李炳喜， 劉 靖， 李 揚， 葉劍敏

(華南師范大學生命科學學院∥廣東省水產(chǎn)健康安全養(yǎng)殖重點實驗室， 廣州 510631)

赤潮是全球性海洋問題，中國亦是赤潮發(fā)生較嚴重的國家，近30年來，赤潮發(fā)生的頻率、海域范圍，以及導致的經(jīng)濟損失均呈逐年上升趨勢[1-2]. 赤潮的危害形式主要有2大類[3]：一類是形成高密度的微藻生物量，導致海域生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的單一化和不穩(wěn)定性增加；另一類是通過產(chǎn)生藻毒素(赤潮毒素),藻毒素可以在魚貝類等海產(chǎn)品中富集，污染水產(chǎn)品，人類食用這類水產(chǎn)品后會出現(xiàn)中毒現(xiàn)象[4]. 根據(jù)藻類引發(fā)的人類中毒癥狀和藻源的不同，將藻毒素分為5大類[4-7]：腹瀉性貝毒(Diarrheic Shellfish Poisoning, DSP)、西加魚毒(Ciguatera Fish Poisoning, CFP)、麻痹性貝毒(Paralytic Shellfish Poisoning, PSP)、神經(jīng)性貝毒(Neurotoxic Shellfish Poisoning, NSP)和記憶缺失性貝毒(Amnesic Shellfish Poisoning, ASP).

軟骨藻酸(Domoic Acid, DA)又名多莫酸，是記憶缺失性貝毒的主要成分，是由某些擬菱形藻屬(Pseudo-nitzschia)和菱形藻屬(Nitzschia)海洋硅藻產(chǎn)生的藻毒素[8]. DA可在魚貝類的體內(nèi)富集，并通過食物鏈傳遞作用轉(zhuǎn)移給高能量級的動物，造成動物死亡，或轉(zhuǎn)移給人類. 當人體內(nèi)的毒素達到一定濃度即可產(chǎn)生嘔吐、腹瀉和腹痛等中毒癥狀，嚴重者能導致短期記憶功能的喪失，甚至導致死亡[9-10]. 1987年加拿大愛德華王子島居民因食用受污染的紫貽貝而造成中毒事故，事故造成100多人中毒，其中3人死亡[11]. 之后，陸續(xù)有人和高等動物的DA中毒事件的報道[12-16]. 加拿大率先制定了DA安全限量標準為20 μg/g，以貝肉計[17]. 隨著赤潮發(fā)生的頻率上升和范圍擴大，DA對人類健康的潛在威脅越來越嚴峻，因此迫切需要研發(fā)一種快速、便捷和適合基層人員使用的DA檢測技術(shù).

目前已建立的DA檢測方法主要有：小鼠生物法檢測、高效液相色譜(HPLC)、氣相色譜、毛細管電泳、免疫學方法和生物傳感器法等[4]. 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)具有操作簡便、快速、可同時檢測多個樣品、靈敏度高、特異性強、檢測限低、結(jié)果可目測和既可定性也可定量等優(yōu)點，被廣泛應用于藥物、致病微生物和藻毒素等的檢測. 因此，本研究在制備DA完全抗原免疫小鼠，獲得DA多克隆抗體的基礎上，運用間接酶聯(lián)免疫技術(shù)，創(chuàng)建了一種準確快速檢測樣品中DA含量的間接競爭ELISA法，旨在實現(xiàn)適合基層人員使用的高效、簡易、經(jīng)濟和準確的水產(chǎn)品檢測試劑盒的開發(fā)與應用，為建立完整的赤潮毒素監(jiān)督體系提供良好的實驗基礎.

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用6周齡雌性Balb/c小鼠購于廣東省醫(yī)學實驗動物中心；4種待檢測的貝類：紫怡貝(青島)、扇貝(獐子島)、北極貝(日本)和美國貝(朝鮮)購于廣州黃沙海鮮市場；軟骨藻酸(DA)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、牛血清白蛋白(BSA)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、鑰孔血藍蛋白(KLH)、二甲基亞砜(DMSO)購于Sigma公司；BCA顯色試劑盒購于Biosharp公司；HRP標記山羊抗小鼠IgG二抗購于Southern Biotech公司；常規(guī)分析純化學試劑購于天津大茂化學試劑廠；透析袋購于美國Specturm光譜醫(yī)學公司；Multiskan FC酶標儀購于Thermo公司；超聲波細胞粉碎機購于寧波新芝生物科技有限公司；UV2450紫外分光光度計購于日本島津公司；PB203-N電子天平購于上海梅特勒拖利儀器公司；多孔道移液槍購于德國Eppendorf公司；96孔酶標板購于美國Coning Costar公司.

1.2 方法

1.2.1 偶聯(lián)抗原的制備 軟骨藻酸0.5 mg溶于DMSO中(DA質(zhì)量濃度為20 mg/mL)，加入0.615 mg EDC(15 mg/mL，現(xiàn)配)和0.372 5 mg NHS(15 mg/mL，現(xiàn)配)，混合均勻，放于25 ℃恒溫搖床中160 r/min反應4 h；后轉(zhuǎn)移至4 ℃冰箱靜置2 h；再加入1 mg KLH或BSA(溶于0.1 mL硼酸(3.708 mg/mL)中)，混合均勻后置于25 ℃恒溫搖床160 r/min，反應3 h；將總體系吸入0.5 mL超濾離心管中，13 000 r/min離心10 min，再將濾管倒扣，4 500 r/min離心2 min收集抗原；用BCA試劑盒檢測偶聯(lián)抗原(完全抗原)的質(zhì)量濃度，抗原分裝后置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?

1.2.2 偶聯(lián)抗原的鑒定 將DA、BSA、KLH、DA-BSA和DA-KLH用DMSO稀釋到1 mg/mL，測定200～400 nm波長的紫外光吸收光譜，同時進行SDS-PAGE凝膠電泳檢測. 通過比較偶聯(lián)抗原DA-BSA、DA-KLH與DA、BSA、KLH最大吸收峰的變化和蛋白質(zhì)相對分子量大小的差異來判斷偶聯(lián)效果. 根據(jù)文獻[18-19]中的方法，偶聯(lián)比率=(CDA/MDA)/(CBSA/MBSA)，計算偶聯(lián)蛋白DA-KLH和DA-BSA的偶聯(lián)比(CDA、CBSA為質(zhì)量濃度，MDA、MBSA為摩爾濃度).

1.2.3 多克隆抗體的制備及抗血清效價檢測 將DA-KLH與弗氏佐劑混合作為抗原，腹腔注射免疫小鼠. 初次免疫選用完全佐劑，每只小鼠注射100 μg偶聯(lián)蛋白，再次免疫則用不完全佐劑，每只注射50 μg偶聯(lián)蛋白，每次免疫時間間隔2周，一共免疫4次. 小鼠尾部靜脈取血后，4 ℃靜置過夜，取上層血清備用. 使用ic-ELISA方法測定抗體效價，計算方法為：抗體效價(units/mL)=1 000/最大速率的一半所對應的抗血清體積[20].

1.2.4 間接競爭ELISA標準曲線的建立

(1)DA-BSA抗原包被質(zhì)量濃度和多抗稀釋比的選擇 采用方陣滴定法，用包被液將DA-BSA稀釋至8 μg/mL，底物質(zhì)量濃度縱向倍比稀釋加入到96孔酶標板中，A～H行分別為8.000、4.000、2.000、1.000、0.500、0.250、0.125、和0 μg/mL，50 μL/孔，37 ℃溫育2 h；封閉液(含0.5% BSA的TTBS)200 μL/孔，37 ℃封閉1 h；1×TTBS洗4次；多抗按1∶100稀釋后橫向倍比稀釋加入到酶標板中，同時設空白對照組，1～12列多抗稀釋倍數(shù)分別為1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600、1∶51 200、1∶102 400和0，50 μL/孔，37 ℃溫育1 h；1×TTBS洗4次；用稀釋液將0.7 mg/mL HRP標記的山羊抗小鼠IgG二抗按1∶2 000稀釋后加入酶標板中，50 μL/孔，37 ℃溫育1 h；1×TTBS洗4次；加入100 μL/孔 顯色液后使用酶標儀檢測；根據(jù)OD、最大速率(vmax)及抗體用量確定最合適包被質(zhì)量濃度和多抗稀釋比.

(2)二抗稀釋比的選擇 選用最適抗原包被質(zhì)量濃度和最合適多抗稀釋比，用稀釋液將0.7 mg/mL HRP標記山羊抗小鼠IgG二抗分別按1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000稀釋，50 μL/孔，37 ℃溫育1 h，每板同時做陰性對照和空白對照，其余操作不變. 根據(jù)各孔OD、最大反應速率(vmax)、孔間差異系數(shù)(Cv)及陽性孔與陰性孔OD的比值(P/N)來選擇最合適的二抗稀釋比.

(3)包被方式的選擇 以最適包被質(zhì)量濃度包被,分別4 ℃過夜、37 ℃溫育0.5 h、37 ℃溫育1 h、37 ℃溫育2 h、25 ℃孵育1 h和25 ℃孵育2 h，多抗和二抗均選用確定的最適稀釋比，每板對照組設置同上，其余操作不變，進行ELISA檢測. 采用同種方法確定最適的抗原包被方式.

(4)封閉時間的選擇 以最適質(zhì)量濃度及方式包被酶標板，棄掉包被抗原，加入封閉液，200 μL/孔，分別37 ℃溫育0.5、1.0、2.0 h,多抗和二抗均選用確定的最適稀釋比，每板對照組設置同上，其余操作不變，完成ELISA檢測. 采用同種方法選擇出最適封閉時間.

(5)多抗和二抗孵育時間的選擇 以最適條件包被和封閉后,多抗分別37 ℃孵育0.5、1.0、2.0 h,二抗分別37 ℃孵育0.5、1.0、2.0 h,多抗和二抗使用最適工作質(zhì)量濃度，每板對照組設置同上，其余操作不變. 采用同種方法確定最適多抗和二抗孵育時間，確定多抗時間后再進行二抗最適孵育時間的選擇.

(6)標準曲線的繪制 以確定的最適抗原包被質(zhì)量濃度、抗原包被方式、封閉時間、多抗質(zhì)量濃度、二抗質(zhì)量濃度及多抗與二抗孵育的時間進行ic-ELISA檢測. 將一定質(zhì)量濃度的DA(半抗原)與最適質(zhì)量濃度多抗混合作為一抗加入酶標板，DA質(zhì)量濃度分別為10 000、5 000、2 500、1 000、500、100、50、25、10、5.0、2.5、1.0、0 ng/mL(空白對照)，完成ELISA檢測. 以DA質(zhì)量濃度為橫坐標，抑制率(B/B0×100%)為縱坐標繪制標準曲線，并選擇最佳擬合模型,其中B為樣品的OD，B0為空白對照的OD.

1.2.5 貝類樣品處理及DA的提取和檢測 將購買的新鮮貝類用清水洗凈,用刀取出貝肉和消化腺，置于網(wǎng)孔細小金屬網(wǎng)上瀝干. 根據(jù)文獻[21]的方法，各取5 g不同貝類組織樣品，分別加入10 mL勻漿液(甲醇和水按1∶1體積比配置)，勻漿后漩渦震蕩1 min，超聲提取5 min后，4 500 r/min離心20 min. 離心后將上清液用0.22 μm濾膜過濾后轉(zhuǎn)移至透析袋中，使用PEG20000進行濃縮，最后用勻漿液把體積調(diào)整至5 mL. 用建立好的最佳ic-ELISA檢測方法對樣品進行DA含量的檢測.

2 結(jié)果與分析

2.1 偶聯(lián)抗原的鑒定

2.1.1 紫外光光譜分析 將DA、BSA、KLH、DA-BSA、DA-KLH稀釋到1 mg/mL，通過分析200～400 nm波長紫外光的吸收光譜，比較偶聯(lián)蛋白DA-BSA、DA-KLH與DA、BSA、KLH的峰形和最大吸收峰(圖1、圖2). DA、KLH、BSA紫外的最大吸收峰分別為242、280、278 nm，偶聯(lián)蛋白DA-KLH、DA-BSA光譜的峰型和最大吸收峰明顯與DA、KLH和BSA的不同. 這種偶聯(lián)蛋白、半抗原、載體蛋白之間光譜峰型和最大吸收峰的差異，在紫外的吸光值約等于半抗原與載體蛋白吸光值疊加的特點，表明DA-KLH與DA-BSA均成功偶聯(lián).

圖1 免疫抗原DA-KLH的紫外光譜掃描圖

圖2 包被抗原DA-BSA的紫外光譜掃描圖

2.1.2 DA-BSA的SDS-PAGE鑒定 通過10% SDS-PAGE凝膠電泳檢測(圖3)，第2泳道的偶聯(lián)蛋白DA-BSA在凝膠圖上的條帶遷移距離明顯滯后于第3泳道的BSA. 因為蛋白質(zhì)的相對分子量大小與凝膠電泳遷移速率成反比，因此第2泳道的蛋白質(zhì)的相對分子量明顯大于第3泳道的，這說明有部分DA偶聯(lián)到了BSA上，表明DA-BSA蛋白偶聯(lián)成功.

圖3 SDS-PAGE的凝膠電泳檢測分析

2.1.3 蛋白的質(zhì)量濃度檢測及偶聯(lián)比的計算 用BCA顯色試劑盒檢測偶聯(lián)蛋白的質(zhì)量濃度. 測得DA-KLH和DA-BSA的質(zhì)量濃度分別為2.55 mg/mL(總體積450 μL)和3.3 mg/mL(總體積300 μL). 通過計算得到DA-KLH和DA-BSA的偶聯(lián)比分別為44∶1和16∶1.

2.2 抗血清效價的檢測

用ic-ELISA法測小鼠的抗血清效價，其結(jié)果如圖4所示. 以最大反應速率vmax的50%(13.9 OD/min)處所對應的抗血清體積(0.004 762 μL)即為含有一個單位效價的抗體，小鼠抗血清的效價達到210 000 units/mL.

圖4 小鼠抗血清效價

2.3 間接ELISA標準曲線的建立

2.3.1 包被抗原質(zhì)量濃度和多抗使用稀釋比的確定 方陣滴定法實驗結(jié)果如表1所示. 選取OD在1.0左右的抗原包被質(zhì)量濃度和多抗使用稀釋比，從結(jié)果(表1)可知:在低抗原質(zhì)量濃度(0.250、0.500 μg/mL)低多抗稀釋比(1∶100、1∶200)時，和高抗原質(zhì)量濃度(8.000、4.000 μg/mL)高多抗稀釋比(1∶12 800、1∶25 600)時OD接近1. 從實驗精度控制和節(jié)約抗體等綜合因素考慮，最終選取0.500 μg/mL和1∶3 200作為各自最適工作質(zhì)量濃度和稀釋比.

2.3.2 二抗稀釋比的確定 將二抗用稀釋液按不同比例稀釋，其實驗結(jié)果見表2. 當P/N大于2.1時表示實驗檢測結(jié)果可靠，結(jié)果顯示：使用不同稀釋比的二抗，P/N均大于2.1，且隨著二抗稀釋倍數(shù)的增加，平均OD逐漸減小. 以選擇平均OD較大、P/N較大、Cv較小、陰性對照及空白對照OD較小和節(jié)約抗體的原則，據(jù)此選擇1∶2 000作為二抗的最適稀釋比.

2.3.3 包被條件的確定 底物以疏水作用吸附到酶標板的固相載體上，底物的包被溫度、時間都會影響底物與載體的吸附效果，從而影響抗原抗體反應. 不同包被方式結(jié)果見表3，其中37 ℃ 包被1 h的平均OD、最大速率與P/N均較大，Cv最小，故選擇37 ℃、1 h作為最適包被方式.

表1 不同包被抗原質(zhì)量濃度及多抗稀釋比的OD

表2 二抗稀釋比對vmax和OD的影響

注：Vmax：最大反應速率；SD：方差；OD：吸光值；Cv：孔間差異系數(shù)；P/N：及陽性孔與陰性孔OD的比值.

表3 抗原包被溫度和時間對vmax和OD的影響

2.3.4 封閉時間的確定 封閉液通過范德華力與酶標板固相載體上未被包被液包被的空隙結(jié)合，使空隙被大量與抗原抗體不相關的蛋白占據(jù)，從而避免后續(xù)反應中有物質(zhì)再吸附到固相載體上對試驗造成干擾. 不同時間封閉的檢測結(jié)果見表4. 各組之間的最大反應速率和平均OD相近，但封閉0.5 h的P/N最大，其Cv最小，因此選擇0.5 h作為最適封閉時間.

表4 封閉時間對vmax和OD的影響

2.3.5 多抗孵育時間的確定 抗原與抗體是逐漸結(jié)合的過程，二者的反應時間對結(jié)合效果有一定影響. 多抗不同孵育時間對vmax和OD的影響的結(jié)果見表5. 在37 ℃孵育0.5 h的平均OD、P/N最高和Cv最低，所以選擇0.5 h作為多抗的最適孵育時間.

表5 抗原與多抗作用時間對vmax和OD的影響

2.3.6 二抗孵育時間的確定 最適質(zhì)量濃度二抗、37 ℃溫育不同時間的實驗結(jié)果如表6所示，二抗孵育2 h后其最大速率最大，平均OD、P/N最大和Cv最小，因而選擇2 h作為二抗最適孵育時間.

表6 二抗作用時間對vmax和OD的影響

2.3.7 標準曲線的繪制 DA按照10 000、5 000、2 500、1 000、500、250、100、50、25、10、5.0、2.5、1.0、0 ng/mL 稀釋，用優(yōu)化后的最適條件進行ic-ELISA檢測，實驗結(jié)果如表7所示. 以DA質(zhì)量濃度為橫坐標，抑制率(B/B0×100%)為縱坐標繪制曲線，其中B為樣品的OD，B0為空白對照的OD. 通過檢測發(fā)現(xiàn)DA質(zhì)量濃度在5～2 500 ng/mL之間時，檢測結(jié)果呈良好的線性關系，曲線斜率較大，選此區(qū)域進行線性回歸方程擬合(圖5)，在該區(qū)域擬合曲線具有良好的趨勢. 最后在該質(zhì)量濃度區(qū)間繪制標準曲線(圖6)，通過計算得到標準曲線方程式為y=-22.74x+89.04(R2=0.943).

表7 間接ELISA法測定不同質(zhì)量濃度DA的結(jié)果

2.4 貝類樣品中DA質(zhì)量分數(shù)的檢測

制備好的貝類樣品在和制備標準曲線相同的條件下用ic-ELISA法進行檢測. 5 g貝類樣品組織勻漿濃縮后，用勻漿液調(diào)整體積至5 mL，得到質(zhì)量濃度為1 g/mL的待測樣品. 將分光光度計測出的平均OD代入標準曲線方程中計算出勻漿樣品中的檢測質(zhì)量濃度后，再根據(jù)貝類勻漿樣品的質(zhì)量濃度計算出貝類樣品中DA的質(zhì)量分數(shù)，其最終計算結(jié)果如表8所示.

圖5 間接競爭ELISA法測定DA質(zhì)量濃度的標準曲線擬合曲線

Figure 5 The fitting DA curve with ic-ELISA

圖6 間接競爭ELISA法測定DA質(zhì)量濃度的標準曲線

表8 貝類樣品中DA質(zhì)量分數(shù)的檢測

3 討論

隨著不斷增長的赤潮事件，藻毒素污染日益嚴重[1-2]，時刻危害著水生動物和人類生命健康安全[11-16,22]. 鑒于DA對人類潛在的威脅較大，生活在海邊的人們更是易受害群體，因此建立一個簡單、快速、準確的DA檢測方法尤為必要.

DA是小分子半抗原，只有反應原性，不具備免疫原性，其必須與大分子載體蛋白偶聯(lián)制備成完全抗原，才能刺激機體產(chǎn)生免疫應答反應[23]. 目前已經(jīng)有多種制備完全抗原的偶聯(lián)方法[24-26]. 本研究運用活潑酯法[27]，通過EDC和NHS來提高偶聯(lián)效率，將DA分別與載體蛋白KLH和BSA偶聯(lián). 通過計算得出DA-KLH和DA-BSA的偶聯(lián)比分別為44∶1和16∶1，高于其它研究[23]. 免疫小鼠后獲得的抗體效價高達210 000 units/mL(圖4)，進一步證實了偶聯(lián)蛋白的良好效果，為后續(xù)檢測方法的建立奠定了基礎.

目前檢測軟骨藻酸最成熟的方法是高效液相色譜法[28]. HPLC檢測快速靈敏、檢測限低，非常適用于科研單位對產(chǎn)品的精細檢測，但是高效液相色譜儀過于昂貴，檢測過程中對操作人員與樣品預處理的要求較高，基層養(yǎng)殖與檢測單位條件有限，往往無法實現(xiàn)用HPLC對樣品的大規(guī)模檢測[29]. 免疫膠體金技術(shù)是近年來發(fā)展最快的檢測手段之一[30]，因其簡單快速、便于攜帶、對地域及使用人員不受限、無需儀器和試劑、價格低廉等優(yōu)點而被廣泛應用，但是免疫膠體金技術(shù)只能進行樣品含量的定性檢測，無法對樣品精確定量，靈敏度較低. 而本實驗選用的ic-ELISA是將抗原-抗體特異性結(jié)合，通過酶與底物的催化作用發(fā)生顯色反應的一種免疫學檢測技術(shù). 在樣品檢測方面具有高效、操作簡便、靈敏度高、可批量和定量檢測等優(yōu)點，因此建立一個標準化ELISA檢測方法的實踐性更強. 在ELISA反應中，由于抗原、抗體的使用量有最佳搭配比的反應特性，酶制劑催化效果易受環(huán)境影響和整體實驗時長等多方面因素的考慮，本研究在獲得軟骨藻酸抗血清的基礎上，對間接競爭ELISA檢測反應中各個因素逐步進行優(yōu)化，根據(jù)反應中抗體使用量、反應時長、各孔OD、最大速率、孔間差異系數(shù)Cv及陽性孔與陰性孔OD的比值(P/N)等來選擇最適工作條件. 在確定的最佳條件基礎上，對1 ng/mL～10 μg/mL范圍內(nèi)的DA進行檢測(表7)，發(fā)現(xiàn)在5～2 500 ng/mL范圍內(nèi)檢測結(jié)果有良好的線性趨勢(圖5)，通過線性回歸方程的擬合，成功建立了可在該質(zhì)量濃度范圍內(nèi)檢測DA質(zhì)量濃度的ELISA標準曲線(圖6). 得出其標準曲線方程式為y=-22.74x+89.04 (R2=0.943).

市場購買的貝類樣品DA質(zhì)量分數(shù)檢測顯示：4種貝類樣品的消化腺和肌肉中均檢測出一定量的DA，樣品總檢出率高達100%(表8)，比陳西平等[31](檢出率50%)、吉薇等[21](檢出率82%)以及文獻[32-34]中的檢出率都要高. 這可能是由于近年來全球日益嚴重的赤潮現(xiàn)象造成的. 4種貝類樣品的檢出質(zhì)量分數(shù)在43.848 ～675.943 ng/g之間(表8)，其中紫貽貝肌肉中檢出質(zhì)量分數(shù)最高為675.943 ng/g，而北極貝肌肉中檢出質(zhì)量分數(shù)最低為43.848 ng/g，均遠低于加拿大制定的安全限量標準20 μg/g[17]. 這為DA檢測試劑盒的研發(fā)與應用提供了直接實驗基礎，也進一步提高了基層人員能定量檢測海產(chǎn)品中DA質(zhì)量分數(shù)的可能性. 在一線基層人員的使用中，由于沒有足夠條件開展樣品的透析濃縮等預處理，水產(chǎn)品組織樣品僅能進行簡單的勻漿過濾就檢測. 這種簡單處理可能會給檢測結(jié)果帶來一定的偏差，比如小塊組織的殘留會導致假陽性的增加. 關于一線基層人員使用條件的摸索和優(yōu)化，將會在后續(xù)的研究中開展.

本研究的不足之處在于：DA質(zhì)量分數(shù)檢測的最低限為5 ng/mL. 最低限檢測的靈敏度有待進一步提高，或許通過制備DA的單克隆抗體來進行檢測能解決這一問題.