鄭守晶，王玉貝，鄭明鋒

（1.福建農(nóng)林大學(xué) 金山學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002）

據(jù)國內(nèi)外學(xué)者研究表明，銀耳多糖具有提高機體免疫力、降低血糖和血脂、消炎消腫、潤滑腸道、抗腫瘤及癌癥等功效，且用小鼠進行毒性試驗，試驗表明銀耳多糖對小鼠無毒性，對小鼠的生理功能均無毒副作用[3]。由此可見，銀耳多糖安全性高、生理活性好。

近年來，隨著科技及經(jīng)濟的發(fā)展，人們生活在一個快節(jié)奏的環(huán)境中，人類的亞健康問題也變得屢見不鮮，特別是胃腸道健康問題。因此，我們不斷研究及生產(chǎn)保護胃腸道的食品、保健品或藥物，如益生菌飲料等[4]。益生菌主要有3種即乳酸菌、芽孢桿菌和酵母菌[5]，而乳酸菌是我國最早公布，功效較好且應(yīng)用廣[5]的菌種，也是作為添加在保護胃腸道食品和保健品中最常用的菌種之一[6]。

應(yīng)用于人體的乳桿菌主要有植物乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、嗜酸乳桿菌等[7]。植物乳桿菌，是重要的益生菌之一[8]，是乳酸菌的一種，菌種呈直或彎的桿狀，單個、成對或成鏈狀，兼性厭氧或厭氧，是一種無芽孢的革蘭氏陽性菌[9]。植物乳桿菌的生理功能豐富[10]，目前逐漸被人們認識和了解，并在食品發(fā)酵、乳制品工業(yè)和功能性食品得到廣泛應(yīng)用[11]。

銀耳多糖對乳桿菌的益生作用雖有報道，但報道仍較少。銀耳多糖和植物乳桿菌都對胃腸道有一定保健作用，而銀耳多糖對植物乳桿菌的益生作用還未有過研究。因此本課題分別以葡萄糖、銀耳多糖為唯一碳源，測定植物乳桿菌在葡萄糖和銀耳多糖為唯一碳源培養(yǎng)下的生長曲線、電導(dǎo)率、細胞表面完整性及活菌數(shù)，探究銀耳多糖對植物乳桿菌的增殖效應(yīng)，期望為銀耳多糖在植物乳桿菌的增殖應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)，為研制具有較高保健功能和市場潛力的維護胃腸道健康功能食品提供理論基礎(chǔ)，有利于提升銀耳及銀耳多糖的附加值、增加經(jīng)濟效益及社會效益。

1 試驗材料

1.1 試驗菌種與材料

植物乳桿菌，購買于西安千葉草生物科技有限公司；

銀耳多糖，由福建農(nóng)大食品安全科技有限公司提供。

1.2 試驗原料

試驗用MRS液體培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基中，將濃度為20 g/L（2%）的葡萄糖分別依次換成0.20%、0.40%、0.60%、0.80%、1.0%的銀耳多糖，其他成分不變，121 ℃條件下滅菌20 min。

試驗用MRS固體培養(yǎng)基：在試驗用液體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)pH后加入瓊脂粉18 g，加熱煮沸，滅菌條件同上。

2 試驗方法

2.1 菌種的分離純化與活化

2.1.1 植物乳桿菌純化培養(yǎng)

潔凈工作臺無菌操作中，挑取穿刺植物乳桿菌一環(huán)，接種到裝有50 mL無菌MRS液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，將接種好的錐形瓶及厭氧產(chǎn)氣袋同時放入立式厭氧培養(yǎng)袋中，密封培養(yǎng)袋，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～48 h。將培養(yǎng)好稀釋后的1 mL培養(yǎng)液進行平板涂布，待平板凝固后，將其與厭氧產(chǎn)氣袋放入圓底立式厭氧培養(yǎng)袋中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)36 h[5]。培養(yǎng)結(jié)束之后，選取長勢較好的單菌落進行純化培養(yǎng)。再將純化后的菌懸液與滅菌后的50%甘油（菌懸液∶50%甘油=1∶1）混合后保存到菌種保藏管中，-20 ℃條件下保存。

2.1.2 菌種的活化

取純化培養(yǎng)后的植物乳桿菌接種至MRS液體培養(yǎng)基的錐形瓶，置于厭氧袋中，在37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)約12～48 h。

2.2 植物乳桿菌生長曲線的測定

使用比色管濁度法[5，12]進行植物乳桿菌生長曲線測定。取2.1.2活化之后的植物乳桿菌，以5%的接種量分別轉(zhuǎn)接至銀耳多糖為唯一碳源的不同銀耳多糖濃度的MRS培養(yǎng)基中，銀耳多糖的含量分別為0.20%、0.40%、0.60%、0.80%、1.00%。接種后，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每4 h取5 mL發(fā)酵液，測定發(fā)酵液的OD600值。繪制植物乳桿菌的生長曲線，觀察植物乳桿菌利用不同濃度銀耳多糖的生長狀況。

2.3 植物乳桿菌發(fā)酵液電導(dǎo)率的測定

電導(dǎo)率是生態(tài)學(xué)中以數(shù)字表示溶液傳導(dǎo)電流的能力，是該種溶液離子含量的表現(xiàn)[13]。本試驗中，將葡萄糖為唯一碳源進行培養(yǎng)的植物乳桿菌發(fā)酵液作為空白對照組，以不同濃度的銀耳多糖為唯一碳源培養(yǎng)的植物乳桿菌發(fā)酵液作為試驗組，利用測量植物乳桿菌發(fā)酵液的電導(dǎo)率，來觀察銀耳多糖培養(yǎng)的植物乳桿菌的細胞完整性是否遭到破壞。

以5%的接種量取2.1.2活化后的植物乳桿菌培養(yǎng)液分別接種到以葡萄糖和不同濃度的銀耳多糖作為單一碳源的MRS培養(yǎng)基中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)期。采用電導(dǎo)率儀測定分別測定不同碳源的植物乳桿菌發(fā)酵液的電導(dǎo)率。通過觀察植物乳桿菌在利用葡萄糖以及不同濃度銀耳多糖作為單一碳源的MRS培養(yǎng)基后的電導(dǎo)率的不同，來判斷植物乳桿菌利用不同碳源后的細胞完整性。

2.4 植物乳桿菌活菌數(shù)的測定

以5%的接種量取2.1.2活化之后的植物乳桿菌培養(yǎng)液分別接種至含有0.20%、0.40%、0.60%、0.80%、1.00%的銀耳多糖作為單一碳源MRS培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h。將培養(yǎng)后的植物乳桿菌發(fā)酵液用滅菌的生理鹽水進行梯度稀釋，分別為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的7個梯度，取后3個梯度，采用平板傾注法制備不同濃度的銀耳多糖作為單一碳源的MRS培養(yǎng)基平板，37 ℃培養(yǎng)72 h后統(tǒng)計菌落總數(shù)，測定植物乳桿菌活菌數(shù)。

2.5 植物乳桿菌細胞結(jié)構(gòu)的觀察

分別以5%的接種量取2.1.2活化之后植物乳桿菌培養(yǎng)液，接種到以葡萄糖和不同濃度銀耳多糖作為單一碳源MRS液體培養(yǎng)基，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取培養(yǎng)后發(fā)酵液，8600 r/min離心后，收集菌體，用普通制片法（涂片→干燥→固定→石炭酸復(fù)紅液染色→水洗→干燥），制片后用光學(xué)顯微鏡進行菌體利用不同葡萄糖和不同濃度多糖后表面形態(tài)差異的觀察。

2.6 數(shù)據(jù)處理與分析

本試驗所得的數(shù)據(jù)采用DPS軟件進行試驗統(tǒng)計。植物乳桿菌的生長曲線采用多因素?zé)o重復(fù)試驗統(tǒng)計進行方差分析處理，植物乳桿菌的電導(dǎo)率及活菌數(shù)采用單因素試驗統(tǒng)計進行方差分析處理，方差分析處理后采用Duncan新復(fù)極差法進行比較。

3 結(jié)果與分析

3.1 銀耳多糖對植物乳桿菌生長的影響

據(jù)前人研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液的吸光度值（OD值大?。┠荏w現(xiàn)發(fā)酵液中的菌體含量高低，待測懸液中的菌體數(shù)目越多，菌體濃度越大，菌懸液的吸光度值就會越大，測定發(fā)酵液OD值時，可見光分光光度計波長通常設(shè)置為600 nm[5]。因此，本試驗中植物乳桿菌在600 nm處的OD值變化可間接反映出隨著培養(yǎng)時間的延長，在不同濃度的銀耳多糖培養(yǎng)條件下植物乳桿菌發(fā)酵液的含菌量的變化，即生長狀況。不同濃度的銀耳多糖為碳源隨著培養(yǎng)時間的變化對植物乳桿菌的生長曲線影響見圖1。

由圖1可知，活化的植物乳桿菌轉(zhuǎn)接至不同濃度的銀耳多糖MRS培養(yǎng)基中的生長比較緩慢。在轉(zhuǎn)接后4～8 h內(nèi)，植物乳桿菌的生長比較快速，其中利用0.20%和0.40%的銀耳多糖的菌體量較高于利用0.60%、0.80%和1.00%的銀耳多糖；8～16 h內(nèi)，植物乳桿菌的生長仍呈上升趨勢，但0.60%、0.80%和1.00%的銀耳多糖濃度下，增殖速度較4～8 h內(nèi)緩慢。因此，考慮植物乳桿菌生長受銀耳多糖濃度及培養(yǎng)時間的影響，采用DPS中二因素?zé)o重復(fù)試驗統(tǒng)計進行方差分析及用Duncan新復(fù)極差法進行多重比較。方差分析表及多重比較表分別如表1、表2和表3所示。

通過表1方差分析可知，植物乳桿菌在銀耳多糖濃度間和培養(yǎng)時間間的生長情況差異極顯著；由表2多重比較后可得，隨著培養(yǎng)時間的延長，在5%顯著水平和1%顯著水平下，植物乳桿菌在0.20%、0.40%和其他濃度下的銀耳多糖中均有差異，且根據(jù)圖1，可以觀察出植物乳桿菌在0.20%的銀耳多糖生長速度最快，發(fā)酵液含菌量最多，所以選擇銀耳多糖濃度為0.20%。

表1 植物乳桿菌生長曲線方差分析表

表2 銀耳多糖濃度間的多重比較（Duncan多重比較）

表3 培養(yǎng)時間間的多重比較（Duncan多重比較）

由表3多重比較后可得，隨著銀耳多糖濃度的增加，在5%和1%顯著性水平下每隔4h植物乳桿菌生長情況均有差異，且由圖1可知，16 h后植物乳桿菌在0.20%銀耳多糖濃度下的生長仍處于對數(shù)上升趨勢。因此，選擇0.20%的銀耳多糖和0.20%的葡萄糖為唯一碳源進行對比，每隔4 h測定一次OD值來觀察植物乳桿菌的后續(xù)生長情況，生長曲線如圖2所示。

如圖2所示，轉(zhuǎn)接后4 h內(nèi)，植物乳桿菌長勢較慢。在轉(zhuǎn)接4～16 h內(nèi)，利用葡萄糖的植物乳桿菌開始快速生長，菌體濃度也較利用銀耳多糖的高，利用銀耳多糖的植物乳桿菌則較利用葡萄糖的生長趨勢緩慢。轉(zhuǎn)接16 h后，利用葡萄糖的植物乳桿菌生基本上不再增長，且菌體濃度趨于平穩(wěn)，進入穩(wěn)定期的菌液OD600 nm為2.57；利用銀耳多糖的植物乳桿菌呈快速增長趨勢，菌體濃度也不斷升高。轉(zhuǎn)接28 h后，利用銀耳多糖的菌體濃度已明顯高于利用葡萄糖的菌體濃度，且到36 h后，利用銀耳多糖的植物乳桿菌才基本上不再增殖并開始趨于穩(wěn)定，穩(wěn)定期的OD 600 nm為3.95。因此，銀耳多糖相對于葡萄糖能夠提高植物乳桿菌的體量，說明銀耳多糖對植物乳桿菌的增殖起到促進作用。

3.2 銀耳多糖對植物乳桿菌發(fā)酵液電導(dǎo)率的影響

植物乳桿菌利用不同碳源對其發(fā)酵液電導(dǎo)率的影響如表4所示，可知植物乳桿菌利用各不同濃度的銀耳多糖和葡萄糖為碳源進行增殖后，發(fā)酵液電導(dǎo)率幾乎相同。對表4中的數(shù)據(jù)進行方差分析，結(jié)果如表5所示，表明植物乳桿菌利用葡萄糖和不同濃度銀耳多糖作為碳源后，其發(fā)酵液電導(dǎo)率無顯著差異（p＞0.05）。由此可知植物乳桿菌在利用葡萄糖和銀耳多糖后細胞的完整性沒有發(fā)生變化，因此銀耳多糖可以作為植物乳桿菌的碳源。

表4 植物乳桿菌利用不同碳源后發(fā)酵液的電導(dǎo)率

3.3 不同銀耳多糖濃度下的植物乳桿菌活菌數(shù)

植物乳桿菌在不同濃度的銀耳多糖下活菌數(shù)量如表8所示。不同銀耳多糖濃度間菌落總數(shù)的方差分析如表7所示，可得植物乳桿菌利用不同濃度的銀耳多糖的菌落總數(shù)差異極顯著（p＜0.01）；銀耳多糖濃度間菌落總數(shù)的多重比較如表8所示，在5%和1%顯著水平下，植物乳桿菌利用0.20%的銀耳多糖與0.40%、0.60%、0.80%和1.00%的活菌數(shù)均存在顯著差異，且可以得出植物乳桿菌利用0.20%銀耳多糖的活菌數(shù)最多。

3.4 銀耳多糖對植物乳桿菌細胞形態(tài)的影響

如圖3為光學(xué)顯微鏡觀察到的植物乳桿菌利用不同濃度的銀耳多糖和葡萄糖為唯一碳源進行培養(yǎng)的菌體形態(tài)圖，可以觀察到植物乳桿菌利用不同濃度的銀耳多糖和葡萄糖的菌體表面形態(tài)幾乎沒有區(qū)別，說明銀耳多糖對植物乳桿菌的菌體無毒害作用，可作為植物乳桿菌的益生元。

表5 植物乳桿菌利用不同碳源后發(fā)酵液電導(dǎo)率的方差分析表

表6 植物乳桿菌利用不同銀耳多糖濃度的菌落總數(shù)統(tǒng)計表

表8 銀耳多糖濃度間菌落總數(shù)的多重比較（Duncan多重比較）

表7 不同銀耳多糖濃度間菌落總數(shù)的方差分析表

4 結(jié)論

通過對植物乳桿菌生長曲線的測定，可知植物乳桿菌利用不同濃度的銀耳多糖的菌體含量有顯著差異，其中利用0.20%銀耳多糖的生長速度比利用其它濃度快，菌體量也較高。植物乳桿菌利用相同濃度的銀耳多糖和葡萄糖為唯一碳源對比下，在轉(zhuǎn)接16 h內(nèi)，利用葡萄糖的植物乳桿菌開始快速生長，菌體濃度也較利用銀耳多糖的高，利用銀耳多糖的植物乳桿菌則較利用葡萄糖的生長趨勢緩慢。轉(zhuǎn)接16 h后，利用葡萄糖的植物乳桿菌生基本上不再增長，且菌體的濃度基本不變，已經(jīng)進入穩(wěn)定期的OD 600 nm為2.57；利用銀耳多糖的植物乳桿菌呈快速增長趨勢，菌體濃度也不斷提高。接種28 h后，利用銀耳多糖的植物乳桿菌的菌體濃度已高于利用葡萄糖的菌體濃度，且到36 h后，利用銀耳多糖的植物乳桿菌才基本上不再增殖并開始趨于穩(wěn)定，穩(wěn)定期的OD 600 nm為3.951。因此，銀耳多糖能促進植物乳桿菌的增殖。

通過測定植物乳桿菌利用銀耳多糖和葡萄糖的發(fā)酵液電導(dǎo)率，發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌在利用兩種不同碳源的情況下，電導(dǎo)率幾乎不變，且不同濃度的同一碳源（銀耳多糖）中的電導(dǎo)率不存在顯著差異，說明植物乳桿菌在利用銀耳多糖后，其細胞完整性并未遭到破壞，因此銀耳多糖對植物乳桿菌無損害作用。

通過統(tǒng)計植物乳桿菌利用不同濃度的銀耳多糖的活菌數(shù)，可知植物乳桿菌在0.20%銀耳多糖培養(yǎng)中，活菌數(shù)最多，且較其他濃度差異較顯著。通過光學(xué)顯微鏡觀察植物乳桿菌利用不同碳源后的菌體表面形態(tài)，可以發(fā)現(xiàn)利用不同濃度的銀耳多糖后，其菌體表面形態(tài)與利用葡萄糖的并無差異，進一步證實了銀耳多糖對植物乳桿菌無毒害作用，可以作為植物乳桿菌的益生元。

結(jié)合植物乳桿菌的生長曲線、電導(dǎo)率、活菌數(shù)統(tǒng)計及菌落形態(tài)變化的結(jié)果，可以得出本次試驗銀耳多糖可以作為植物乳桿菌的益生元，且植物乳桿菌利用銀耳多糖的最適濃度為0.20%。