黃振勇 張娥珍 淡明 梁曉君 韋保耀 韋馨平

摘? 要：以鐵皮石斛為原料，利用乳酸菌發(fā)酵生產風味飲料，對鐵皮石斛汁發(fā)酵前后多糖、石斛堿、總酚、總黃酮含量及抗氧化能力變化情況進行研究。結果表明，植物乳桿菌對石斛多糖的消耗最高，比原汁減少了41.63%。植物乳桿菌與保加利亞乳桿菌按1∶1混合發(fā)酵對石斛堿的消耗最高，比原汁減少了4.92%。經乳酸菌發(fā)酵，總酚、總黃酮含量均比發(fā)酵前有提高，其中以植物乳桿菌與保加利亞乳桿菌按比例1∶1混合發(fā)酵提高幅度最大，總酚與總黃酮含量分別提高了24.17%和31.87%。鐵皮石斛汁發(fā)酵后對羥基自由基、DPPH自由基和超氧陰離子自由基的清除能力均比發(fā)酵前有所增強。本研究說明，利用乳酸菌發(fā)酵可提高鐵皮石斛活性物質的溶出率，從而提高鐵皮石斛乳酸菌飲品抗氧化功能。

關鍵詞：鐵皮石斛;乳酸菌;發(fā)酵;活性物質;抗氧化

中圖分類號：S567? ? ? 文獻標識碼：A

Effects of Lactobacillus Fermentation on Active Substance and Antioxidant Activity of Dendrobium candidum

HUANG Zhenyong1， ZHANG Ezhen2*， DAN Ming2， LIANG Xiaojun2， WEI Baoyao1， WEI Xinping2

1. College of Light Industry and Food Engineering， Guangxi University， Nanning， Guangxi 530005， China; 2. Institute of Agro-products Processing Science and Technology， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning， Guangxi 530007， China

Abstract： Dendrobium candidum was used to produce beverage fermented by Lactobacillus. The changes of polysaccharide， dendrobium， total polyphenols， total flavonoids and antioxidant capacity were discussed before and after fermentation. The consumption of dendrobium polysaccharide was the highest after fermented with Lactobacillus plantarum，

41.63% lower than the original juice. The consumption of dendrobium was the highest when fermented with Lactoba-

cillus plantarum and Lactobacillus bulgaricus in 1∶1， 4.92% lower than the original juice. The content of total phenol

and total flavonoids increased after fermentation. The content of total phenol and total flavonoids increased by 24.17%

and 31.87% after fermented with Lactobacillus plantarum and Lactobacillus bulgaricus in 1∶1. The scavenging ability

of hydroxyl radicals， DPPH radicals and superoxide anions after fermentation increased also. The experiment showed that the active substance dissolution rate of D. candidum could be improved through Lactobacillus fermentation， and the antioxidant function of the fermented beverage from D. candidum be improved as well.

Keywords： Dendrobium candidum; Lactobacillus; fermentation; active substances; antioxidant

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.03.021

鐵皮石斛（Dendrobium candidum）為蘭科草本植物，是石斛中藥用價值最高的品種[1]，適宜在溫暖、濕潤、半陰半陽的環(huán)境中生長。因其表皮呈鐵綠色而得名[2]，主要分布于云南、廣西、廣東、貴州、江西等地，民間素有“救命仙草”、“藥中黃金”之美稱[3]，列“中華九大仙草”之首[4]。鐵皮石斛富含石斛多糖、生物堿、酚類、類黃酮、氨基酸和多種微量元素，具有增強免疫力[5]、抗腫瘤[6]、降低血糖[7]、抗氧化[8-10]、延緩衰老[11]等功能，其顯著的生理活性為發(fā)展功能食品提供良好的原料來源。隨著生活水平的日益提高，在高強度、高節(jié)奏的生活狀態(tài)下，越來越多的人出現亞健康狀態(tài)，新型高效保健食品有待研發(fā)，保健功能極佳的鐵皮石斛擁有廣闊的發(fā)展前景[12]。

乳酸菌是一類具有保健型功能的益生菌，可產生大量乳酸，提高食品營養(yǎng)價值[13]。陳永芳等[14]研究表明，乳酸菌可提高胡蘿卜汁的抗氧化能力。張慧蕓等[15]在用微生物發(fā)酵谷物的研究中，也證實微生物確實能提高總酚含量及抗氧化性。目前，鐵皮石斛的使用多以鮮條榨汁、楓斗煲湯、干品粉碎沖調等形式為主。本研究利用乳酸菌對鐵皮石斛汁進行發(fā)酵，探討其發(fā)酵前后石斛多糖、石斛堿、總酚、總黃酮含量以及抗氧化能力的變化情況，為豐富鐵皮石斛市場產品種類，提升鐵皮石斛產品的附加值，同時為鐵皮石斛深加工產品研發(fā)提供參考。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 材料與試劑? 鐵皮石斛鮮條，購于廣西南寧市。

發(fā)酵菌種：植物乳桿菌菌劑（Lactobacillus plantarum，以下簡寫LP）、保加利亞乳桿菌（Lacto ba cillus bulgaricus，以下簡寫LB），購于河北一然生物科技有限公司。

沒食子酸（純度≥98%）、石斛堿標準品（純度≥98%）、DPPH（純度≥98%），上海源葉生物科技有限公司;福林酚試劑應用液（1 mol/L），北京索萊寶科技有限公司;鄰二氮菲、過氧化氫（30%）、葡萄糖、鄰苯三酚、無水乙醇、無水碳酸鈉、磷酸、苯酚、濃硫酸、硝酸鋁、亞硝酸鈉，均為國產分析純。

1.1.2? 儀器與設備? SW-CJ-1FD單人單面潔凈工作臺（蘇州蘇潔凈化設備有限公司）、LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）、TW323L精密電子天平（日本島津）、JM-L50型膠體磨（鄭州玉祥機械設備有限公司）、TG-200B臺式空氣恒溫培養(yǎng)搖床（上海天星實驗儀器制造有限公司）和Genesys10S UV-VIS紫外分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific）。

1.2? 方法

1.2.1? 工藝流程? 鐵皮石斛→除雜清洗→切段打漿→膠體磨研磨→過濾→分裝→滅菌→冷卻、接種→發(fā)酵→冷藏→指標測定。

1.2.2? 石斛汁的制備? 選取新鮮鐵皮石斛鮮條，用清水洗凈表面泥沙、污垢，去離子水燒開后將洗凈的石斛鮮條放入開水中，開水煮沸1～2 min，撈出瀝干。將冷卻后的石斛鮮條用沸水消煮過的刀具切成小段，按質量比1∶80比例加入飲用純凈水進行打漿。將石斛漿液置于膠體磨中，先粗磨后進行細磨。將細磨后的石斛汁用200目的濾布進行過濾，濾渣經膠體磨反復研磨，過濾直至幾乎無濾渣殘留，合并濾液。將鐵皮石斛漿液分裝于三角瓶，置于滅菌鍋中，110 ℃滅菌10 min，取出冷卻備用。

1.2.3? 發(fā)酵劑的制備? 將冰箱中保藏的植物乳桿菌（LP）、保加利亞乳桿菌（LB）分別接種兩環(huán)到10%脫脂乳培養(yǎng)基中，42 ℃恒溫培養(yǎng)到凝乳，同條件轉接3～4次直到凝乳穩(wěn)定，隨后依次接種到含有20%、40%、80%的鐵皮石斛汁脫脂乳培養(yǎng)基中，最后接入純的石斛汁中，發(fā)酵成熟后，4 ℃冰箱存放作為生產發(fā)酵劑。

1.2.4? 發(fā)酵和冷藏? 分別接種2%植物乳桿菌發(fā)酵劑（LP）、保加利亞乳桿菌發(fā)酵劑（LB）以及混合發(fā)酵菌劑（體積比LP∶LB=1∶1）于滅好菌的石斛汁中，42 ℃恒溫培養(yǎng)6 h即得發(fā)酵飲料，4 ℃冰箱冷藏。同時以不接種菌劑作為原汁對照（CK）。

1.2.5? 測定指標及方法? 多糖含量的測定采用苯酚硫酸法[16];石斛堿的測定采用酸性染料比色法[17];總酚含量用福林酚法[18]測定;總黃酮含量用分光光度法[19]測定;DPPH自由基清除能力參考劉靜等[20]的方法測定;羥基自由基清除能力采用鄰二氮菲Fe2+氧化法測定[21];超氧陰離子清除能力采用鄰苯三酚自氧化法[22]測定。

1.3? 數據處理

采用Origin 2017軟件對數據進行統(tǒng)計和差異顯著性分析（P<0.05）

2? 結果與分析

2.1? 乳酸菌發(fā)酵對多糖含量的影響

從圖1可知，經乳酸菌發(fā)酵后，鐵皮石斛汁中的多糖含量比原汁均有所降低，采用2種乳酸菌及其組合進行發(fā)酵，對多糖含量的變化均有顯著性差異（P<0.05）。利用植物乳桿菌和保加利亞

乳桿菌分別發(fā)酵鐵皮石斛汁，多糖含量分別比原汁降低了41.63%和41.43%，而保加利亞乳桿菌與植物乳桿菌以1∶1的配比進行發(fā)酵時，石斛汁中的多糖含量從原來的5.02%降至3.82%，降低23.9%。從實驗結果來看，發(fā)酵菌種對石斛汁中的多糖含量有較大影響，單菌種發(fā)酵對鐵皮石斛汁中多糖含量的消耗較大，復合菌種降低了對多糖的消耗。

2.2? 乳酸菌發(fā)酵對石斛堿含量的影響

對發(fā)酵前后樣品中石斛堿含量進行測定，結果如圖2所示。發(fā)酵后與發(fā)酵前相比，石斛堿的

含量略有下降，其中以1∶1配比的混合菌接種發(fā)酵后的石斛堿含量減少最大，減少量在4.92%左右。減少的部分可能是乳酸菌生長活動產生的代謝產物對石斛堿有降解作用，或者是乳酸菌利用石斛堿并將其轉化成其他的物質，使其含量有所變化。從實驗結果來看，總體上乳酸菌對石斛堿含量的影響不大，與未發(fā)酵的石斛汁幾乎相近，采用2種乳酸菌及其組合發(fā)酵石斛汁后對石斛堿含量的變化均無顯著性差異（P>0.05）。

2.3? 乳酸菌發(fā)酵對總酚含量的影響

對發(fā)酵前后的樣品液進行總酚含量的測定，結果如圖3所示。經乳酸菌發(fā)酵后發(fā)酵液中的酚類物質含量均有所提高。單菌種發(fā)酵條件下，植物乳桿菌發(fā)酵液比未發(fā)酵原汁的總酚含量顯著提高9.02%（P<0.05）;保加利亞乳桿菌發(fā)酵液比未發(fā)酵原汁的總酚含量顯著提高5.62%（P<0.05）;混合菌發(fā)酵條件下，總酚含量由發(fā)酵前的0.228%提高到0.283%，提高24.17%，差異顯著（P<0.05）。以上結果說明，利用乳酸菌發(fā)酵鐵皮石斛汁能有效提高酚類物質的含量，且多菌混合發(fā)酵效果優(yōu)于單一菌種。乳酸菌在繁殖過程中由于生理代謝產生的一些酶類對鐵皮石斛細胞壁結構產生分解作用，細胞壁中的酚類物質能更好地溶解釋放出來，從而使發(fā)酵汁中酚類物質含量增加。

2.4? 乳酸菌發(fā)酵對總黃酮含量的影響

鐵皮石斛含有多種黃酮類化合物，由于分子量小，易被人體吸收，參與人體多種生理代謝活動，具有較強的抗氧化能力。由圖4可知，乳酸菌發(fā)酵后的石斛汁較發(fā)酵前總黃酮含量有所提高，植物乳桿菌發(fā)酵對黃酮含量提高效果略優(yōu)于保加利亞乳桿菌，2種菌種混合使用效果更好。與原汁相比，植物乳桿菌對總黃酮含量有顯著提高（P<0.05），保加利亞乳桿菌對黃酮含量的提高無顯著差異（P>0.05）。在保加利亞乳桿菌與植物乳桿菌混合發(fā)酵條件下，總黃酮含量從發(fā)酵前的1.265%提高到1.669%，提高31.87%，差異性顯著（P<0.05）。

2.5? 乳酸菌發(fā)酵對DPPH自由基清除能力的影響

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的自由基，清除劑能與其進行電子配對而逐漸消失。由圖5知，在實驗使用濃度范圍內，鐵皮石斛汁對DPPH自由基的清除能力與使用劑量大小有一定的相關性。低濃度下，石斛原汁與發(fā)酵汁對DPPH自由基的清除率無明顯差異，隨著使用劑量的增加，清除率逐漸有所差異。在使用劑量大于0.8 mL時，保加利亞乳桿菌與植物乳桿菌混合發(fā)酵對DPPH自由基的清除率明顯高于單一菌種發(fā)酵，且與原汁相比，差異性顯著（P<0.05）。植物乳桿菌單獨發(fā)酵對DPPH自由基的清除能力與保加利亞乳桿菌單獨發(fā)酵時相近，幾乎無差別，與原汁相比，兩者對DPPH自由基清除能力均無顯著性差異（P>0.05）。總體上看，石斛乳酸菌發(fā)酵液對DPPH自由基的清除率高于石斛原汁。

2.6? 乳酸菌發(fā)酵對羥基自由基清除能力的影響

羥基自由基具有很強的氧化能力，過多的羥基存在能夠對人體造成極大的傷害。鐵皮石斛汁發(fā)酵前后對羥基自由基的清除能力如圖6所示。在實驗劑量范圍內，鐵皮石斛原汁對羥基自由基的清除能力隨著使用劑量增加呈上升趨勢，但增幅不大;石斛發(fā)酵汁在使用劑量較低時清除能力增加不明顯，隨著劑量的加大，對羥基自由基的清除能力逐漸有差異。植物乳桿菌單獨發(fā)酵對羥基自由基的清除能力整體上比保加利亞乳桿菌單獨發(fā)酵的效果略優(yōu)，與原汁相比，植物乳桿菌發(fā)酵對羥基自由基清除能力有顯著性差異（P< 0.05）?；旌暇l(fā)酵在低劑量時（≤0.4 mL）對羥基自由基的清除能力與單菌種發(fā)酵無差別，甚至低于單菌種發(fā)酵;在使用劑量較大時（>0.4 mL）混合菌發(fā)酵對羥基自由基的清除能力逐漸高于單菌種發(fā)酵。與原汁相比，采用保加利亞乳桿菌與混合菌種發(fā)酵對羥基自由基的清除能力均無顯著性差異（P>0.05）

2.7? 乳酸菌發(fā)酵對超氧陰離子自由基清除能力的影響

如圖7所示，在實驗所用劑量范圍內，隨著劑量的增加，鐵皮石斛原汁和發(fā)酵汁對超氧陰離子的清除能力均逐步提高。在使用劑量達到1.2 mL后，鐵皮石斛原汁對超氧陰離子的清除能力增強趨勢不明顯，幾乎呈平穩(wěn)狀態(tài);經混合菌發(fā)酵后的石斛汁，隨著劑量的增加，清除能力逐步增強。植物乳桿菌發(fā)酵后清除效果與保加利亞乳桿菌幾乎相近，無明顯差別;混合菌發(fā)酵對超氧陰離子的清除能力比單一菌種強。從總體上看，發(fā)酵汁對超氧陰離子的清除能力始終優(yōu)于石斛原汁。產生此現象可能是發(fā)酵汁中黃酮類物質含量差異導致，黃酮類物質對超氧陰離子清除具有較密切的相關性。與原汁相比，單菌種與混合菌種發(fā)酵對超氧陰離子的清除能力均有顯著性差異（P<0.05），其中混合菌種發(fā)酵差異極顯著（P< 0.01）。

3? 討論

鐵皮石斛是名貴的傳統(tǒng)中藥材，具有極高的藥用價值，富含石斛多糖、生物堿、氨基酸等活性物質，其中以活性多糖為主，植物活性多糖具有良好的抗氧化能力[23-25]，每一種活性物質都有其特殊的保健功效。目前國內鐵皮石斛產品以微粉、浸膏、提取物以及護膚品為主導[26]，大部分仍屬于初級加工產品，產品附加值低，更新慢，導致近幾年來鐵皮石斛市場不景氣。因此，開發(fā)一款方便使用，同時具有高保健價值的產品是當前石斛產業(yè)亟待解決的問題。乳酸菌對人體健康、胃腸道功能、人體免疫力等具有改善作用，有較好的抗菌作用和抗衰老作用[27]。國內乳酸菌應用技術已相當成熟，但相應的產品標準、管理還不夠完善，乳酸菌市場還比較混亂，如何使乳酸菌產品市場規(guī)范化是目前乳酸菌行業(yè)發(fā)展的重中之重。

多糖是鐵皮石斛有效物質的代表，含有多種生物學活性，對腫瘤抑制、血糖降低以及人體免疫功能調節(jié)具有一定的輔助作用。除此之外，鐵皮石斛多糖還具有抗衰老、抗氧化等功效。目前，對鐵皮石斛多糖的研究主要集中在結構組成、含量、提取純化工藝以及生理活性方面，在加工應用方面相對較少。本研究發(fā)現，利用乳酸菌發(fā)酵與鐵皮石斛原汁相比多糖含量均有所降低，其中減少量最大為植物乳桿菌發(fā)酵，相比原汁減少了41.63%。其次為保加利亞乳桿菌，減少量為41.43%，植物乳桿菌與保加利亞乳桿菌按比例1∶1混合發(fā)酵，多糖減少量為原汁的23.90%。乳酸菌利用發(fā)酵底物的糖分作為碳源生長繁殖，并且在繁殖過程中分泌乳酸、酶等代謝產物。植物性多糖對乳酸菌的生長有一定的促進作用[28]，乳酸菌能將簡單的植物性多糖水解成葡萄糖、半乳糖等單糖，再利用這些單糖合成胞外多糖。鐵皮石斛多糖具有相當復雜的結構，目前對植物性多糖的一級結構和高級結構以及對乳酸菌的胞外多糖作用機理的研究尚少，還有待深入研究。

石斛堿也是鐵皮石斛的重要活性成分，是石斛質量評判的參考物質之一，石斛堿在石斛中含量較少，但其功能卻相當強大。據研究報道，石斛堿具有降血糖[29]、抗白內障[30]、改善記憶力減退[31]等作用，此外還具有鎮(zhèn)痛、解熱、促進胃液分泌、助消化[32]等功能。本研究中，經不同乳酸菌發(fā)酵過后，石斛汁中總生物堿含量有所降低，其中以植物乳桿菌與保加利亞乳桿菌混合發(fā)酵時含量最低，比原汁減少了4.92%。石斛堿的減少可能是乳酸菌的代謝活動產生的酶類對其產生了降解，或是改變了其結構特性，使其含量降低。

總酚和總黃酮是植物體中具有良好抗氧化功能的一類物質。本研究發(fā)現，經乳酸菌發(fā)酵后的鐵皮石斛汁總酚、總黃酮含量均比未發(fā)酵的石斛汁高，且不同乳酸菌對總酚和總黃酮含量提高程度不同。采用植物乳桿菌發(fā)酵鐵皮石斛汁，總酚含量高于保加利亞乳桿菌發(fā)酵，這可能與植物乳桿菌的菌種特性有關，其分泌的乳酸及生物酶類對鐵皮石斛細胞壁的分解能力優(yōu)于保加利亞乳桿菌，使得鐵皮石斛細胞中的酚類物質能更多的釋放出來?；旌暇N發(fā)酵發(fā)揮了2種乳酸菌各自的優(yōu)勢，相互促進，使得石斛中的營養(yǎng)物質能夠更好的釋放出來。由此可見，利用微生物發(fā)酵提取植物活性物質的技術是可行的。

鐵皮石斛抗氧化能力與其活性物質的含量有一定的相關性，且與使用劑量呈一定的線性關系。在實驗所用劑量范圍內，低劑量時，鐵皮石斛原汁與發(fā)酵汁對DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除能力無明顯區(qū)別，但隨著劑量的加大，鐵皮石斛發(fā)酵汁對羥基自由基、DPPH自由基和超氧陰離子自由基的清除能力均比未發(fā)酵的石斛汁高，這與發(fā)酵前后多酚和總黃酮的變化情況相符。從研究結果上看，乳酸菌發(fā)酵鐵皮石斛汁過程中雖然消耗了少量的石斛多糖用于生長繁殖，但提高總酚、總黃酮等物質的溶出率，發(fā)酵液整體抗氧化能力較發(fā)酵前有所提高，在鐵皮石斛功能食品上面有一定的應用價值。

鐵皮石斛的價值決定其產品的市場定位必須高端化，但目前鐵皮石斛處于供過于求的狀態(tài)，深加工產品缺乏，產品形式急需更新。乳酸菌的發(fā)酵技術在國內外已相當成熟，目前較多的集中在果蔬、酸奶、面食以及飼料應用方面，在食藥兩用植物中利用乳酸菌發(fā)酵的研究報道還較少。乳酸菌發(fā)酵能提高食藥兩用植物抗氧化能力，并且風味、口感均較好，可進行深加工研究以豐富鐵皮石斛產品，亦可利用微生物對鐵皮石斛有效成分進行提取和改造，生產出更加高效的保健產品。

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