陳曦 張聰 宋超 方龍香 董欣悅 陳家長(zhǎng)

摘要：采用半靜態(tài)實(shí)驗(yàn)法，設(shè)置質(zhì)量濃度為10、30、50 μg/L的氟蟲腈水溶液在中華絨螯蟹中的殘留效應(yīng)試驗(yàn)。結(jié)果表明，不同質(zhì)量濃度的處理組分析，高質(zhì)量濃度組中華絨螯蟹蟹腿中氟蟲腈的含量顯著高于低質(zhì)量濃度組，高質(zhì)量濃度組中華絨螯蟹身體中的含量也顯著高于低質(zhì)量濃度組。對(duì)中華絨螯蟹不同部位氟蟲腈的含量分析無差異性，氟蟲腈富集部位的走向應(yīng)該是先從腿部再到身體最后到性腺。氟蟲腈在中華絨螯蟹體內(nèi)的殘留沒有性別選擇性，但雌性中華絨螯蟹體內(nèi)富集的速度比雄性的快。此次研究可為處理相關(guān)的漁業(yè)污染事故提供一定的參考。

關(guān)鍵詞：氟蟲腈;中華絨螯蟹;殘留效應(yīng)

中圖分類號(hào)： X592;X714文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）04-0176-05

收稿日期：2018-11-30

基金項(xiàng)目：中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)（編號(hào)：2018HY-ZD0605）;國(guó)家水產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估項(xiàng)目（編號(hào)：GJFP2018009）。

作者簡(jiǎn)介：陳?曦（1992—），女，安徽無為人，碩士，研究實(shí)習(xí)員，主要從事漁業(yè)生態(tài)環(huán)境修復(fù)方面的研究。E-mail：chenx@ffrc.cn。

通信作者：陳家長(zhǎng)，碩士，研究員，主要從事漁業(yè)環(huán)境監(jiān)測(cè)與保護(hù)，水產(chǎn)品質(zhì)量安全與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方面的研究。E-mail：chenjz@ffrc.cn。

2018年6月，德國(guó)發(fā)現(xiàn)受氟蟲腈污染的荷蘭“毒雞蛋”流入超市，食品安全問題引發(fā)了人們的關(guān)注。氟蟲腈是一種廣譜類殺蟲劑，對(duì)害蟲以胃毒作用為主，并有觸殺和內(nèi)吸作用，用于殺滅蚜蟲、鱗翅目幼蟲、蠅類和鞘翅目等害蟲[1-3]。按照我國(guó)農(nóng)藥急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，氟蟲腈屬于中等毒性藥物[4]。由于氟蟲腈對(duì)甲殼類水生生物和蜜蜂具有高風(fēng)險(xiǎn)，并且其在水和土壤中降解慢，我國(guó)在《中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第1157號(hào)》文件中規(guī)定，自2009年10月1日起，除衛(wèi)生用、玉米等部分旱田種子包衣劑外，在我國(guó)境內(nèi)停止銷售和使用含氟蟲腈成分的農(nóng)藥制劑[5]。

中華絨螯蟹肉味鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富、經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高，深受廣大消費(fèi)者喜愛。玉米是中華絨螯蟹的主要飼料成分之一，含氟蟲腈成分包衣劑的使用可能會(huì)引入到中華絨螯蟹的生長(zhǎng)環(huán)境中。研究表明，氟蟲腈對(duì)甲殼類動(dòng)物有劇毒[6];王志錚等研究發(fā)現(xiàn)，氟蟲腈對(duì)中華鱉稚鱉96 h半致死質(zhì)量濃度為0.28 mg/L[7];單正軍等通過稻田-魚塘模擬試驗(yàn)表明，氟蟲腈對(duì)中華絨螯蟹（體質(zhì)量1 g）96 h的LC50為0.008 6 mg/L[8]。目前，氟蟲腈在中華絨螯蟹中的殘留含量研究較少，同時(shí)，考察氟蟲腈對(duì)中華絨螯蟹不同部位、不同性別的殘留區(qū)別研究亦未見報(bào)道。為此，本研究通過采用室內(nèi)模擬試驗(yàn)，研究氟蟲腈在中華絨螯蟹中的殘留含量，以期為中華絨螯蟹食用安全性及相關(guān)漁業(yè)污染事故處理提供科學(xué)依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

1.1.1?受試生物

試驗(yàn)種類為中華絨螯蟹成蟹（最后一次蛻殼之前），購(gòu)自江蘇省江陰市某中華絨螯蟹養(yǎng)殖場(chǎng)，大小一致，體質(zhì)量為（91.79±12.21） g，先在室內(nèi)飼養(yǎng)1周，以適應(yīng)環(huán)境，選擇健康有活力的用于試驗(yàn)。

1.1.2?試驗(yàn)用水

在室外曝氣3 d以上的自來水，水溫20～24 ℃。

1.1.3?儀器與試劑

GL-22MS高速冷凍離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）;sartorius離心機(jī)（Sigma）;Acquity UPLC I-Class，Xevo TQD液質(zhì)聯(lián)用儀（Waters）。Agilent Bond Elut EMR-Lipid增強(qiáng)型脂質(zhì)去除凈化管;Agilent Bond Elut EMR-Lipid Polish反萃管。甲醇、甲酸、乙腈、乙酸乙酯均為色譜純，水為超純水，氟蟲腈標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2?試驗(yàn)方法

1.2.1?氟蟲腈暴露處理

采用半靜態(tài)試驗(yàn)法，室內(nèi)溫度設(shè)為23 ℃。將供試中華絨螯蟹放入玻璃缸內(nèi)（長(zhǎng)39.5 cm×寬28.5 cm×深29.5 cm），在缸內(nèi)分別裝入6 L不同濃度的稀釋液，用增氧泵進(jìn)行增氧，每個(gè)缸內(nèi)放入5只中華絨螯蟹，共設(shè)6個(gè)處理和2個(gè)空白對(duì)照，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)期間不喂食，每隔48 h更換1次藥液，試驗(yàn)周期為4周，每隔1周采樣1次。

根據(jù)課題組預(yù)試驗(yàn)以確定本次試驗(yàn)藥物質(zhì)量濃度，既可以測(cè)出中毒中華絨螯蟹體內(nèi)氟蟲腈的殘留又要保持在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)中華絨螯蟹不至于全部死亡。處理組的質(zhì)量濃度分別為10、30、50 μg/L，每個(gè)質(zhì)量濃度分性別作2個(gè)處理。

1.2.2?前處理方法

采樣時(shí)，每個(gè)缸隨機(jī)采集1只中華絨螯蟹，分別提取身體（B）、性腺（G）、蟹腿（L）的可食部分進(jìn)行檢測(cè)。稱取5 g樣品于50 mL離心管中，加入10 mL提取液（乙酸乙酯、乙腈和甲酸，其體積比為99.5 ∶99.5 ∶1.0），2 000 r/min渦旋振蕩15 min，12 000 r/min離心5 min;取5 mL離心后的上清液加入至已用5 mL水活化好的Agilent Bond Elut EMR-Lipid增強(qiáng)型脂質(zhì)去除凈化管中，2 000 r/min 渦旋振蕩5 min，4 000 r/min離心5 min;將離心后的上清液全部轉(zhuǎn)入含1.7 g EMR-Lipid Polish MgSO4的離心管中，2 000 r/min渦旋振蕩5 min，4 000 r/min離心5 min，取有機(jī)相（上層）過0.22 μm有機(jī)相濾膜，待UPLC-MS/MS分析。

1.2.3?儀器分析條件

質(zhì)譜條件：離子采集模式為ES-;毛細(xì)管電壓：2.6 kV;錐孔電壓：36 V;離子源溫度150 ℃;脫溶劑氣溫度350 ℃;脫溶劑氣流速650 L/h;錐孔氣流速30 L/h;MRM監(jiān)測(cè)模式下氟蟲腈的母離子質(zhì)荷（m/z）比為434.844，定量離子質(zhì)荷比（m/z）為317.930;保留時(shí)間為2.13 min。

色譜條件：色譜柱：Acquity UPLC BEH C181.7 μm，2.1×100 mm column;柱溫：30 ℃;自動(dòng)進(jìn)樣器溫度設(shè)為10 ℃;進(jìn)樣量5 μL。

梯度洗脫程序見表1。

2?結(jié)果與討論

2.1?中華絨螯蟹中毒癥狀

試驗(yàn)初始，受試中華絨螯蟹放入藥液中比較興奮，四處亂竄，之后靜伏于容器底部，在玻璃缸中正常生存與對(duì)照組無明顯差別。所設(shè)置的3個(gè)處理組在96 h內(nèi)，中華絨螯蟹無明顯中毒癥狀，有個(gè)別中華絨螯蟹死亡，后高質(zhì)量濃度組中華絨螯蟹出現(xiàn)8足支起呈穹形，發(fā)生抱團(tuán)群聚行為，中華絨螯蟹之間互相打架，用螯足將對(duì)方的步足不斷鉗掉，6 d后高質(zhì)量濃度組的中華絨螯蟹陸續(xù)吐黃水繼而死亡。隨著試驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)，各試驗(yàn)梯度有不同個(gè)數(shù)的死亡個(gè)體，中華絨螯蟹的中毒表現(xiàn)為，抱團(tuán)群聚、反應(yīng)遲鈍、口吐白沫。在解剖過程中，可以發(fā)現(xiàn)中毒的中華絨螯蟹肢體軟塌沒有彈性，背甲與胸腹的黏合不強(qiáng)。

氟蟲腈屬于苯基吡唑類化合物，它的作用機(jī)制

是能夠阻斷γ-氨基丁酸介導(dǎo)的氯離子通道的開放，從而造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)的過度興奮[9]。王志錚等研究發(fā)現(xiàn)，氟蟲腈對(duì)中華鱉稚鱉的急性毒性試驗(yàn)中，中華鱉稚鱉中毒的神經(jīng)癥狀與本次試驗(yàn)的中華絨螯蟹神經(jīng)癥狀類似，該研究認(rèn)為氟蟲腈導(dǎo)致神經(jīng)傳導(dǎo)、呼吸受阻以及代謝活動(dòng)紊亂共同引發(fā)的中毒行為[7]。氟蟲腈急性中毒的小鼠神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞空泡化、細(xì)胞核膜間隙輕度擴(kuò)張等病理特征[10]。Carla M. Stehr等探索了氟蟲腈對(duì)斑馬魚胚胎和幼魚的影響，發(fā)現(xiàn)氟蟲腈可通過抑制甘氨酸受體亞型的功能從而損害魚的脊髓運(yùn)動(dòng)。中華絨螯蟹的背部拱起、抱團(tuán)行為等神經(jīng)中毒癥狀可能也與甘氨酸受體的損害有關(guān)[11]。乙酰膽堿酯酶可以保證神經(jīng)沖動(dòng)在突觸間的正常傳導(dǎo)，嚴(yán)海娟等研究發(fā)現(xiàn)氟蟲腈對(duì)錦鯽腦組織乙酰膽堿酯酶的抑制率可達(dá)35.21%，中華絨螯蟹神經(jīng)癥狀的表現(xiàn)與氟蟲腈對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制有關(guān)[12]。

2.2?同一時(shí)間同一部位不同質(zhì)量濃度處理中華絨螯蟹體內(nèi)氟蟲腈的含量

由表2可知，隨時(shí)間變化，不同處理組的中華絨螯蟹體內(nèi)氟蟲腈的含量，其中，空白組的中華絨螯蟹蟹腿中有氟蟲腈檢出，含量為1.3 ng/g左右。同一時(shí)間，高質(zhì)量濃度組中華絨螯蟹中氟蟲腈的殘留高于中質(zhì)量濃度組高于低質(zhì)量濃度組（圖2）。經(jīng)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，高質(zhì)量濃度組中華絨螯蟹蟹腿中氟蟲腈的含量顯著高于低質(zhì)量濃度組（P<0.05），高質(zhì)量濃度組中華絨螯蟹身體中的含量也顯著高于低質(zhì)量濃度組（P<0.05）。性腺中氟蟲腈的殘留沒有較大差異，第1次采樣時(shí)高質(zhì)量濃度組的中華絨螯蟹性腺中含量相差較大，分布不均，這可能是高質(zhì)量濃度的情況下，性腺對(duì)氟蟲腈的吸附能力不同或是性腺中氟蟲腈的積累與個(gè)體差異相關(guān)。

2.3?相同時(shí)間同質(zhì)量濃度處理中華絨螯蟹不同部位氟蟲腈的含量

經(jīng)JMP軟件分析，中華絨螯蟹不同部位氟蟲腈的含量無差異性。但相同暴露時(shí)間相同質(zhì)量濃度下，腿部的殘留量相對(duì)較低。有報(bào)道稱，氟蟲腈在脂肪組織中含量較高[8]，腿部組織中脂肪含量少，因此氟蟲腈在腿部富集相對(duì)偏少。在試驗(yàn)過程中，處理組均發(fā)生斷腿的現(xiàn)象，分析可能是骨眼部位受氟蟲腈的影響被破壞，再者氟蟲腈對(duì)中華絨螯蟹神經(jīng)系統(tǒng)的損害，致使中華絨螯蟹個(gè)體間互相殘殺。

在7 d時(shí)，低質(zhì)量濃度組的性腺中未檢測(cè)到氟蟲腈殘留，在空白組中只有腿部檢測(cè)到氟蟲腈的含量，應(yīng)該是氟蟲腈的富集先從腿部再到身體最后到性腺，這可能與中華絨螯蟹受到外部甲殼的保護(hù)有關(guān)。

2.4?同時(shí)間相同質(zhì)量濃度處理不同性別中華絨螯蟹氟蟲腈的含量

由圖3可知，在7 d時(shí)，低質(zhì)量濃度處理組雌性、雄性中華絨螯蟹體內(nèi)氟蟲腈含量差異不大，檢測(cè)均值在2 ng/g左右;中質(zhì)量濃度和高質(zhì)量濃度處理組均是雌性體內(nèi)的氟蟲腈含量顯著高于雄性體內(nèi)，雌性體內(nèi)的含量是雄性體內(nèi)的2倍。在14、21 d，高質(zhì)量濃度組只有雄性個(gè)體存活，低質(zhì)量濃度組雄性體內(nèi)的氟蟲腈含量高于雌性體內(nèi)的。相對(duì)來說，隨時(shí)間變化，雌性中華絨螯蟹體內(nèi)氟蟲腈富集的速度比雄性快。雖然試驗(yàn)最后高質(zhì)量濃度組只剩雄性中華絨螯蟹存活，但其體內(nèi)氟蟲腈的含量與其他組無顯著差異，不能說明雄性中華絨螯蟹的耐受性強(qiáng)。據(jù)報(bào)道，雄性河口底棲橈足類對(duì)氟蟲腈比較敏感，能夠擾亂雄性性腺發(fā)育過程中非常重要的神經(jīng)激素級(jí)聯(lián)，從而損害其生殖功能使后代數(shù)量減少[13]。氟蟲腈對(duì)雌、雄性大鼠的內(nèi)分泌均有干擾，可使雄性大鼠甲狀腺激素下降[4]，也會(huì)影響雌性大鼠血漿孕酮、雌二醇水平[14]?？梢?，氟蟲腈對(duì)雌雄性動(dòng)物的激素均有一定的損害作用，但氟蟲腈在中華絨螯蟹體內(nèi)的殘留沒有性別選擇性。在相同質(zhì)量濃度下，氟蟲腈在雌性中華絨螯蟹體內(nèi)富集的速度比雄性快，并且氟蟲腈對(duì)中華絨螯蟹的生殖功能有一定的損害作用。

3?結(jié)論

氟蟲腈在中華絨螯蟹中的殘留效應(yīng)為：同一時(shí)間，高質(zhì)量濃度組中華絨螯蟹中氟蟲腈的殘留高于中質(zhì)量濃度組高于低質(zhì)量濃度組。中華絨螯蟹不同部位氟蟲腈的含量無差異性，氟蟲腈富集部位的走向應(yīng)該是先從腿部再到身體最后到性腺。氟蟲腈在中華絨螯蟹體內(nèi)的殘留無性別選擇性，但雌性中華絨螯蟹體內(nèi)富集的速度比雄性的快。

氟蟲腈是一種對(duì)中華絨螯蟹有高風(fēng)險(xiǎn)的藥物，10 μg/L的水體質(zhì)量濃度不會(huì)導(dǎo)致中華絨螯蟹的死亡，但隨時(shí)間的延長(zhǎng)可以使中華絨螯蟹出現(xiàn)一系列的中毒癥狀。極低質(zhì)量濃度的氟蟲腈在中華絨螯蟹體內(nèi)檢測(cè)不出來，但其已經(jīng)危害了中華絨螯蟹的生理系統(tǒng)，對(duì)養(yǎng)殖池塘的水體及附近環(huán)境中的氟蟲腈仍應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)管。

參考文獻(xiàn)：

[1]Cheng Y P，Dong F S，Liu X A，et al. Simultaneous determination of fipronil and its major metabolites in corn and soil by ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Analytical Methods，2014，6（6）：1788-1795.

[2]張芳芳，洪雅青，張?幸. 氟蟲腈的毒理學(xué)研究進(jìn)展[J]. 職業(yè)與健康，2008，24（20）：2211-2213.

[3]胡驍飛，魏鳳仙，李向力，等. 氟蟲腈的危害及檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2018，9（6）：1226-1233.

[4]周?彤，肖洪喜，周志俊. 氟蟲腈安全性評(píng)價(jià)資料概述[J]. 環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué)，2017，34（8）：745-748.

[5]中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部. 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告[J]. 中國(guó)獸藥雜志，2014（3）：69.

[6]徐廣春，顧中言，楊玉清，等. 氟蟲腈的應(yīng)用和風(fēng)險(xiǎn)研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代農(nóng)藥，2008，7（2）：1-5，11.

[7]王志錚，施建軍，呂敢堂，等. 3種常見農(nóng)藥對(duì)中華鱉稚鱉的急性致毒效應(yīng)研究[J]. 浙江海洋學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2010，29（3）：199-205.

[8]單正軍，王連生，蔡道基，等. 新型殺蟲劑銳勁特農(nóng)藥對(duì)甲殼類水生生物影響研究[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002，35（8）：949-952.

[9]Merkowsky K，Sethi R S，Gill J P，et al. Fipronil induces lung inflammation in vivo and cell death in vitro[J]. Journal of Occupational Medicine and Toxicology，2016，11（1）：10.

[10]何國(guó)鑫，林錫芳，劉?曉，等. 氟蟲腈急性中毒小鼠毒性和病理形態(tài)學(xué)改變[J]. 溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，35（3）：179-181.

[11]Stehr C M，Linbo T L，Incardona J P，et al. The developmental neurotoxicity of fipronil：Notochord degeneration and locomotor defects in zebrafish embryos and larvae[J]. Toxicological Sciences，2006，92（1）：270-278.

[12]嚴(yán)海娟，于?莉，夏錦瑜，等. 阿維菌素和氟蟲腈對(duì)錦鯽的急慢性毒性效應(yīng)[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（4）：363-365.

[13]Cary T L，Chandler G T，Volz D C，et al. Phenylpyrazole insecticide fipronil induces male infertility in the estuarine meiobenthic crustacean Amphiascus tenuiremis[J]. Environmental Science & Technology，2004，38（2）：522-528.

[14]Ohi M，Dalsenter P R，Andrade A J，et al. Reproductive adverse effects of tipronil in Wistar rats[J]. Toxicology Letters，2004，146（2）：121-127.