王卉　劉慶菊　韓平

摘要：液相色譜-高分辨質(zhì)譜（LC-HRMS）具有高分辨率、高通量、高精確度等優(yōu)勢(shì)，在動(dòng)物源農(nóng)產(chǎn)品的獸藥殘留檢測(cè)研究中顯示出極大的潛力。本文綜述了2014—2018年LC-HRMS檢測(cè)動(dòng)物源農(nóng)產(chǎn)品中獸藥殘留的應(yīng)用研究進(jìn)展。其中，QuEChERS方法和有機(jī)溶劑提取法是常用的獸藥殘留提取方法，提取液用PSA、C18和氧化鋁等吸附劑凈化，綠色的樣品前處理方法是未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì);液相系統(tǒng)和色譜柱的改良，使獸藥化合物得到更好的分離，提高了質(zhì)譜檢測(cè)的靈敏度;HRMS分辨率和靈敏度的提高，增強(qiáng)了LC-HRMS定性定量分析動(dòng)物源農(nóng)產(chǎn)品中獸藥殘留的能力;數(shù)據(jù)處理軟件的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用，提高了LC-HRMS在獸藥殘留檢測(cè)中的工作效率。盡管LC-HRMS在獸藥殘留檢測(cè)中取得了進(jìn)展，但仍存在不足和發(fā)展空間。

關(guān)鍵詞：液相色譜（LC）-高分辨質(zhì)譜（HRMS）;動(dòng)物源農(nóng)產(chǎn)品;獸藥殘留;樣品前處理;色譜分離;質(zhì)譜檢測(cè);數(shù)據(jù)處理

中圖分類(lèi)號(hào)： TS207.5+3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）02-0057-08

收稿日期：2018-11-08

作者簡(jiǎn)介：王 卉（1982—），女，內(nèi)蒙古鄂倫春人，博士，助理研究員，主要從事農(nóng)產(chǎn)品安全檢測(cè)工作。E-mail：wangh@brcast.org.cn。

通信作者：韓 平，副研究員，主要從事農(nóng)產(chǎn)品安全檢測(cè)工作。E-mail：hanp@brcast.org.cn。

獸藥殘留是畜禽產(chǎn)品質(zhì)量的主要監(jiān)控指標(biāo)，獸藥的不科學(xué)使用會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物體內(nèi)藥物蓄積，對(duì)人類(lèi)及環(huán)境產(chǎn)生慢性、長(zhǎng)遠(yuǎn)和積累性的影響。獸藥經(jīng)畜禽代謝后，通常以原藥的形式進(jìn)入環(huán)境中，引起土壤污染、水污染和植物蓄積，環(huán)境中的獸藥殘留再通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，影響人體健康[1]。當(dāng)人體中的獸藥殘留蓄積到一定量時(shí)，會(huì)引起人體毒性反應(yīng)，導(dǎo)致癌變、畸變、基因突變等不良后果[2]。因此，動(dòng)物源農(nóng)產(chǎn)品的獸藥殘留問(wèn)題已經(jīng)成為國(guó)際上公認(rèn)的農(nóng)業(yè)和環(huán)境問(wèn)題[3]。

液相色譜（LC）-高分辨質(zhì)譜（HRMS）檢測(cè)技術(shù)是動(dòng)物源農(nóng)產(chǎn)品中獸藥殘留檢測(cè)分析的常規(guī)技術(shù)手段[4]，LC能夠分離非揮發(fā)性化合物和大部分揮發(fā)性化合物[5]，HRMS具有高精確度、高通量、全掃描等優(yōu)勢(shì)，LC與HRMS聯(lián)用可全面獲取樣品中化合物[6]的精確分子質(zhì)量和碎片離子信息，區(qū)分同分異構(gòu)體和同重化合物，鑒定未知物[7]。

在LC-HRMS檢測(cè)動(dòng)物源農(nóng)產(chǎn)品中獸藥殘留的研究中，首先通過(guò)樣品前處理來(lái)提取和凈化樣品中的獸藥化合物，前處理方法的選擇直接影響檢測(cè)結(jié)果。經(jīng)前處理后的樣品，通過(guò)液相色譜進(jìn)行分離，以降低基質(zhì)的復(fù)雜程度，獲得高質(zhì)量的質(zhì)譜數(shù)據(jù)[8-9]。然后再用HRMS進(jìn)行檢測(cè)分析，常用HRMS有飛行時(shí)間（TOF）質(zhì)譜、四級(jí)桿飛行時(shí)間（QTOF）質(zhì)譜、軌道阱質(zhì)譜（Orbitrap）、線性離子阱-軌道阱質(zhì)譜（LTQ-Orbitrap）、四級(jí)桿-軌道阱質(zhì)譜（Q-Orbitrap）等[10-13]，隨著HRMS分辨率和靈敏度的不斷提高[14-17]和質(zhì)譜采集數(shù)據(jù)量的增大，需不斷開(kāi)發(fā)和優(yōu)化相應(yīng)軟件來(lái)處理數(shù)據(jù)。

本文概述了2014—2018年LC-HRMS在動(dòng)物源農(nóng)產(chǎn)品的檢測(cè)研究中，涉及樣品前處理、液相分離、質(zhì)譜檢測(cè)、數(shù)據(jù)處理等方面的研究現(xiàn)狀，并對(duì)該技術(shù)未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行展望，旨在為此類(lèi)研究提供參考。

1 樣品前處理

提取和凈化是LC-HRMS檢測(cè)動(dòng)物源農(nóng)產(chǎn)品中獸藥殘留的主要步驟，溶劑提取法和QuEChERS（quick，easy，cheap，effective，rugged，safe）方法是獸藥殘留常用的提取方法[18-26]。提取后得到的樣品中可能存在共提物，會(huì)增加檢測(cè)噪聲，因此須進(jìn)一步凈化處理將其去除，以降低檢測(cè)的檢測(cè)限和定量限。

當(dāng)采用溶劑提取法提取動(dòng)物源農(nóng)產(chǎn)品中的獸藥殘留時(shí)，單一溶劑提取可能無(wú)法取得滿意效果，此時(shí)可采用多種溶劑混合提取，如Chiesa等用有機(jī)溶劑提取魚(yú)中的21種抗生素時(shí)發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用濃度為70%的甲醇（含0.1%甲酸）提取，或者單獨(dú)使用乙腈（含0.1%甲酸）對(duì)樣品進(jìn)行提取，均不能使所有目標(biāo)化合物取得滿意的回收率，因此將試驗(yàn)分為2步，首先用酸化甲醇提取，再用酸化乙腈提取，最終獲得了滿意的回收率[27]。此外，可以在提取過(guò)程中應(yīng)用其他提取方法輔助提取來(lái)降低檢測(cè)限，如2015年，Cepurnieks等用5%三氯乙酸 （TCA）溶液提取牛奶中的26種抗生素[28]，檢測(cè)濃度<100 ng/mL。2018年，Saluti等用0.25%TCA水溶液提取牛奶中14種抗生素時(shí)，引入超聲來(lái)輔助提取，使檢測(cè)限≤33 μg/kg[29]。

QuEChERS方法是一種通用的前處理方法[30]，可同時(shí)提取樣品中的多種獸藥殘留。根據(jù)化合物的不同性質(zhì)，可改變QuEChERS方法中溶劑、酸、鹽、吸附劑等的種類(lèi)和用量，提高獸藥殘留提取回收率[31]，除方法的改進(jìn)外，QuEChERS方法提取自動(dòng)前處理平臺(tái)的應(yīng)用是此項(xiàng)術(shù)進(jìn)步的重要表現(xiàn)，自動(dòng)化處理不僅減少了試劑對(duì)環(huán)境的污染，同時(shí)減少了人為因素對(duì)試驗(yàn)的影響，如Jia等應(yīng)用QuEChERS自動(dòng)前處理平臺(tái)提取了鱸魚(yú)中的24種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物及其代謝產(chǎn)物[32-45]。

凈化處理是提高獸藥檢測(cè)靈敏度的重要方法。常用的吸附劑有N-丙基乙二胺（PSA）、C18、氧化鋁和硅酸鎂等。近年來(lái)，科研人員對(duì)吸附劑凈化效果的研究不斷細(xì)化，如Chen等用QuEChERS方法提取雞肉中的16種β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物，試驗(yàn)用QuEChERS凈化管（150 mg C18，300 mg PSA 和900 mg 無(wú)水硫酸鎂）凈化提取液，上機(jī)檢測(cè)的檢測(cè)限（LOD）為0.01～0.35 μg/kg，定量限（LOQ）為003～1.16 μg/kg[23]，Lopez-Garcia等也采用QuEChERS方法來(lái)提取雞肉中的獸藥殘留[22]，并評(píng)價(jià)了 PSA、硅酸鎂、C18鍵合鋯膠（Z-Sep+）、氧化鋁和C18等吸附劑的凈化效果，發(fā)現(xiàn)經(jīng)硅酸鎂和氧化鋁凈化后的檢測(cè)靈敏度最好，而其他的吸附劑對(duì)目標(biāo)化合物有吸附，導(dǎo)致靈敏度低。

動(dòng)物源農(nóng)產(chǎn)品中獸藥殘留提取和凈化方法的選擇，要基于樣品基質(zhì)的理化性質(zhì)和研究目的，如果前處理方式不當(dāng)，可能導(dǎo)致基質(zhì)干擾嚴(yán)重，有些重要的化合物未被提取，或在提取過(guò)程中丟失，進(jìn)而影響研究結(jié)果。

2 色譜分離

在LC-HRMS檢測(cè)動(dòng)物源農(nóng)產(chǎn)品的獸藥殘留研究中，LC分離能夠降低樣品的復(fù)雜程度，利于質(zhì)譜對(duì)樣品進(jìn)行準(zhǔn)確全面的檢測(cè)。與HRMS串聯(lián)使用的LC，已經(jīng)從高效液相色譜（HPLC）改進(jìn)為超高效液相色譜（UPLC），UPLC的分辨率、靈敏度和穩(wěn)定性都優(yōu)于HPLC。同時(shí)，色譜柱的改良也有力地推動(dòng)了LC-HRMS在動(dòng)物源農(nóng)產(chǎn)品獸藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用。

在獸藥殘留的液相色譜分析研究中，以硅膠為基質(zhì)的反相色譜柱在獸藥檢測(cè)中的應(yīng)用最為廣泛[46]。其中，反相C18色譜柱可保留非極性化合物，而苯基柱適合分析親水性化合物[47]。與反相色譜柱相比，親水相互作用色譜柱（HILIC）對(duì)極性強(qiáng)的獸藥化合物的保留效果更好[48-49]。而且色譜柱填料的改進(jìn)使色譜柱性能更加優(yōu)異，具體表現(xiàn)在填料顆粒的體積變小，超高效液相色譜柱的填料顆粒小于2 μm，因此分離效果更好，峰寬變窄[50]，色譜的峰容量得到提高，分離效果得到改善，減少了質(zhì)譜中的離子抑制。液相色譜柱可承受的壓力增加，高達(dá) 1 500 bar[51]，對(duì)樣品的洗脫速度加快，縮短了樣品的分析時(shí)間[52]。Zhao等在應(yīng)用LC-Q-Orbitrap測(cè)定斑石鯛中的80種獸藥殘留（獸殘）的研究中，對(duì)6種反相色譜柱分離樣品的效果進(jìn)行了比較，其中色譜柱直徑和填料孔徑尺寸最小的亞乙基雜化橋顆粒（BEH） C18色譜柱的分離能力、效率和靈敏度優(yōu)于其他5種色譜柱[36]。

近年來(lái)，微流液相色譜（μLC）、毛細(xì)管液相色譜（CLC）及納升液相色譜（nano LC）與HRMS的聯(lián)用提高了HRMS的檢測(cè)靈敏度[53-54]，是未來(lái)LC-HRMS檢測(cè)發(fā)展的重要方向。Alcantara-Duran等應(yīng)用nano LC-HRMS定量檢測(cè)蜂蜜、牛奶、牛肉和雞蛋等樣品中的87種獸藥，將前處理后的樣品稀釋100倍，nano LC-HRMS仍能夠檢測(cè)到溶液中的目標(biāo)化合物[37]，極大地提高了檢測(cè)靈敏度。Mirabelli等用nano LC-HRMS檢測(cè)殺蟲(chóng)劑的檢測(cè)限可達(dá)到10 pg/mL[55]。

3 質(zhì)譜檢測(cè)

電噴霧電離（ESI）源是液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）應(yīng)用中最常用的接口之一。ESI電離是一種軟電離方式，電離效率高。Araceli等采用ESI、大氣壓化學(xué)電離（APCI）和大氣壓光電離（APPI）3種電離方式對(duì)5種化合物的電離效果進(jìn)行比較研究，結(jié)果表明，化合物經(jīng)ESI電離后，產(chǎn)生的峰面積和信噪比明顯高于APCI和APPI[56]。在LC-MS的應(yīng)用研究中，超過(guò)80%的研究選用了ESI離子源，而APCI和APPI電離方式報(bào)道較少[57]。

樣品經(jīng)離子源電離后，進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)。HRMS具有高分辨率，能提供高精確度的全掃描數(shù)據(jù)，有良好的定性能力[11，58-60]。特別是當(dāng)檢測(cè)的同分異構(gòu)體或同重化合物的保留時(shí)間和精確質(zhì)量數(shù)相同而無(wú)法區(qū)分時(shí)，可以通過(guò)碎片離子信息的差異作進(jìn)一步的區(qū)分。因此，碎片離子信息采集的是否全面，是評(píng)價(jià)高分辨質(zhì)譜性能的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)。目前，常用的HRMS數(shù)據(jù)采集模式主要分為數(shù)據(jù)依賴型采集（DDA）和數(shù)據(jù)非依賴型采集（DIA）。DDA采集時(shí)，質(zhì)譜自動(dòng)從全掃描一級(jí)質(zhì)譜（FS MS）轉(zhuǎn)換成全掃描二級(jí)質(zhì)譜（FS MS/MS），后者是在前者的基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)出來(lái)的，包括離子碎片采集（AIF）和MSE采集模式等，能夠獲得所檢測(cè)質(zhì)量范圍內(nèi)所有的母離子和碎片離子信息。此外，離子淌度技術(shù)也是HRMS分離同分異構(gòu)體和同重化合物的重要技術(shù)，該技術(shù)在電場(chǎng)中根據(jù)離子的大小、結(jié)構(gòu)和電荷對(duì)其進(jìn)行分離[61-62]。

HRMS的分辨率隨硬件的發(fā)展不斷提高。如Qtof是四級(jí)桿與飛行時(shí)間質(zhì)譜串聯(lián)的儀器，它在實(shí)際檢測(cè)中的分辨率<30 000，主要用來(lái)做定性試驗(yàn)，可提供一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)作為定性判斷依據(jù)，Nacher-Mestre等用UPLC- Xevo G2 Qtof定性篩查了動(dòng)物加工副產(chǎn)品中的150種獸藥，當(dāng)基質(zhì)加標(biāo)量為0.2 mg/kg時(shí)可檢測(cè)出75%獸藥，當(dāng)基質(zhì)加標(biāo)量為0.1 mg/kg 時(shí)可檢測(cè)出65%的獸藥，當(dāng)加標(biāo)量為0.02 mg/kg時(shí)可檢測(cè)出30%的獸藥[42]。而 LTQ-Orbitrap 的分辨率高于Qtof，分辨率設(shè)置范圍為7 500～100 000，可以提供多級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)作定性定量研究。Saito-Shida等對(duì)146種化合物進(jìn)行定量測(cè)定時(shí)，比較了應(yīng)用LC-Orbitrap-MS建立的方法和應(yīng)用LC-QTOF-MS建立方法的線性、回收率、精密度和基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果表明Orbitrap-MS的選擇性和靈敏度優(yōu)于QTOF-MS[63]，而且LTQ-Orbitrap的多級(jí)質(zhì)譜（MSn）數(shù)據(jù)采集模式可以為獸藥及其代謝物的鑒定提供更豐富的碎片離子信息。比LTQ-Orbitrap性能更好的Q-Orbitrap分辨率可以達(dá)到140 000，Jia等應(yīng)用UHPLC-Q-Orbitrap對(duì)鱸魚(yú)中的24種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物及其代謝產(chǎn)物做定性定量檢測(cè)，其中確定限（CCα）為 0.12～3.61 μg/kg，檢測(cè)容量（CCβ）為0.20～6.02 μg/kg[32]，具體檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

HRMS最初主要被應(yīng)用于定性篩查研究中，目前隨著HRMS硬件的不斷進(jìn)步，HRMS的分辨率和靈敏度得到提高，使基質(zhì)干擾問(wèn)題得以解決[5，64]，HRMS在全掃描模式下的選擇性與三重四級(jí)桿在選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（selected reaction monitoring，SRM）模式下的選擇性一樣好，因此被越來(lái)越多地應(yīng)用于獸藥定量研究中。4 數(shù)據(jù)分析

在LC-HRMS檢測(cè)動(dòng)物源農(nóng)產(chǎn)品獸藥殘留的研究中，根據(jù)研究目的不同，可分為靶向檢測(cè)數(shù)據(jù)處理和非靶向檢測(cè)數(shù)據(jù)處理。在靶向檢測(cè)研究中，數(shù)據(jù)處理步驟包括原始數(shù)據(jù)采集、生成參考數(shù)據(jù)庫(kù)（自建數(shù)據(jù)庫(kù)或在線數(shù)據(jù)庫(kù)）、化合物的分離鑒定、數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化和量化、數(shù)據(jù)分析步驟一體化（自動(dòng)處理工具）。其中，數(shù)據(jù)的采集主要采用儀器供應(yīng)商提供的軟件[39-41，44]，如Thermo Fisher Scientific公司的Xcalibur軟件、Waters公司的MassLynx軟件、AB公司的Multiquant軟件、Agilent公司的Mass Hunter等，常用的數(shù)據(jù)處理軟件見(jiàn)表2。數(shù)據(jù)分析所用數(shù)據(jù)庫(kù)主要有2類(lèi)，一類(lèi)是由科研人員自己建立的數(shù)據(jù)庫(kù)，另一類(lèi)是在線數(shù)據(jù)庫(kù)，如Chemspider、Metlin、Drug Bank等。通過(guò)搜索化合物的精確質(zhì)量數(shù)，可以得到與之對(duì)應(yīng)的化合物，但是存在以下問(wèn)題：數(shù)據(jù)庫(kù)中所含化合物不夠全面;對(duì)給定的精確質(zhì)量數(shù)不能提供準(zhǔn)確的分子結(jié)構(gòu);或?qū)ν痪_質(zhì)量數(shù)給出多個(gè)化合物。因此，須根據(jù)元素組成，對(duì)化合物分子式進(jìn)行推斷，并結(jié)合特征碎片離子信息鑒定化合物，最后通過(guò)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)確證。在使用數(shù)據(jù)處理軟件時(shí)，參數(shù)設(shè)置會(huì)影響研究結(jié)果，例如，若質(zhì)量提取窗口設(shè)置范圍過(guò)寬，可能有假陽(yáng)性檢出。為避免假陽(yáng)性或假陰性，須要對(duì)質(zhì)量提取窗口的寬度范圍進(jìn)行試驗(yàn)，如Jia等試驗(yàn)了質(zhì)量提取窗口設(shè)置成1～10 μg/kg時(shí)，數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)羅非魚(yú)中獸藥及其代謝物的選擇性，發(fā)現(xiàn)當(dāng)質(zhì)量提取窗口為3 μg/kg時(shí)，目標(biāo)分析物的提取效果最好[39]。

在動(dòng)物源農(nóng)產(chǎn)品的非靶向檢測(cè)研究中，數(shù)據(jù)分析步驟為原始數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)保存和轉(zhuǎn)化、數(shù)據(jù)導(dǎo)入、數(shù)據(jù)壓縮和矩陣建立、數(shù)據(jù)歸一化、特征檢測(cè)、生物標(biāo)志物篩查、鑒定。多元統(tǒng)計(jì)分析方法如主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）等可識(shí)別動(dòng)物源樣品中的獸藥及其代謝產(chǎn)物，通用的商業(yè)軟件可能無(wú)法直接處理LC-HRMS檢測(cè)的原始數(shù)據(jù)，因此須要對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行格式轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)換成開(kāi)放性的數(shù)據(jù)格式之后便可進(jìn)行數(shù)據(jù)處理[65-66]。近年來(lái)，隨著數(shù)據(jù)處理軟件的升級(jí)，自動(dòng)化處理的程度越來(lái)越高。如Morales-Gutierrez等應(yīng)用UPLC-LTQ-Qrbitrap MS檢測(cè)雞的肉、肝、腎中的阿莫西林及其代謝產(chǎn)物時(shí)，用PCA方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，獲得了區(qū)分用藥組和非用藥組的化合物，試驗(yàn)測(cè)得的原始數(shù)據(jù)首先經(jīng)Xcalibur軟件轉(zhuǎn)化成mzXML文件，再用MzMine軟件和XCMS軟件來(lái)處理此數(shù)據(jù)，得到可以用Matlab處理的數(shù)據(jù)矩陣，最后用PCA法處理的數(shù)據(jù)矩陣，得到組間差異化合物[35]。而在Arias等用OPLS-DA模型識(shí)別用藥豬與未用藥豬之間差異的研究[67]中，數(shù)據(jù)前處理僅使用了TransOmics軟件[沃特世科技（上海）有限公司]，經(jīng)歸一化、標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)直接導(dǎo)入SIMCA軟件（德國(guó)賽多利斯集團(tuán)）進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。自動(dòng)處理軟件的開(kāi)發(fā)，簡(jiǎn)化了處理過(guò)程，縮短了處理時(shí)間。

5 展望

動(dòng)物源農(nóng)產(chǎn)品中的獸藥殘留直接危害公眾健康，因此受到消費(fèi)者和監(jiān)管部門(mén)的重視。高效準(zhǔn)確地檢測(cè)動(dòng)物源農(nóng)產(chǎn)品中的獸藥殘留情況，對(duì)保證動(dòng)物源農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量安全具有重要意義?；贚C-HRMS的獸藥殘留檢測(cè)方法已經(jīng)發(fā)展成為一項(xiàng)非常重要的檢測(cè)手段，綠色、高效的提取方法是未來(lái) LC-HRMS 前處理方法的發(fā)展方向，色譜系統(tǒng)和色譜柱填料的進(jìn)步，特別是將新型的色譜分離技術(shù)如nanoLC、μLC和CLC等與HRMS相結(jié)合是減少基質(zhì)效應(yīng)、提高分離效率的發(fā)展方向，HRMS分辨率的不斷提高以及應(yīng)用軟件的優(yōu)化會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)LC-HRMS技術(shù)在動(dòng)物源農(nóng)產(chǎn)品獸藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用研究。

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