矮牽牛，但結(jié)籽率均較低;（2）同源三倍體終變期大部分細(xì)胞內(nèi)都出現(xiàn)單價(jià)體、二價(jià)體和三價(jià)體共存的現(xiàn)象，中期Ⅰ和中期Ⅱ出現(xiàn)游離在赤道板外的染色體，后期Ⅰ染色體有10/11、9/12、8/13和少數(shù)7/14分離方式，并出現(xiàn)姊妹染色單體提前發(fā)生分離和丟失染色體等異常現(xiàn)象?；ǚ勰讣?xì)胞減數(shù)分裂異常導(dǎo)致了大量不育花粉的形成，同源三倍體創(chuàng)制為初級(jí)三體系選育奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：矮牽牛;同源三倍體;染色體;花粉;減數(shù)分裂

中圖分類號(hào)： S681.601

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）02-0131-05

收稿日期：2018-12-19

作者簡(jiǎn)介：陳景景（1996—），女，江蘇徐州人，主要從事園藝花卉育種與栽培研究。E-mail：695355008@qq.com。

通信作者：魏 躍，博士，教授，主要從事園藝花卉細(xì)胞學(xué)與遺傳育種研究。E-mail：1069125418@qq.com。

同源三倍體為植株細(xì)胞具有三套來源相同的染色體組，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，不但可用于雜種優(yōu)勢(shì)和無籽果實(shí)的生產(chǎn)[1]，還可作為介質(zhì)合成單體、三體等各種非整倍體遺傳材料[2-3]，其中單體、三體是進(jìn)行基因定位、確定連鎖群與染色體關(guān)系研究的重要遺傳材料[4]。同源三倍體一般是通過二倍體、四倍體雜交獲得，在橙子[5]、西瓜[6]、甜瓜[6]、葡萄[7]、結(jié)球甘藍(lán)[8]等作物上都已有成功報(bào)道。

矮牽牛（Petunia hybrida Vilm.）為茄科矮牽牛屬1年生草本花卉，是目前廣泛應(yīng)用的重要花壇花卉之一。近年來，國內(nèi)研究人員已對(duì)矮牽牛開展了聚類分析[9]、花藥培養(yǎng)[10]、基因克隆[11-12]、遺傳轉(zhuǎn)化[13]和多倍體[14]等多方面研究，但關(guān)于三倍體種質(zhì)創(chuàng)制及相關(guān)細(xì)胞學(xué)研究還沒有過報(bào)道。

本研究以二倍體、四倍體矮牽牛為材料進(jìn)行同源三倍體矮牽牛種質(zhì)創(chuàng)制，并對(duì)其花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)行觀察和分析，這不僅豐富了矮牽牛種質(zhì)資源創(chuàng)制及相關(guān)細(xì)胞學(xué)內(nèi)容，也為系列初級(jí)三體等非整倍體創(chuàng)制和細(xì)胞遺傳學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

同源四倍體材料07-12為江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院花卉遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新課題組培育，二倍體品種夢(mèng)幻（藍(lán)色）來源于浙江虹越花卉股份有限公司，后經(jīng)過多代自交保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 同源三倍體的獲得與鑒定 2015—2016年3月在江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院園藝試驗(yàn)基地（119.17°E、31.95°N）播種07-12和夢(mèng)幻，6月上旬2個(gè)親本進(jìn)入花期后以07-12、夢(mèng)幻分別為父母本進(jìn)行正反雜交，每次分別授粉50朵，重復(fù)3次，7～10 d后統(tǒng)計(jì)坐果率，23～35 d后統(tǒng)計(jì)單果結(jié)籽數(shù)，同時(shí)2個(gè)親本分別自交作為對(duì)照。坐果率=果實(shí)數(shù)/授粉花朵數(shù)×100%;單果結(jié)籽數(shù)=飽滿種子數(shù)/果實(shí)數(shù)。

2016—2017年3月播種矮牽牛F1雜交種子，5月中旬F1植株進(jìn)入花期后，于晴天08：00—10：00取長(zhǎng)度0.5～1.0 cm的幼小花蕾，參考張紅梅等的方法[15]進(jìn)行預(yù)處理、固定、水浴和染色等操作，切開子房取中心部位少量分生組織常規(guī)壓片，觀察有絲分裂中期分裂相進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)。

1.2.2 三倍體與父母本農(nóng)藝性狀和解剖學(xué)比較 觀察記錄F1三倍體與父母本植株的株高、冠幅、萼片等農(nóng)藝性狀并進(jìn)行比較分析;將葉片背面表皮用鑷子撕下在40倍顯微鏡下用帶有標(biāo)尺的目鏡測(cè)量氣孔大小[16];取同源三倍體矮牽牛F1植株成熟花粉粒于載玻片上，用1%醋酸洋紅染色3～5 min，在光學(xué)顯微鏡下觀察。以染色深、大小正常、外形圓的為可育花粉，不染色或染色淺、外形皺縮畸形的為敗育花粉[17]，統(tǒng)計(jì)可育花粉率，可育花粉率=可染花粉數(shù)/花粉總數(shù)×100%。

1.2.3 同源三倍體減數(shù)分裂觀察 矮牽牛F1三倍體植株進(jìn)入開花期后，于晴天08：00—10：00取長(zhǎng)度4～7 mm的幼蕾，按照同源四倍體花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂觀察方法[18]進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 同源三倍體的獲得與子代染色體分布

獲得同源三倍體雜種的途徑通常都以同源二倍體、四倍體為親本進(jìn)行正反交。由表1可知，以矮牽牛四倍體07-12、二倍體夢(mèng)幻為雜交親本的正交坐果率為72%，反交坐果率為64%，授粉后結(jié)果率均較高，表明二倍體、四倍體正反交均能較好地完成授粉受精，子房能夠正常生長(zhǎng)膨大;而正反交果實(shí)中含有發(fā)育正常的種子數(shù)均很少，正交單果種子數(shù)1.2個(gè)，反交為1.0個(gè)，與四倍體07-12自交單果種子數(shù)73個(gè)、二倍體夢(mèng)幻自交207個(gè)相差很大，這表明正反交胚胎在發(fā)育過程中絕大多數(shù)都發(fā)生了敗育，不能夠形成正常種子。

對(duì)雜交F1后代植株的染色體數(shù)目進(jìn)行觀察，由表2可知，正交后代中檢測(cè)的9株中有6株為2n=21的三倍體（圖1-1），還有2n=20、2n=22的非整倍體各1株和2n=28的四倍體1株;反交后代檢測(cè)的6株中有3株為2n=21的三倍體，還有2n=22的非整倍體1株、2n=14的二倍體和2n=28的四倍體各1株。雜交后代中都出現(xiàn)了少量四倍體，正交是因?yàn)槎扼w父本產(chǎn)生了少量2n花粉，反交中則為二倍體母本產(chǎn)生了少量2n卵細(xì)胞。

2.2 三倍體與父母本農(nóng)藝性狀和解剖學(xué)比較

由表3可知，同源三倍體F1冠幅、主莖粗、萼片寬均顯著或極顯著大于雙親，而株高、花瓣直徑、萼片長(zhǎng)度偏向于數(shù)值較大的雙親中的一方，且與之差異不顯著，葉片長(zhǎng)度與寬度、柱頭直徑、氣孔長(zhǎng)度與寬度和花粉直徑介于雙親之間，花色則與父母本都不相同（圖2）?？捎ǚ勐室訤1三倍體最低，為44.7%，花粉外觀形態(tài)有圓形、三角形和四邊形（圖1-2），二倍體夢(mèng)幻最高，為95.2%，外觀形態(tài)以圓形和三角形為主（圖1-3），四倍體07-12為76.5%，以四邊形為主（圖1-4）。

2.3 三倍體花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂觀察

三倍體矮牽?；ǚ勰讣?xì)胞的減數(shù)分裂過程基本符合二倍體植物減數(shù)分裂的規(guī)律，包括2次連續(xù)的核分裂和1次同時(shí)細(xì)胞質(zhì)分裂，但也有一些異?，F(xiàn)象。

前期Ⅰ的細(xì)線期染色體成細(xì)絲狀（圖1-5），雙線期染色體開始縮短變粗，配對(duì)的同源染色體開始排斥分離，7個(gè)長(zhǎng)線狀染色體呈現(xiàn)0、U、N、S、9、ǒ等形狀（圖1-6）。終變期染色體進(jìn)一步短縮，36.7%的細(xì)胞核內(nèi)分布著7個(gè)同源配對(duì)的三價(jià)體， 多呈現(xiàn)棒狀、U形或Y形（圖1-7），其余大部分細(xì)胞核內(nèi)都出現(xiàn)單價(jià)體、二價(jià)體和三價(jià)體混合共存的現(xiàn)象（圖1-8），經(jīng)統(tǒng)計(jì)平均單價(jià)體為3.8，二價(jià)體為3.2，三價(jià)體約為3.6。

中期Ⅰ：大多數(shù)細(xì)胞染色體排列在赤道板上（圖1-9、圖1-10），也有約6.2%的少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)游離在赤道板外染色體（圖1-11）。通常在此期，二價(jià)體即將解離成2個(gè)單價(jià)體（圖1-9），三價(jià)體將解離成二價(jià)體和單價(jià)體（圖1-10）。

后期Ⅰ：二價(jià)體、三價(jià)體配對(duì)的同源染色體分別呈現(xiàn) 1 ∶1 和1 ∶2分離，由紡錘絲隨機(jī)牽引至兩極，未配對(duì)的單價(jià)體則隨機(jī)牽引至兩極中的任一極，因此導(dǎo)致兩極的染色體數(shù)目不等。觀察了318個(gè)花粉母細(xì)胞，有10/11（圖1-12）、9/12（圖1-13）、8/13（圖1-14）和7/14（圖1-15）多種分離方式，經(jīng)統(tǒng)計(jì)，其比率分別為57.9%、32.4%、8.4%和1.3%。

后期Ⅰ中染色體不均等分離將導(dǎo)致各種非整倍體配子形成，為創(chuàng)制系列非整倍體提供了可能[19]，其中可利用8/13分離通過回交直接獲得初級(jí)三體[17]，而7/14則是獲得2n配子的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)[20]。后期Ⅰ姊妹染色單體一般不分離，但少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)姊妹染色單體提前發(fā)生分離（圖1-14至圖1-18），其中有位于同極的1對(duì)姊妹染色單體提前發(fā)生分離（圖1-14），1對(duì)（圖1-16）和2對(duì)（圖1-17）姊妹染色單體提前發(fā)生分離分別牽引至兩極，還有提前分離的姊妹染色單體（圖1-18）和單價(jià)體（圖1-19）滯留在主核外成為丟失染色體，丟失染色體將導(dǎo)致微核形成。

末期Ⅰ：存在落后和丟失染色體（圖1-20）和染色體橋現(xiàn)象（圖1-21）。

中期Ⅱ：大部分細(xì)胞2組染色體分別排列在各自的赤道板上，約有10.4%的細(xì)胞出現(xiàn)赤道板外染色體（圖1-22）。

后期Ⅱ：大多數(shù)細(xì)胞中2組染色體的姊妹染色單體正常分離移向四極，觀察到主要有10/10/11/11（圖1-23）、9/9/12/12（圖1-24）、8/8/13/13（圖1-25）染色體分離方式，經(jīng)統(tǒng)計(jì)，其比率分別為53.6%、37.1%、9.3%。

末期Ⅱ：存在落后和丟失染色體（圖1-26）。

四分體時(shí)期：正常四分體比率約為86.7%，主要有四面體型和平行型2種類型（圖1-27）。減數(shù)分裂過程中滯留在細(xì)胞質(zhì)的丟失染色體往往導(dǎo)致微核形成，觀察到具有1～2個(gè)微核的四分體（圖1-28）。

對(duì)三倍體花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂的中期Ⅰ、后期Ⅰ、末期Ⅰ、中期Ⅱ、末期Ⅱ和四分體6個(gè)時(shí)期染色體異常行為進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明，各時(shí)期平均約有8.6%的花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂表現(xiàn)異常（表4）。

3 討論與結(jié)論

獲得植物同源三倍體的途徑主要是通過二倍體、四倍體進(jìn)行雜交，而二倍體、四倍體雜交不稔或稔性低是普遍存在的現(xiàn)象，如大白菜[21]、白菜[22]就未能獲得同源三倍體， 谷子三倍體結(jié)籽率為0.24%[23]、甘藍(lán)為3.61%[24]、菜薹僅為0.37粒/莢[25]。本試驗(yàn)中以二倍體、四倍體矮牽牛作親本進(jìn)行正反雜交均能夠獲得較高的坐果率，但單果結(jié)籽數(shù)均較低，表明正反雜交柱頭能夠接受花粉受精，子房能正常膨大，但胚胎發(fā)育成種子過程中均存在嚴(yán)重障礙。對(duì)菜薹胚胎學(xué)研究表明，三倍體胚胎敗育是由于胚乳的衰退失去了養(yǎng)分來源，同時(shí)內(nèi)珠被細(xì)胞迅速壞死阻塞營養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸通道[25]，矮牽牛三倍體敗育具體原因還有待對(duì)胚胎的發(fā)育過程進(jìn)行研究。

同源三倍體矮牽牛的花藥大都能正常開裂，花粉較多，可育率為44.7%，作為父本與二倍體雜交都有較高的結(jié)籽率。一般認(rèn)為，三倍體的育性與染色體基數(shù)有關(guān)，染色體基數(shù)少的物種產(chǎn)生具完整染色體組配子的概率較大，育性較高。但黃瓜和矮牽牛染色體基數(shù)都為x=7，而黃瓜同源三倍體花粉可育率僅有18.8%[17]，谷子染色體組基數(shù)為x=9，甘藍(lán)為 x=10，谷子三倍體幾乎沒有生活力花粉[23]，甘藍(lán)同源三倍體花粉生活力卻高達(dá)65.49%[24]，可見染色體基數(shù)數(shù)量不是決定因素。三倍體矮牽牛后期Ⅱ由染色體分離方式7/7/14/14形成完整染色體組花粉理論比率為（1/2）6=1.56%，而花粉可育率卻為44.7%，表明許多非整倍性染色體數(shù)目的花粉具有生活力，可見植物三倍體的育性主要由對(duì)添加額外染色體的忍受程度決定，矮牽牛具體添加了哪些染色體的非整倍體花粉仍具有生活力尚有待進(jìn)一步研究。

本研究獲得的同源三倍體無論是自交還是與二倍體回交都有較高的結(jié)籽率，下一步將對(duì)雜交后代進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)和鑒定，從中篩選各種三體、單體等非整倍體，矮牽牛同源三倍體的成功獲得為后續(xù)細(xì)胞遺傳研究奠定了基礎(chǔ)。

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