李易芯 萬群 徐文君 葛靜 曾東強(qiáng) 余向陽

摘要：通過測定不同代謝抑制劑和細(xì)胞色素P450s抑制劑對(duì)上海青吸收噻蟲嗪的影響，探討噻蟲嗪的吸收及代謝機(jī)制，為農(nóng)藥施用及提高藥效提供理論依據(jù)。在10 mg/L噻蟲嗪水溶液中加入不同濃度的不同種類代謝抑制劑和P450s抑制劑，水培上海青1 d后測定植株體內(nèi)噻蟲嗪含量。10、50 μmol/L碳酰氰間氯苯腙和2，4-二硝基苯酚均能極顯著降低上海青體內(nèi)噻蟲嗪含量，推測上海青吸收噻蟲嗪過程中存在須要消耗能量的主動(dòng)吸收。而含有10 mg/L胡椒基丁醚、1- 氨基苯并三唑和馬拉硫磷的處理組中噻蟲嗪含量極顯著升高，推測上海青體內(nèi)含有能代謝噻蟲嗪的P450多功能氧化酶。上海青吸收噻蟲嗪過程需要能量的供應(yīng)，進(jìn)入體內(nèi)的噻蟲嗪會(huì)被細(xì)胞色素P450代謝。

關(guān)鍵詞：上海青;噻蟲嗪;代謝抑制劑;細(xì)胞色素P450抑制劑;主動(dòng)吸收

中圖分類號(hào)：TQ450.1?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）04-0172-04

收稿日期：2018-11-19

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31601660，31772198）。

作者簡介：李易芯（1993—），女，重慶人，碩士，從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究。E-mail：18883252739@163.com。

通信作者：曾東強(qiáng)，博士，教授，從事有害生物化學(xué)防治研究，E-mail：zengdq550@163.com;余向陽，博士，研究員，從事污染物殘留代謝調(diào)控及其機(jī)理研究，E-mail：yuxy@jaas.ac.cn。

農(nóng)藥在防治作物病蟲草害、保障農(nóng)業(yè)增產(chǎn)增收方面發(fā)揮了重要作用。我國是農(nóng)藥使用大國，但農(nóng)藥利用率比較低，大量未發(fā)揮作用的農(nóng)藥直接進(jìn)入到農(nóng)田環(huán)境，對(duì)農(nóng)業(yè)環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品安全造成極大的威脅。作物通過根系將殘留于土壤中的農(nóng)藥吸收，經(jīng)過體內(nèi)的遷移、轉(zhuǎn)化后將農(nóng)藥分配在整個(gè)植物體內(nèi)[1-2]。噻蟲嗪是全球應(yīng)用最為廣泛的新煙堿類殺蟲劑之一，常作為種子包衣劑用于多種農(nóng)作物的害蟲防治，其施用后可迅速被植物吸收，并傳導(dǎo)到植株各部位。研究農(nóng)作物對(duì)噻蟲嗪的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，可為噻蟲嗪的科學(xué)合理使用和保障農(nóng)產(chǎn)品安全提供科學(xué)依據(jù)。

在生物體中，各種物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞的過程須要通過蛋白組成的特殊途徑介導(dǎo)才能完成。膜蛋白介導(dǎo)的分子或離子的跨膜運(yùn)輸過程可分為主動(dòng)運(yùn)輸和被動(dòng)運(yùn)輸兩大類。主動(dòng)運(yùn)輸是一種耗能過程，主要由線粒體提供能量。在真核細(xì)胞線粒體中，氧化磷酸化過程是物質(zhì)在體內(nèi)氧化時(shí)釋放的能量通過呼吸鏈供給二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，簡稱ADP）與無機(jī)磷合成腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，簡稱ATP）的偶聯(lián)反應(yīng)。線粒體氧化磷酸化的電子傳遞鏈位于線粒體內(nèi)膜上，內(nèi)膜兩側(cè)具有電化學(xué)勢梯度，使質(zhì)子在ATP合成酶輔助下用于合成ATP，而ATP是細(xì)胞內(nèi)流通的能量通貨，其釋放的能量可以供給各項(xiàng)生命活動(dòng)。

2，4-二硝基苯酚（2，4-dinitrophenol，簡稱DNP）和碳酰氰間氯苯腙（carbonylcyanide-m-chlorophenylhydrazone，簡稱CCCP）是氧化磷酸化的解偶聯(lián)劑，抑制ATP生成。DNP和CCCP增大了線粒體內(nèi)膜的通透性，破壞質(zhì)子梯度的形成，使電子傳遞鏈崩塌，由電子傳遞產(chǎn)生的能量以熱被釋出，并且它還會(huì)引起線粒體中ATP大量水解[3-5]。如在溫度為20 ℃時(shí)，加入0.1 mmol/L CCCP，在20～30 s以內(nèi)ATP濃度呈指數(shù)級(jí)下降，而膜電位在2～3 s 內(nèi)呈指數(shù)級(jí)下降[6]。

細(xì)胞色素P450s酶系（cytochrome P450，簡稱CYPs）是一類廣泛分布于動(dòng)植物和微生物中的多功能氧化酶，含有單氧合酶的超家族，是一組最重要的代謝酶，即具有生物合成功能，還參與內(nèi)源物質(zhì)和外源物質(zhì)的解毒代謝，如催化藥物、殺蟲劑、植物毒素等的氧化代謝，還能催化還原解毒反應(yīng)[7-10]。胡椒基丁醚（PBO，增效醚）、1-氨基苯并三唑（1-aminobenzotriazole，簡稱ABT）和馬拉硫磷是高效、無毒的廣譜性P450s酶抑制劑，能夠強(qiáng)烈抑制微粒體P450酶的活性，對(duì)細(xì)胞色素P450s酶家族具有非特異性的抑制作用[11-15]。PBO作為P450酶的抑制劑，已被廣泛用作于有效的殺蟲劑增效劑，通過對(duì)昆蟲體內(nèi)多功能氧化酶系的抑制作用，減少殺蟲劑在昆蟲體內(nèi)的降解，從而達(dá)到增效作用[16]。馬拉硫磷（malathion）是世界上使用最頻繁的有機(jī)磷硫酸酯（OPT）殺蟲劑之一，它通過羧酸酯酶的快速降解與細(xì)胞色素P450在毒性代謝物催化下形成競爭[17]。以噻蟲嗪為材料，初步探討上海青（Brassica chinensis L.）吸收農(nóng)藥是否存在主動(dòng)吸收過程及其在植物體內(nèi)的代謝機(jī)制。

1?材料與方法

1.1?儀器與試劑

試驗(yàn)主要的儀器與試劑有WH-3微型漩渦混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司）、Five go型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]、JJ223BC型電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠）、Agilent Technologies 1260-6410液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀[安捷倫科技（中國）有限公司];噻蟲嗪標(biāo)準(zhǔn)品、乙腈、霍格蘭（Hoagland）全營養(yǎng)液。

噻蟲嗪原藥由濟(jì)南綠霸農(nóng)藥有限公司提供;上海青由南京綠領(lǐng)種業(yè)有限公司提供。

1-2，4-二硝基苯酚（DNP）[酷爾化學(xué)科技（北京）有限公司]、碳酰氰間氯苯腙（CCCP）（合肥博美生物科技有限責(zé)任公司）、胡椒基丁醚（PBO）（上海麥恪林生化科技有限公司）、氨基苯并三唑（ABT）（上海源葉生物科技有限公司）、馬拉硫磷（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。

1.2?試驗(yàn)設(shè)計(jì)

取上海青種子移入裝有蛭石基質(zhì)土的穴盤中，每穴1粒種子，培養(yǎng)期間用霍格蘭全營養(yǎng)液[pH值為5.8～6.0，電導(dǎo)率（EC）為1.2～1.3 mS/cm]澆灌，20 d左右長至3葉1心，選取長勢一致的幼苗待用。種植期間，以LED白光為生長光源，光照度為（130±5） μmol/（m2·s），光暗周期為16 h/8 h，環(huán)境溫度為25 ℃。

用去離子水將上海青幼苗沖洗干凈，吸水紙吸干植株表面水分，放入含不同處理液的50 mL玻璃離心管中。水培用的營養(yǎng)液為霍格蘭全營養(yǎng)液，每天定期向玻璃瓶里補(bǔ)充霍格蘭全營養(yǎng)液，3 d后檢測整株上海青中的噻蟲嗪含量，每個(gè)處理重復(fù)5次。

1.3?上海青體內(nèi)噻蟲嗪含量的測定

1.3.1?提取與凈化

將每株上海青洗凈，用電子天平分別稱鮮質(zhì)量，剪碎，放入10 mL塑料離心管中，放入1顆小鋼珠振蕩5 min粉碎均勻樣品。加入5 mL 乙腈渦旋均勻，超聲提取10 min再振蕩提取30 min，加入1.0 g NaCl，充分渦旋，5 000 r/min離心5 min。取上層提取液2 mL加入預(yù)先裝有50 mgN- 丙基乙二胺（primary secondary amine，簡稱PSA）、30 mg 石墨化碳黑（GCB），150 mg無水MgSO4的離心管（10 mL）中，渦旋30 s，5 000 r/min離心5 min，取上清過0.22 μm有機(jī)濾膜，濾液經(jīng)HPLC-MS檢測。

1.3.2?色譜質(zhì)譜條件

（1）液相色譜條件：AgilentSB-C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，3.5 μm）;柱溫為25 ℃;流動(dòng)相為乙腈/水=7/3（體積比）;流速為0.2 mL/min;進(jìn)樣量為5 μL。（2）質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，正離子源（electrospray ionization，簡稱ESI），離子源溫度為150 ℃。采用多反應(yīng)離子監(jiān)測模式（multiple reaction monitoring，簡稱MRM），以質(zhì)荷比（m/z） 292.1，2個(gè)子離子m/z 211.2、181.1進(jìn)行定性分析，以母離子m/z 292.1和響應(yīng)值最高的子離子m/z 211.1進(jìn)行定量分析。噻蟲嗪的保留時(shí)間為2.45 min，采用外標(biāo)法定量。

1.4?方法的線性相關(guān)性、準(zhǔn)確度及精密度

1.4.1?方法相關(guān)性

用電子天平準(zhǔn)確稱量0.103 g噻蟲嗪標(biāo)準(zhǔn)品，用色譜級(jí)乙腈溶解，定容至100 mL，配制成濃度為1 000 mg/L的噻蟲嗪標(biāo)準(zhǔn)溶液，放置在4 ℃冰箱中保存。將1 000 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成0.01、0.02、0.05、0.10、0.50、2.00 mg/L等6個(gè)濃度，按“1.3.2”節(jié)中LC-MS的條件進(jìn)樣檢測。以噻蟲嗪溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=213.4124 38x-840.774 919，r2=0.999 633 29。由此可見，在0.01～2.00 mg/L濃度范圍內(nèi)，峰面積與噻蟲嗪濃度具有良好的線性關(guān)系。

1.4.2?回收率與精密度

每株空白上海青樣品用鋼珠勻漿后，根據(jù)樣品質(zhì)量添加5、10、20 mg/kg 水平的噻蟲嗪標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)添加量5個(gè)重復(fù)，渦旋均勻后放置1 h。然后按“1.3.1”節(jié)加入乙腈進(jìn)行提取、凈化，檢測并計(jì)算添加回收率，結(jié)果如表1所示。在上海青植株中平均添加回收率為86.9%～93.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差為0.61%～1.20%。可見，此方法適用于上海青植株內(nèi)噻蟲嗪含量的檢測。

1.5?數(shù)據(jù)分析

圖中的每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)均是平均值。在95%的置信水平下，通過單因素方差法分析數(shù)據(jù)之間的顯著差異。數(shù)據(jù)的表達(dá)方式為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”;圖像繪制采用Microsoft Excel 2016軟件完成。

2?結(jié)果與分析

2.1?代謝抑制劑對(duì)噻蟲嗪吸收的影響

由圖1可見，上海青在含有10 μmol/L CCCP的噻蟲嗪水溶液中培養(yǎng)1 d后，植株體內(nèi)的噻蟲嗪含量減少26%，50 μmol/L CCCP處理組減少24%;在含有1 μmol/L DNP的噻蟲嗪水溶液中培養(yǎng)1 d后噻蟲嗪含量減少21%，含10 μmol/L DNP處理組減少27%。于添加代謝抑制劑的溶液中水培的上海青體內(nèi)噻蟲嗪含量較對(duì)照均顯著降低，可見CCCP、DNP的添加會(huì)導(dǎo)致上海青體內(nèi)噻蟲嗪含量降低。試驗(yàn)中上海青通過根系吸收噻蟲嗪，說明其受到抑制是體內(nèi)噻蟲嗪含量降低的主要原因。CCCP和DNP是解偶聯(lián)劑，推測其通過抑制ATP生成抑制根系吸收。

2.2?P450抑制劑對(duì)噻蟲嗪吸收的影響

由圖2可見，在含有10 mg/L 1-氨基苯并三唑（ABT）、馬拉硫磷的噻蟲嗪水溶液中培養(yǎng)1 d后，上海青體內(nèi)噻蟲嗪含量分別增加76%、59%;加入2、10 mg/L胡椒基丁醚（PBO）均能使上海青內(nèi)的噻蟲嗪含量加倍。ABT、馬拉硫磷和PBO均是細(xì)胞色素P450的抑制劑，可見上海青體內(nèi)存在的細(xì)胞色素P450且對(duì)外源添加物噻蟲嗪在其體內(nèi)的積累起著不可忽視的作用，在此過程中，PBO的效果最顯著。

3?結(jié)論

Felle等用含有CCCP的溶液處理鹿角苔發(fā)現(xiàn)，當(dāng)CCCP濃度高于0.3 μmol/L時(shí)，鹿角苔細(xì)胞中的ATP水平極顯著地降低[6];解偶聯(lián)劑CCCP使細(xì)胞內(nèi)ATP合成受阻，抑制主動(dòng)外排泵的能量來源，從而抑制藥物外排[18-19]。楊根平等用呼吸解偶聯(lián)劑2，4-二硝基苯酚（DNP）處理大豆下胚軸，同樣發(fā)現(xiàn)ATP合成減少，且膜透性增大[20];林毅雄等用DNP處理采后的龍眼果實(shí)發(fā)現(xiàn)，DNP處理的龍眼果皮ATP含量極顯著降低且下降速度變快，由于DNP處理使細(xì)胞內(nèi)能量虧缺，誘導(dǎo)呼吸速率上升，也增加了細(xì)胞膜透性[21]。在本試驗(yàn)中，加入CCCP和DNP處理會(huì)使上海青體內(nèi)噻蟲嗪含量極顯著降低。由此推測，CCCP、DNP抑制上海青體內(nèi)的ATP水平，而吸收噻蟲嗪的過程屬于需要ATP提供能量的主動(dòng)吸收過程，使上海青吸收噻蟲嗪過程受阻。

1969年Frear等首次在棉花幼苗細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，能代謝滅草隆的多功能氧化酶，直接證明了植物細(xì)胞色素P450s酶系在除草劑中的解毒代謝作用[22]。Kawahigashi等將含有3種細(xì)胞色素P450s單加氧酶基因的質(zhì)粒pIKBACH轉(zhuǎn)入水稻，轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)莠去津、異草胺和諾氟沙星以及3種除草劑的混合物具有耐受性，且能降低水稻體內(nèi)的除草劑殘留[23]。

辛雪成噴施噻蟲嗪的同時(shí)配合施用PBO防治棉蚜蟲，噻蟲嗪敏感品系增效比僅為0.95，而噻蟲嗪抗性品系增效比提高3倍，PBO極顯著地增加了噻蟲嗪對(duì)棉蚜的毒性，證實(shí)P450解毒酶在抗噻蟲嗪棉蚜品系的體內(nèi)起到主要解毒代謝作用，是重要解毒酶，進(jìn)一步說明棉蚜對(duì)噻蟲嗪的解毒代謝作用與細(xì)胞色素P450酶相關(guān)[14]。胡椒基丁醚（PBO）和1-氨基苯并三唑（ABT）可明顯抑制氯丹的降解，且抑制作用隨抑制劑濃度的升高而增強(qiáng)[24]。ABT能夠抑制西瑪津在黑麥草（Lolium rigidum）體內(nèi)的代謝[25]以及綠麥隆和異丙隆在小麥植株體內(nèi)代謝[26]。Elmore等發(fā)現(xiàn)，馬拉硫磷比ABT更能增強(qiáng)苯唑草酮對(duì)匍匐翦股穎的毒性[27]。然而，這3個(gè)P450酶抑制劑對(duì)植物吸收外源農(nóng)藥的影響仍未明確。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，3種P450抑制劑均能促進(jìn)上海青對(duì)噻蟲嗪的吸收，推測其是通過抑制上海青體內(nèi)P450酶代謝噻蟲嗪的活性來增加噻蟲嗪在上海青體內(nèi)的含量。

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