王開(kāi)拓　吳田　藍(lán)增全

摘要：草坪業(yè)在發(fā)展過(guò)程中出現(xiàn)一些種的混淆，為了區(qū)分不同草坪草，采用昆明常見(jiàn)的10種草坪草為樣本，利用簡(jiǎn)單重復(fù)序列（inter-simple sequence repeat，簡(jiǎn)稱ISSR）分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建昆明地區(qū)常見(jiàn)草坪草的指紋圖譜。從28條引物中篩選出15條特異性較好的引物，對(duì)其進(jìn)行退火溫度篩選。結(jié)果表明，引物UBC834、UBC842、UBC844退火溫度分別為58、58、55 ℃時(shí)多態(tài)性較好。對(duì)引物UBC834、UBC842、UBC844的電泳圖譜進(jìn)行0、1讀帶，構(gòu)建了3個(gè)草坪草的數(shù)字指紋圖譜，可以將供試的10種草坪草全部區(qū)分開(kāi)來(lái)。

關(guān)鍵詞：草坪草;ISSR;指紋圖譜;多態(tài)性

中圖分類號(hào)：S688.401

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）02-0073-04

收稿日期：2019-07-15

作者簡(jiǎn)介：王開(kāi)拓（1992—），男，安徽淮南人，碩士研究生，主要從事植物遺傳與種質(zhì)資源研究。E-mail：809271790@qq.com。

通信作者：吳 田，博士，副教授，主要從事植物分子生物學(xué)研究，E-mail：461257271@qq.com;藍(lán)增全，碩士，教授，主要從事生態(tài)學(xué)研究，E-mail：kmlanzengquan@qq.com。

近年來(lái)草坪業(yè)在我國(guó)發(fā)展迅猛，特別是在城市綠化和一些運(yùn)動(dòng)場(chǎng)中應(yīng)用極為廣泛，對(duì)人類賴以生存的生活環(huán)境起著保護(hù)、美化和改善作用。而昆明地處我國(guó)西南地區(qū)，氣候獨(dú)特，四季如春，素有“春城”的美稱。陳蘊(yùn)等對(duì)我國(guó)草坪草的引種工作和一些主要問(wèn)題進(jìn)行了綜述和分析[1]。彭燕等以我國(guó)主要草坪草的研究進(jìn)展為基礎(chǔ)，提出研究和利用草坪草種質(zhì)資源的對(duì)策[2]。黃鶴平等選用10個(gè)草坪草品種進(jìn)行栽培研究，對(duì)昆明地區(qū)的草坪草引種進(jìn)行了評(píng)價(jià)[3]。昆明市對(duì)城市的美化正在不斷地加強(qiáng)，對(duì)草坪草的數(shù)量和質(zhì)量要求也不斷提高。但是，由于草坪草經(jīng)修剪后通常葉色、葉寬、葉片硬度等均會(huì)發(fā)生變化，且沒(méi)有花序，因此難以通過(guò)植物學(xué)性狀區(qū)分草種，不利于有針對(duì)性地對(duì)草坪進(jìn)行養(yǎng)護(hù)管理。而通過(guò)構(gòu)建某一地區(qū)常見(jiàn)的草坪草DNA指紋圖譜，為后續(xù)的草種分辨提供了途徑。

微衛(wèi)星DNA（simple sequence repeats，簡(jiǎn)稱SSR）、限制性長(zhǎng)度片段多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，簡(jiǎn)稱RFLP）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNA，簡(jiǎn)稱RAPD）等分子自標(biāo)記技術(shù)均可以構(gòu)建指紋圖譜，它們都從不同的角度反映物種的遺傳信息[4-7]。簡(jiǎn)單重復(fù)序列（inter-simple sequence repeat，簡(jiǎn)稱ISSR）是一種基于PCR擴(kuò)增進(jìn)行檢測(cè)的分子標(biāo)記技術(shù)，它對(duì)簡(jiǎn)單重復(fù)序列之間的區(qū)域進(jìn)行多態(tài)性擴(kuò)增，是由Zietkiewicz等[8]提出的。ISSR結(jié)合了其他分子標(biāo)記技術(shù)的特點(diǎn)，如操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好、多態(tài)性豐富、成本低等[9-10]，為指紋圖譜的構(gòu)建提供了快速可靠的技術(shù)基礎(chǔ)。指紋圖譜是品質(zhì)混雜的檢測(cè)工具[11]，利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建指紋圖譜在品種鑒定上的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，前人已經(jīng)在蘋果[12]、桑樹(shù)[13]、鳳梨[14]、復(fù)烤煙[15]等多種植物材料上建立了指紋圖譜。在草坪草上，劉君等利用ISSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)9份狗牙根的遺傳多樣性進(jìn)行了研究，構(gòu)建了9份材料的指紋圖譜[16]。胡雪華等以上海結(jié)縷草（Zoysia japonica）JD-1和細(xì)葉結(jié)縷草（Zoysia tenuifolia）、溝葉結(jié)縷草（Zoysia matrella）、結(jié)縷草為材料，利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)在4個(gè)材料中構(gòu)建了指紋圖譜[17]。本試驗(yàn)以昆明常見(jiàn)的10種草坪草為材料，利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建指紋圖譜，為后續(xù)從分子角度對(duì)其進(jìn)行相互區(qū)分奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用草坪草材料分別為溝葉結(jié)縷草[Zoysia matrella （L.） Merr.]、結(jié)縷草（Zoysia japonica Steud.）、細(xì)葉結(jié)縷草（Zoysia tenuifolia Willd. ex Trin.）、黑麥草（Lolium perenne L.）、高羊茅（Festuca elata）、草地早熟禾（Poa pratensis L.）、紫羊茅（Festuca rubra L.）、細(xì)弱剪股穎（Agrostis tenuis Sibth.）、匍匐剪股穎（Agrostis stolonifera）和狗牙根[Cynodon dactylon （L.） Pers.]。將其種子在西南林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院實(shí)驗(yàn)室溫室培養(yǎng)箱中于 25 ℃ 光照培養(yǎng)發(fā)芽。

1.2 DNA提取與檢測(cè)

每個(gè)草坪草品種剪下由多顆種子萌發(fā)的幼嫩葉片進(jìn)行液氮研磨，使用TIANGEN試劑盒提取總DNA。對(duì)提取的DNA原液進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠、GoldView核酸染料電泳，檢測(cè)其質(zhì)量。保存在 -20 ℃ 冰箱中。

1.3 ISSR-PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件

本試驗(yàn)所用PCR反應(yīng)體系為25 μL：ddH2O 18 μL，dNTP 2 μL，10×Buffer 2.5 μL，DNA模板100 ng，引物10 μmol/L，Trans Taq DNA聚合酶 0.5 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性60 s，55 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，40個(gè)循環(huán);72 ℃ 再延伸10 min，4 ℃保存。

ISSR引物篩選。PCR反應(yīng)結(jié)束后，將擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳中檢測(cè)。電泳條件為上樣量 3 μL，1×TAE緩沖液，90 V電壓下45 min。電泳結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng)上觀測(cè)、拍照。用10個(gè)草種樣本從28條引物（表1）中篩選出條帶清晰、多態(tài)性高以及重復(fù)性好的引物。