李 磊 徐孟輝 姜文劍 貢 鳴 許士俊 王曉龍 劉愚勇 李海洋 關(guān)欣亮 張宏家

體外循環(huán)(cardiac bypass,CPB)聯(lián)合低溫停循環(huán) (hypothemic circulatory arrest,HCA)廣泛用于主動(dòng)脈和復(fù)雜的先天性心臟病外科手術(shù)過程中[1-3]。然而HCA的最佳溫度選擇仍然存在爭(zhēng)議，既往研究鮮有涉及不同類型HCA對(duì)于腦損傷的大型動(dòng)物類研究，有關(guān)HCA過程中病理生理學(xué)改變的研究更是少之又少。HCA的應(yīng)用可以有效降低大腦代謝率，從而起到在術(shù)中保護(hù)大腦的作用[4-5]。據(jù)統(tǒng)計(jì)在應(yīng)用HCA手術(shù)中，術(shù)后30 d死亡率及死亡校正后的永久性神經(jīng)功能障礙發(fā)生率仍在19.4%和11.5%左右[6]。研究發(fā)現(xiàn)HCA通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、凋亡和壞死從而對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生有害影響[7-8]。

獲得應(yīng)用HCA患者的大腦標(biāo)本是非常困難的，因此相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是必要的。通過對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)用HCA后大腦標(biāo)本的系統(tǒng)性分析，可以為深入研究HCA相關(guān)腦損傷提供可靠證據(jù)。本研究目的是利用豬CPB模型中不同HCA類型大腦標(biāo)本及血清學(xué)檢測(cè)比對(duì)結(jié)果，通過對(duì)相關(guān)結(jié)果的系統(tǒng)性分析從而發(fā)現(xiàn)何種類型HCA更適用于臨床需要。

資料與方法

所有實(shí)驗(yàn)流程均按照北京安貞醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的規(guī)程進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)于阜外醫(yī)院北京動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，并按照國(guó)家科學(xué)院編制、國(guó)家衛(wèi)生研究院出版的《實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物護(hù)理與使用指南》進(jìn)行護(hù)理。

1.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 13只豬(阜外醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,北京)被隨機(jī)分為對(duì)照組3只(36 ℃)、深低溫停循環(huán)組(DHCA鼻咽溫15 ℃)5只和中低溫停循環(huán)組(MHCA鼻咽溫25 ℃)。實(shí)驗(yàn)組在實(shí)施麻醉、氣管插管及建立體外循環(huán)，對(duì)照組實(shí)施麻醉、氣管插管，并不建立體外循環(huán)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后三組動(dòng)物均進(jìn)行解剖取標(biāo)本。三組動(dòng)物年齡及體質(zhì)量無明顯差異[4～5個(gè)月/(100.2±5.1)kg]。停循環(huán)時(shí)間持續(xù)30 min，分別于10個(gè)時(shí)間點(diǎn)取血液樣本(圖1)。獲取血液標(biāo)本儲(chǔ)存于肝素管中并搖勻。血液標(biāo)本于4 ℃下3 000 r/min離心5 min，所得血清儲(chǔ)存于-80 ℃下，檢驗(yàn)前血清于4 ℃下解凍并再次以3 000 r/min速度離心1 min。具體采血時(shí)間點(diǎn)如下：TI=麻醉開始; T2=降溫至32℃; T3=降溫至目標(biāo)溫度; T4=停循環(huán)后30 min; T5=復(fù)溫至32℃; T6=復(fù)溫至36℃; T7=復(fù)溫至36℃后2 h; T8=復(fù)溫至36℃后4 h; T9=復(fù)溫至36℃后6 h; T10=復(fù)溫至36℃后24 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后通過矢狀面正中切口取出豬大腦標(biāo)本。

圖1 溫度變化趨勢(shì)圖

2.實(shí)驗(yàn)監(jiān)測(cè) 于仰臥位，經(jīng)股動(dòng)脈置入動(dòng)脈壓力導(dǎo)管進(jìn)行血壓監(jiān)測(cè)，經(jīng)右股靜脈置入靜脈導(dǎo)管實(shí)施輸液和采血。采用內(nèi)嵌式溫度探頭對(duì)鼻咽溫度進(jìn)行監(jiān)測(cè)。本實(shí)驗(yàn)分析監(jiān)測(cè)的血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)包括血壓、心率、氧分壓及ECG。

3.體外循環(huán)步驟 體外循環(huán)管路中預(yù)充明膠及乳酸鈉林格液，麻醉誘導(dǎo)后完全暴露心臟及升主動(dòng)脈。肝素化后將體外循環(huán)管路分別置入升主動(dòng)脈及右心房。手術(shù)過程經(jīng)體外循環(huán)檢測(cè)系統(tǒng)(MDD, 93/42/EEC, UK)監(jiān)護(hù)。低溫停循環(huán)的溫度由變溫水箱(MAQUET, HCU30, Germany)精確調(diào)節(jié)。體外循環(huán)建立后查紅細(xì)胞壓積為20～24%，期間血流維持在90～100 mL·kg-1·min-1，平均動(dòng)脈壓維持在60～90 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。鼻咽溫度降至32 ℃時(shí)，阻斷升主動(dòng)脈，于升主動(dòng)脈根部冠脈開口處灌注心臟停搏液。當(dāng)鼻咽溫降至目標(biāo)溫度時(shí)停止體外循環(huán)。于深低溫停循環(huán)組，降溫過程持續(xù)60 min左右，當(dāng)鼻咽溫度達(dá)到15 ℃時(shí)，變溫水箱繼續(xù)運(yùn)行，維持鼻咽溫度在15 ℃左右同時(shí)停止體外循環(huán)。低溫停循環(huán)30 min后，恢復(fù)體外循環(huán)運(yùn)行，鼻咽部溫度復(fù)溫至37 ℃。待實(shí)驗(yàn)對(duì)象血壓及心電波形穩(wěn)定后，緩慢脫離體外循環(huán)并保持存活24 h。中低溫停循環(huán)組的操作步驟與深低溫停循環(huán)組相同，但其低溫停循環(huán)溫度更高(25 ℃)。

圖2 腦組織切片病理染色

4.標(biāo)本檢測(cè) 獲取的大腦標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋，并切成6 mm厚的切片。對(duì)這些標(biāo)本行Bax、Bcl-2和Caspase3染色，以準(zhǔn)確檢測(cè)腦損傷程度。切片使用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的檢測(cè)法(TUNEL assay kit, Sigma, No. 11684795910, USA)檢測(cè)凋亡細(xì)胞，操作流程嚴(yán)格按照操作說明書進(jìn)行。經(jīng)驗(yàn)豐富的病理學(xué)家在高倍光學(xué)顯微鏡下對(duì)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，標(biāo)本分組對(duì)病理學(xué)家不可見。凋亡指數(shù)計(jì)算方式為：隨機(jī)選取4個(gè)高倍視野(200倍放大)的區(qū)域并對(duì)其中凋亡細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。可溶性蛋白- 100B (S-100B)是一種特異性表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的蛋白，有研究表明S-100B指標(biāo)與大腦神經(jīng)元損傷呈正相關(guān)。因此，本次實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)血液病理情況下中能透過血腦屏障的S-100B水平來評(píng)估深低溫停循環(huán)所引起的腦損傷程度。本實(shí)驗(yàn)還對(duì)所得血液樣本中的炎性因子(TNF-α、IL- 2及IL-6)，關(guān)鍵凝血因子(FXI、FVII)進(jìn)行了Elisa檢測(cè)。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有分析均采用SPSS 18.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL)系統(tǒng)分析，采用Kolmogorov-Smirnov方法檢測(cè)數(shù)據(jù)分布的正態(tài)性。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析或Wilcoxon秩和檢驗(yàn)對(duì)連續(xù)變量進(jìn)行比較。分類數(shù)據(jù)以頻數(shù)及百分比的形式，并使用卡方檢驗(yàn)或Fisher’s檢驗(yàn)進(jìn)行比較。采用Bonferroni校正分析的T檢驗(yàn)比較多次測(cè)量的10個(gè)時(shí)間點(diǎn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.組織樣本分析 實(shí)驗(yàn)組免疫組化染色(Bax、Bcl-2、Caspase 3)陽(yáng)性率明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組內(nèi)DHCA組與MHCA組(Bax、Bcl-2、Caspase 3)水平差異無統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05，圖2)。同樣，TUNEL染色的陽(yáng)性熒光直方圖顯示，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組間差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)，但兩組差異無統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05，圖3)。

腦組織切片分別行BAX、BCL-2、Caspase-3染色。統(tǒng)計(jì)藍(lán)色方框中的陽(yáng)性因子，并繪制相應(yīng)的直方圖。正常組與實(shí)驗(yàn)組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)

圖3 腦組織免疫熒光染色

采用DAPI GDNF和TUNEL評(píng)價(jià)腦神經(jīng)元損傷程度。通過統(tǒng)計(jì)圖中綠色方框中TUNEL染色的熒光率并繪制直方圖，正常組與實(shí)驗(yàn)組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)

2.血液樣本分析 S-100B檢測(cè)結(jié)果如表1所示，T1～T4時(shí)間點(diǎn)兩組間結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05)。雖然在MHCA組T5～T6時(shí)間點(diǎn)S-100 B出現(xiàn)短暫上升 (T5;P=0.02, T6;P=0.02), 但在隨后的T7～T10時(shí)間點(diǎn)S-100 B迅速恢復(fù)至與DHCA組相似水平(P>0.05)。炎癥因子變化如圖4所示，炎性因子(TNF-α、IL- 2及IL-6)在DHCA組與MHCA組內(nèi)變化趨勢(shì)相似,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。凝血因子的變化如圖5所示，DHCA組與MHCA組關(guān)鍵凝血因子之間(FXI、FVII)比較發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 兩組可溶性蛋白- 100B分析結(jié)果

討 論

近40年來，HCA廣泛應(yīng)用于影響腦供血的外科手術(shù)中，其目的是在心血管外科手術(shù)中預(yù)防腦缺血相關(guān)損傷[9]。在大血管相關(guān)手術(shù)過程中，于HCA期間行主動(dòng)脈弓的修復(fù)是目前外科專家的共識(shí)[10-12]。自從20世紀(jì)50年代DeBakey和Cooley實(shí)施主動(dòng)脈弓部置換術(shù)以來[10-12]，不同類型的HCA分別被應(yīng)用于該手術(shù)之中。當(dāng)前常規(guī)HCA分為四種類型: 28.1～34 ℃為輕度低溫停循環(huán)，20.1～28 ℃為中度低溫停循環(huán)，14.1～20 ℃為深度低溫停循環(huán)和≤14 ℃的極度低溫停循環(huán)[14]。

在過去，DHCA因其顯著降低腦代謝率、興奮性遞質(zhì)釋放、離子流入和血管通透性而受到外科醫(yī)生的青睞[15]。然而臨床研究證據(jù)表明，DHCA的降溫及復(fù)溫階段消耗大量時(shí)間，手術(shù)及體外循環(huán)時(shí)間延長(zhǎng)引起的并發(fā)癥將會(huì)是一個(gè)嚴(yán)重的問題[16-18]。當(dāng)前臨床醫(yī)生開始在主動(dòng)脈弓部手術(shù)中選擇MHCA技術(shù)來減輕腦損傷，但是何種類型HCA可以最大程度的減輕大腦損傷尚未確定。在臨床實(shí)踐中，很難在手術(shù)后直接獲得腦部樣本，并且只能通過臨床癥狀間接的評(píng)估腦損傷的程度。在本研究中，我們使用了具有與人類類似遺傳特征的豬來構(gòu)建HAC模型，手術(shù)后收集標(biāo)本，并對(duì)標(biāo)本進(jìn)行病理分析。在比較實(shí)驗(yàn)組大腦生物學(xué)參數(shù)的同時(shí)，本研究還系統(tǒng)、整體地研究了對(duì)照組腦損傷的程度，從而為選擇何種類型低溫停循環(huán)策略提供了理論依據(jù)。

目前，對(duì)于HCA后神經(jīng)系統(tǒng)的變化已成為人們關(guān)注的話題，但是很少有研究在不進(jìn)行腦灌注的情況下對(duì)神經(jīng)元的損傷進(jìn)行研究，在HCA期間應(yīng)用選擇性腦灌注已成為減少神經(jīng)損傷的一種策略[19]。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，伴有選擇性腦灌注的MHCA對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有與DHCA相似的保護(hù)功能[20]。Keeling等回顧了3 265例行順行腦灌注全主動(dòng)脈弓置換術(shù)的患者，發(fā)現(xiàn)MHCA和DHCA組患者的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥或院內(nèi)死亡率無差異[21]。Gong也得出了類似的結(jié)論[22]。此外，Arnaoutakis等發(fā)現(xiàn)，順行性腦灌注的MHCA患者似乎比逆行性腦灌注的DHCA患者預(yù)后結(jié)局更差[23]。為了獲得可靠的不同類型HCA對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)影響相關(guān)數(shù)據(jù)，在這項(xiàng)研究中我們并未應(yīng)用選擇性腦灌注。

圖4 兩組不同時(shí)點(diǎn)炎性因子變化趨勢(shì)圖

圖5 兩組不同時(shí)點(diǎn)凝血因子變化趨勢(shì)圖 兩組間比較，*P<0.05

在本研究中，我們對(duì)位于TUNEL染色腦標(biāo)本中的凋亡細(xì)胞進(jìn)行了檢測(cè)并且計(jì)算其凋亡指數(shù)。Bax是一種與Bcl-2同源的水溶性蛋白質(zhì)。Bax基因可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，屬于Bcl-2基因家族。Bcl-2可以抑制許多細(xì)胞毒性因子引起的細(xì)胞死亡，而Bax的過表達(dá)可以拮抗Bcl-2的保護(hù)作用并引起細(xì)胞死亡[24]。另外，已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)Bax與Bcl-2的比例是抑制細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素。因此，我們使用免疫組織化學(xué)技術(shù)測(cè)量了腦細(xì)胞凋亡的水平，以確定其中凋亡相關(guān)蛋白(例如Bax，Bcl-2和Caspase-3)呈陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量。傳統(tǒng)理論認(rèn)為，DHCA患者相對(duì)無腦灌注的MHCA患者，會(huì)得到更佳的腦保護(hù)[25]。但是，我們的結(jié)果顯示在腦組織凋亡測(cè)試中(Bax，Bcl-2和Caspase-3)，這兩組并沒有顯著差異。重要的是，在MHCA組中S-100B的水平恢復(fù)的很快，這表明，即是在沒有選擇性腦灌注的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間腦損傷程度也是相似的。

TNF-α通過釋放一系列炎癥介質(zhì)參與炎癥反應(yīng)，它可以通過增加血管通透性并引起炎性細(xì)胞浸潤(rùn)來導(dǎo)致組織損傷。因此，TNF-α被認(rèn)為在缺血再灌注損傷中起著重要作用[26]。此外，IL-2是人類細(xì)胞免疫最重要的調(diào)節(jié)劑，IL-2的主要免疫調(diào)節(jié)作用包括：誘導(dǎo)NK細(xì)胞的增殖，刺激增強(qiáng)其自然殺傷作用，以及激活巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞[27-28]。血漿中的IL-6濃度與嚴(yán)重的腦損傷有關(guān)，血漿IL-6水平可預(yù)測(cè)腦損傷患者的短期預(yù)后[29]。我們隨后的研究表明，在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間，炎癥因子的水平(包括TNF-α，IL-2和IL-6)無明顯差異，因此，可認(rèn)為兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間的炎癥程度相似。由此，我們發(fā)現(xiàn)DHCA并未有效減輕炎癥，這與我們?cè)诙吣X組織樣本病理檢測(cè)并無差別的結(jié)果相符。

凝血因子Ⅺ被激活為絲氨酸蛋白酶，通過激活內(nèi)源性凝血途徑促進(jìn)凝血。人凝血因子VII是外源性凝血途徑的初始酶，它已被廣泛用于治療有出血傾向或血友病的患者[30]。我們的研究表明，與炎癥系統(tǒng)不同，凝血系統(tǒng)在溫度變化時(shí)會(huì)發(fā)生劇烈變化，在HCA期間和之后，凝血因子XI和凝血因子VII水平的變化尤為明顯，這與較低溫度可能抑制凝血系統(tǒng)功能的觀點(diǎn)一致。在這兩種凝血系統(tǒng)中，外源性凝血系統(tǒng)受低溫影響最嚴(yán)重。

實(shí)際上，我們的研究表明，DHCA并不能減輕更多的腦損傷，而且DHCA會(huì)伴有諸多并發(fā)癥，例如嚴(yán)重出血和對(duì)血液制品的需求增加[31]。我們的實(shí)驗(yàn)還表明，即使在沒有腦灌注的情況下，適當(dāng)升高溫度也不會(huì)增加炎癥反應(yīng)。總之，與DHCA相比，MHCA需要的冷卻和復(fù)溫的時(shí)間更短，從而可能減少長(zhǎng)時(shí)間的CPB所致的腦損傷。同時(shí)與DHCA相比，MHCA對(duì)凝血系統(tǒng)的影響要更小。另外，MHCA也沒有加重炎癥反應(yīng)。 將來，應(yīng)在更多的外科手術(shù)中使用MHCA，以避免DHCA的不利影響。

這項(xiàng)研究受到一些因素限制。在本實(shí)驗(yàn)中，我們使用肝素抗凝管收集血液樣本，這可能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有影響。由于大型動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的高經(jīng)費(fèi)問題，我們只建立了15℃和25℃低溫停循環(huán)豬模型，沒有對(duì)其他溫度下或其他器官進(jìn)行進(jìn)一步的研究，對(duì)于其他溫度下豬腦保護(hù)的比較還有待深入研究。本研究雖最大限度模擬臨床，但所得結(jié)論仍需臨床深入驗(yàn)證，并不能貿(mào)然應(yīng)用于臨床實(shí)際。

總體來講，MHCA是一種具有與DHCA相似的優(yōu)勢(shì)的方法，如損傷生物標(biāo)志物水平和腦凋亡程度相似。兩者均與較低的腦血管神經(jīng)事件發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。但是，MHCA對(duì)凝血系統(tǒng)的影響較小，并且與DHCA相比，需要的冷卻和復(fù)溫時(shí)間較短。該研究為MHCA在緊急主動(dòng)脈弓修復(fù)中的臨床安全性和有效性提供了證據(jù)，表明MHCA比DHCA更合適于臨床實(shí)踐。

致謝我們感謝李嘉晨, 吳子寧, 裴昱強(qiáng)(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院-北京心肺血管疾病研究所)在稿件撰寫過程中對(duì)其進(jìn)行了審閱與修改。