柯振華

[福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院 國家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心(福州)，福建 福州 350002]

蠟樣芽孢桿菌為革蘭氏陽性菌，兼性需氧型，可形成橢圓形芽孢。大多數(shù)引起食物中毒的蠟樣芽孢桿菌有鞭毛，可運(yùn)動(dòng)，在普通瓊脂上生成的菌落呈不透明灰白色，表面干燥，邊緣常呈擴(kuò)展?fàn)?，菌落較大，直徑4～6 mm。

由蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒一般發(fā)生在夏秋季，具有比較明顯的季節(jié)性[1～5]。如果食物被少量蠟樣芽孢桿菌污染，且繼續(xù)置于適宜蠟樣芽孢桿菌生長的溫度下儲存，菌體會(huì)迅速大量地繁殖，進(jìn)而釋放毒素，被人誤食之后，嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致死亡[6～9]。

我國由蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒多為淀粉類食品引起，例如餿飯、米粉、酒釀、炒飯等，而國際上多是乳制品、肉、蔬菜、甜點(diǎn)心、調(diào)味汁等引起的食物中毒，該菌的致病能力與其分泌的毒素有關(guān)[10～17]。由于蠟樣芽孢桿菌的廣泛分布及其所分泌毒素對人們造成的嚴(yán)重威脅，建立高效穩(wěn)定可靠的蠟樣芽孢桿菌檢測方法體系對食品安全具有重大意義。

隨著外賣的興起以及人民生活消費(fèi)方式的轉(zhuǎn)變，餐飲食品已經(jīng)成為人們?nèi)粘Ｉ畹闹匾糠郑捎诓惋嬍称芳庸\(yùn)的特殊性以及自然界中蠟樣芽孢桿菌的廣泛分布，在餐飲食品中存在較大的蠟樣芽孢桿菌污染風(fēng)險(xiǎn)。在我國，對蠟樣芽孢桿菌的檢測主要基于國家標(biāo)準(zhǔn)方法GB 4789.14—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 蠟樣芽胞桿菌檢驗(yàn)》，該方法步驟較多，操作過程復(fù)雜，檢測過程需要3～5 d的時(shí)間，難以滿足餐飲食品快速檢測需求，因此，急需開發(fā)一種快速準(zhǔn)確的餐飲食品中蠟樣芽孢桿菌的篩查方法。PCR作為基因檢測技術(shù)，具有高靈敏度、高特異性等優(yōu)點(diǎn)，目前已經(jīng)被國內(nèi)外科學(xué)家廣泛應(yīng)用于病原菌的篩查檢測[18～24]。

為了節(jié)約檢測時(shí)間，提高檢測效率，本研究擬基于實(shí)時(shí)熒光PCR檢測技術(shù)開發(fā)一套完整的餐飲食品中蠟樣芽孢桿菌的檢測方法體系。主要技術(shù)路線包括使用胰酪胨大豆多黏菌素肉湯培養(yǎng)基對樣品中的目標(biāo)菌進(jìn)行預(yù)增菌，采用熱裂解法提取樣品核酸，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)特異性地檢測樣液中的蠟樣芽孢桿菌基因成分。

在建立穩(wěn)定可靠的蠟樣芽孢桿菌檢測體系后，為了驗(yàn)證所建立方法體系的有效性與適用性，我們在市場中隨機(jī)抽樣采集了315份餐飲食品樣本開展檢測工作。檢測結(jié)果表明，應(yīng)用本研究方法可在抽樣檢驗(yàn)的25份餐飲食品中檢測出蠟樣芽孢桿菌基因成分，檢出率為7.93%。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株

1.1.2 餐飲食品樣品

購自市場中各大超市、餐館、集體食堂、快餐店、小吃店等。采用無菌抽樣方式采集樣品，每份樣品獨(dú)立包裝并按序列編號，做好標(biāo)記，每份樣品至少采集200 g(mL)，冷藏(4 ℃)條件下4 h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢驗(yàn)。

1.1.3 試劑

胰酪胨大豆多黏菌素肉湯培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；

實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)用預(yù)混液購自上海生工生物工程股份有限公司；

DNA提取試劑盒購自德國凱杰公司。

1.2 主要儀器

核酸蛋白測定儀：美國伯樂公司；

7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測系統(tǒng)：美國應(yīng)用生物系統(tǒng)有限公司；

臺式離心機(jī)：德國艾本德公司；

生物安全柜：德國貝克公司；

Milli-Q超純水儀：德國密理博公司；

VITEK Compact II全自動(dòng)微生物鑒定藥敏系統(tǒng)：法國梅里埃公司。

1.3 方法

1.3.1 預(yù)增菌

蠟樣芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株接種于100 mL胰酪胨大豆多黏菌素肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h。餐飲食品取25 g，加入225 mL 胰酪胨大豆多黏菌素肉湯培養(yǎng)基中，拍擊混勻150 s，37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h。

1.3.2 DNA模板的制備方法

在核酸提取方法的選擇上，我們主要采取兩種方法提取試樣DNA，第一種方法是熱裂解法，第二種方法是試劑盒法。

⑴ 熱裂解法提取DNA：用移液器小心移取預(yù)增菌液2.0 mL，置于離心管中，10000 r/min離心10 min。棄上清，沉淀用150 μL TE緩沖液懸浮，于100 ℃金屬浴加熱10 min，加熱結(jié)束后，10000 r/min離心10 min。取上清作為DNA模板溶液。

⑵ 試劑盒法提取DNA：按照Qiagen試劑盒操作說明書進(jìn)行DNA提取。

表1 引物探針信息

1.3.3 引物探針的設(shè)計(jì)與合成

本文根據(jù)蠟樣芽孢桿菌基因組保守序列設(shè)計(jì)合成蠟樣芽孢桿菌特異性的引物與探針，具體引物探針信息見表1，引物探針委托上海生工生物工程有限公司合成。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)參數(shù)

實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系：在30 μL PCR體系中，實(shí)時(shí)熒光PCR預(yù)混液15 μL，上游、下游引物各1 μL，探針0.5 μL，模板DNA溶液3.0 μL，滅菌蒸餾水補(bǔ)足體積至30 μL。

實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)參數(shù)：94 ℃、10 min，94 ℃、15 s，60 ℃、1 min，45個(gè)循環(huán)。

1.3.5 靈敏度試驗(yàn)

采用熱裂解法提取的蠟樣芽孢桿菌基因組DNA作為模板溶液，使用核酸蛋白測定儀測定基因組DNA的濃度與純度，將其梯度稀釋后進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)，繪制各濃度梯度的PCR擴(kuò)增曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法特異性驗(yàn)證試驗(yàn)

為了驗(yàn)證所建立蠟樣芽孢桿菌實(shí)時(shí)熒光PCR方法的特異性，本研究將蠟樣芽孢桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、大腸埃希氏菌O157∶H7、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌與大腸埃希氏菌等菌株接種于前增菌培養(yǎng)液中，培養(yǎng)12 h后采用熱裂解法提取各菌株的基因組DNA。

根據(jù)優(yōu)化后的實(shí)時(shí)熒光PCR方法，使用蠟樣芽孢桿菌檢測引物探針對上述6株常見病原菌基因組DNA進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，目標(biāo)菌蠟樣芽孢桿菌出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增曲線，而在其他陰性對照菌株DNA樣品中均無擴(kuò)增曲線，特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。

2.2 方法靈敏度試驗(yàn)

我們采用TE緩沖液將提取得到的蠟樣芽孢桿菌DNA溶液分別稀釋至100、10、1.0、0.1、0.01、0.001、0.0001 ng/μL，使用本研究方法體系分別對上述7個(gè)濃度梯度的DNA溶液進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR測試，實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

在6次重復(fù)試驗(yàn)中，100、10、1.0、0.1、0.01 ng/μL濃度的蠟樣芽孢桿菌DNA溶液中均出現(xiàn)了擴(kuò)增曲線，結(jié)果如圖2所示，0.001、0.0001 ng/μL的蠟樣芽孢桿菌DNA溶液未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線。結(jié)果表明，在DNA濃度的水平上，本研究方法的檢測靈敏度為0.01 ng/μL的蠟樣芽孢桿菌DNA溶液。

2.3 315份餐飲食品中蠟樣芽孢桿菌的檢測結(jié)果

用本研究建立的檢測方法對市場中采集的315份餐飲食品中的蠟樣芽孢桿菌進(jìn)行PCR檢測分析。

結(jié)果表明，應(yīng)用本方法在25份餐飲食品樣品中檢測出蠟樣芽孢桿菌特異性基因成分，檢出率為7.93%（25/315）。檢出陽性結(jié)果的餐飲食品增菌液經(jīng)微生物檢測方法以及VITEK驗(yàn)證，均為陽性，結(jié)果說明本方法檢測結(jié)果與微生物檢驗(yàn)方法結(jié)果高度一致，充分說明本研究方法的準(zhǔn)確性與可靠性。

3 討論

蠟樣芽孢桿菌由于其分布的廣泛性及所分泌毒素的危害性，引起人們的普遍關(guān)注。我國現(xiàn)行的國家標(biāo)準(zhǔn)方法如GB 4789.14—2014對于蠟樣芽孢桿菌的檢測需要3～5 d的時(shí)間，難以滿足餐飲食品對檢驗(yàn)時(shí)效性的要求。鑒于餐飲食品的特殊性以及蠟樣芽孢桿菌的危害性，本研究旨在建立一種能在短時(shí)間內(nèi)精確篩查餐飲食品中蠟樣芽孢桿菌的方法。

針對模板DNA的制備，本研究探索并比較了熱裂解法與試劑盒法在細(xì)菌DNA提取中的應(yīng)用差異。對同一份增菌液，本研究同時(shí)采用熱裂解法以及試劑盒法進(jìn)行DNA提取，PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明兩種方法所提取菌液DNA都能擴(kuò)增出目標(biāo)基因序列，擴(kuò)增曲線以及CT值無顯著性差異。但是，由于試劑盒成本較高且提取步驟多、耗時(shí)長，針對大批量樣品的DNA制備適用性不強(qiáng)，而熱裂解法提取菌液DNA時(shí)只需加入TE緩沖液，通過金屬浴加熱后離心的方式獲得菌液DNA，操作步驟簡潔，耗時(shí)短，一次性可以處理大批量的樣品。綜合考慮，本研究抽樣檢驗(yàn)的餐飲食品樣品主要采取熱裂解法提取DNA。

本文以蠟樣芽孢桿菌基因組中的 基因?yàn)榘行蛄?，設(shè)計(jì)并合成特異性的引物與探針，PCR特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，所設(shè)計(jì)引物探針僅針對蠟樣芽孢桿菌DNA有擴(kuò)增曲線，針對其他菌株DNA未見擴(kuò)增曲線，充分說明了引物探針的特異性良好。本文通過試驗(yàn)不斷篩選和優(yōu)化適宜的引物探針濃度與退火溫度等條件，從而保證蠟樣芽孢桿菌PCR檢測方法的穩(wěn)定性和結(jié)果的可重復(fù)性。

本文將DNA熱裂解提取法與實(shí)時(shí)熒光PCR檢測技術(shù)相結(jié)合，應(yīng)用于餐飲食品中蠟樣芽孢桿菌的檢測中，建立了一整套由樣品預(yù)增菌到DNA提取到實(shí)時(shí)熒光PCR檢測的方法，所建立方法簡便快捷，在18 h內(nèi)即可完成所有檢測工作，檢出限可達(dá)到0.01 ng/μL菌液DNA，特別適用于大批量樣品中蠟樣芽孢桿菌的快速篩查檢測，具有較好的推廣應(yīng)用前景。同時(shí)，針對餐飲食品及相關(guān)食品如面米制品、乳制品等中蠟樣芽孢桿菌的篩查檢測，本方法也具有較高的實(shí)用和推廣價(jià)值。