馬藝欣 楊 偉 王 琪

肺癌目前是全球最常見惡性腫瘤之一。2018年我國(guó)新增肺癌病例約77.4萬[1-2]。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌中最常見的組織學(xué)類型，占肺癌總?cè)藬?shù)的80%以上[3]。有數(shù)據(jù)顯示，>65歲的老年肺癌人群超過肺癌總?cè)藬?shù)的60%。由于其發(fā)病隱匿，絕大多數(shù)患者在確診時(shí)已處于肺癌進(jìn)展期(advanced NSCLC)，腫瘤局部病變侵襲廣泛甚至出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，喪失手術(shù)根治機(jī)會(huì)，而以順鉑為代表的鉑類藥物化療是該類患者的一線治療方案[4]但是由于耐藥等原因，部分在化療初期對(duì)藥物敏感的患者后期療效欠佳。另外，許多老年患者在化療期間會(huì)出現(xiàn)不可耐受的并發(fā)癥。因此，尋找出一個(gè)可以評(píng)估NSCLC化療療效的檢測(cè)標(biāo)志物對(duì)于老年肺癌患者的個(gè)體化防治非常重要。

胸腺素β4(thymosin β4，Tβ4)是一種肌動(dòng)蛋白的鰲合分子，它在多種有核細(xì)胞中表達(dá)[5]。研究表明，Tβ4 可以抑制炎癥細(xì)胞的趨化、促進(jìn)血管的形成、創(chuàng)傷的愈合，也可以促進(jìn)缺血缺氧而損傷的神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行自我修復(fù)[6]。在近年來的研究顯示，Tβ4在多種腫瘤細(xì)胞中存在高表達(dá)，并可能參與上皮向間質(zhì)表型轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchy-mal transition，EMT)的機(jī)制[7]。在HOU等的研究中指出，Tβ4在肺癌中的高表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)[8]。因此，本研究通過檢測(cè)Tβ4老年晚期NSCLC患者組織標(biāo)本中的表達(dá)情況，探索Tβ4的表達(dá)與臨床病理學(xué)特征及化療療效之間的關(guān)系，為老年晚期NSCLC患者化療療效的預(yù)測(cè)判斷提供證據(jù)。

資料與方法

1.一般資料 選擇收集2006年6月至2014年6月期間, 大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院病理組織學(xué)診斷的老年晚期NSCLC患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者年齡≥65歲；病理確診為NSCLC；按照國(guó)際肺癌研究協(xié)會(huì)(international association for the study of lung cancer，IASLC)最新頒布的第8版肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)III期和IV期患者[9]；有足夠的病理組織可供免疫組織化學(xué)檢測(cè)；無腦轉(zhuǎn)移；一線化療是含鉑的雙藥方案；化療前血常規(guī)、肝腎功能和心肌酶化驗(yàn)均正常；Karnofsky體能狀況(karnofsky performance status, KPS)評(píng)分≥70；在治療前、治療2個(gè)周期和治療4個(gè)周期后均進(jìn)行影像學(xué)檢查(胸腹部CT和頭顱MRI)；所有的患者均簽署化療知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往存在惡性腫瘤病史的患者；既往接受過化療、放療的患者；不能耐受或不愿意繼續(xù)治療的患者；缺乏足夠的組織標(biāo)本提供免疫組織化學(xué)檢測(cè)。

選取94例患者中，男性59例(62.8%)、女性35例(37.2%)；年齡65～79歲，中位年齡72.8歲。腺癌49例(52.1%)，鱗癌42例(44.7%)，其他3例(3.2%)。腫瘤組織高分化6例(6.4%)，中分化56例(59.6%)，低分化32例(34%)。接受紫杉醇類藥物聯(lián)合鉑類方案化療者4例(4.3%)，接受吉西他濱聯(lián)合鉑類化療方案者12例(12.8%)，接受長(zhǎng)春瑞濱聯(lián)合鉑類化療者15例(16%)，接受培美曲塞聯(lián)合鉑類化療者7例(7.4%)，接受多西他賽聯(lián)合鉑類化療36例(38.3%)，接受其他藥物聯(lián)合鉑類化療者20例(21.3%)。

2. 臨床資料收集及療效評(píng)估 記錄患者的臨床特征、化療方案及影像學(xué)指標(biāo)。以化療2個(gè)或4個(gè)周期后腫瘤縮小的最大程度作為腫瘤緩解的評(píng)判依據(jù)，按實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)1.1 版(response evaluation criertia in solid tumor version 1.1，RECIST v1.1)評(píng)價(jià)近期療效，分為完全緩解(complete response，CR)、部分緩解(partial response，PR)、疾病穩(wěn)定(stable disease，SD)和疾病進(jìn)展(progressive disease， PD);有效率=(CR病例數(shù)+PR病例數(shù))/總病例數(shù)×100%。記錄一線化療后患者的無進(jìn)展生存期(progression free survival，PFS)和總生存期(overall survival，OS)。PFS是指從一線化療開始至PD或任何原因?qū)е滤劳龅臅r(shí)間；OS是指從一線化療開始至死亡或隨訪終點(diǎn)的時(shí)間。隨訪方式為定期來院門診或電話隨診。

3.免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Tβ4的表達(dá) (1)抗體與試劑：抗Tβ4抗體購(gòu)于Abcam公司(ab14335)，SP通用試劑盒、DAB顯色試劑二管、Tween20及EDTA抗原修復(fù)液均購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

(2)方法：切取4 μm厚石蠟包埋組織，采用免疫組化SP法檢測(cè)Tβ4的表達(dá)，二甲苯脫蠟水化，梯度乙醇脫水，3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化酶，PBS緩沖液沖洗，高壓進(jìn)行抗原熱修復(fù)，稀釋好的Tβ4抗體(1∶2 000)在37.0 ℃溫育120 min；封閉劑溫育30 min，后二抗溫育30 min，1:20DAB溶液顯色5 min，自來水充分沖洗、蘇木精復(fù)染、酒精脫水、透明、封片。以PBS代替一抗為陰性對(duì)照組。

(3)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn): 在光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞可見顏色梯度由淡黃色至棕褐色的顆粒，則判定為陽性表達(dá)。染色強(qiáng)度無異于背景者判定為陰性表達(dá)。每張病理切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，依據(jù)腫瘤細(xì)胞染色強(qiáng)度(A)×染色比例(B)進(jìn)行評(píng)分。染色強(qiáng)度積分如下：無著色0份，棕黃色1份，棕褐色2份，顯色比例評(píng)分如下：≤0% 0分、50%～70% 1分、<70% 2分。評(píng)分結(jié)果：A×B：0～1分為陰性、2分為低表達(dá)、<2分為高表達(dá)。

4. 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)(率)表示，采用χ2檢驗(yàn)；Tβ4表達(dá)與PFS、OS的關(guān)系采用Kaplan-Meier法分析，Log-rank檢驗(yàn)差異性；采用多因素Logistic回歸分析影響NSCLC化療療效的因素。預(yù)后的多因素分析采用COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1. Tβ4在老年晚期NSCLC患者組織中的表達(dá) 在94例NSCLC中，Tβ4在均呈陽性表達(dá)，在肺癌組織中可見陽性部位主要集中在胞漿內(nèi)，彌漫性分布，可見棕黃色或棕褐色顆粒。其中在癌組織中的高表達(dá)為37例(39.4%)，85例癌旁組織中Tβ4的主要為弱陽性表達(dá)即低表達(dá)，顯色不明顯或呈淡黃色(圖1)。

圖1 免疫組化法檢測(cè)Tβ4的表達(dá) A： Tβ4 在非小細(xì)胞肺癌組織中高表達(dá)； B：Tβ4 在非小細(xì)胞肺癌組織中低表達(dá)

2. Tβ4的表達(dá)與臨床病理學(xué)關(guān)系 Tβ4的表達(dá)水平與老年進(jìn)展期NSCLC患者的性別、分化程度、組織學(xué)類型、化療方案、T分期及TNM分期無關(guān)(P<0.05，表1)。

3. Tβ4的表達(dá)與鉑類化療療效、PFS和OS的關(guān)系 Tβ4高表達(dá)患者的化療有效率為16.2%，低表達(dá)患者化療有效率為43.9%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.012)。Pearson相關(guān)分析表明，Tβ4表達(dá)與化療療效(r=0.327，P=0.001)和PFS(r=0.387，P=0.002)和OS(r=0.404，P=0.001)相關(guān)。

表1 Tβ4表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系[n(%)]

4. 生存分析及多因素分析 在94例老年進(jìn)展期NSCLC患者中，中位PFS 7(4.796～9.204)個(gè)月，中位OS 18(14.203～21.797)個(gè)月。Kaplan-Meier生存分析顯示Tβ4高表達(dá)組的中位PFS為(4±0.333)個(gè)月(95%CI：3.347～4.653)，中位OS為(12±1.351)個(gè)月(95%CI：9.352～14.648)。低表達(dá)組的中位PFS為(10±1.013)個(gè)月(95%CI：8.014～11.986)，中位OS為(21±3.774)個(gè)月，(95%CI：13.602～28.398)。Tβ4高表達(dá)組的PFS和OS明顯低于低表達(dá)組(圖2)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在校正性別、分化程度、TNM分期及T分期等因素后，Logistic回歸分析表明Tβ4的表達(dá)水平是一線化療療效的預(yù)測(cè)因素(P=0.001,表2)。在校正性別、病理類型、分化程度、化療方案、TNM分期及T分期等因素后，多因素分析表明Tβ4是預(yù)測(cè)一線化療PFS的預(yù)測(cè)因素(P=0.008)。而在校正性別、病理類型、分化程度、化療方案、TNM分期及T分期等因素后，發(fā)現(xiàn)Tβ4(P=0.038)及TNM分期(P=0.025)及T分期(P=0.017)均為預(yù)測(cè)一線化療OS的預(yù)測(cè)因素(表3)。

圖2 Kaplan-Meier生存曲線分析 A：Tβ4高表達(dá)和低表達(dá)的老年晚期NSCLC患者PFS生存曲線；B：Tβ4高表達(dá)和低表達(dá)的老年晚期NSCLC患者PFS生存曲線

表2 化療反應(yīng)率相關(guān)因素的Logistic回歸分析

表3 NSCLC特異性生存率預(yù)后的Cox多因素分析

討 論

以往研究發(fā)現(xiàn)，Tβ4在甲狀腺髓樣癌、膀胱癌、肝癌、結(jié)腸癌、胃腸道間質(zhì)腫瘤、口腔鱗狀細(xì)胞癌及神經(jīng)母細(xì)胞瘤等多種腫瘤細(xì)胞中存在異常表達(dá),且腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[10-14]。Clark等在人和小鼠的黑色素瘤細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn), Tβ4誘導(dǎo)的形態(tài)學(xué)改變與EMT非常相似。之后的多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，Tβ4的高表達(dá)不僅可以調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生，而且調(diào)節(jié)通過促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)從而增加腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力[15-17]。Tβ4誘導(dǎo)肌球蛋白IIA，β-肌動(dòng)蛋白和原肌球蛋白的表達(dá)，這些蛋白的表達(dá)是由應(yīng)力纖維或肌動(dòng)蛋白束組成， 它誘導(dǎo)粘著斑蛋白，例如紐蛋白、Talin蛋白、5-整合素、粘著斑激酶(pp125FAK)，并可能與p130 Crk相關(guān)底物(Cas)和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白paxillin交聯(lián)。Tβ4和肌動(dòng)蛋白都是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的內(nèi)源性底物。因此，Tβ4在與轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶相關(guān)的凋亡過程中起著重要作用，有研究提出這可能依賴于PP125FAK及Paxillin的磷酸化[18-20]。在對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的研究表明，Tβ4通過白介素8依賴性的機(jī)制促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖，還顯示出Tβ4可以刺激血管生成，傷口愈合和影響凝血功能，所有這些對(duì)于腫瘤細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)移表型起到了至關(guān)重要的作用。Tβ4通過影響粘著斑蛋白從而使肌動(dòng)蛋白的網(wǎng)絡(luò)重組，導(dǎo)致細(xì)胞-基質(zhì)相互作用，影響細(xì)胞形狀，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性，細(xì)胞存活以及調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力[21]。目前已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)Tβ4在肺癌中存在高表達(dá)，在體外實(shí)驗(yàn)中，Tβ4的基因沉默可減弱NSCLC細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲，并降低異種移植腫瘤組織的致瘤性[22]。基于上述證據(jù)，Tβ4作為癌癥關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子促使我們研究了Tβ4在老年NSCLC進(jìn)展期患者中的表達(dá)情況及與化療療效的關(guān)系。

本研究結(jié)果顯示，Tβ4表達(dá)與老年晚期NSCLC的患者接受一線含鉑化療的療效、PFS及OS相關(guān)。Tβ4高表達(dá)的NSCLC患者的化療有效率明顯低于低表達(dá)人群，預(yù)后更差。綜上所述，Tβ4高表達(dá)與老年晚期NSCLC患者的化療反應(yīng)率及生存期相關(guān)，Tβ4可作為預(yù)測(cè)老年晚期NSCLC化療敏感性及預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物。但是本研究為回顧性研究，結(jié)果可能會(huì)存在偏移，還需要大樣本的前瞻性臨床研究進(jìn)一步驗(yàn)證。