祭仲石 厲成新 王中清 韋艷 張木泓

摘要：隨著食品安全等問題日趨嚴重，尋找良好而安全的防治細菌性疾病的方法迫在眉睫。本研究利用從患病鯽魚體內(nèi)分離的嗜水氣單胞菌制備滅活疫苗，用（50±5） g的健康鯽魚作為試驗對象，免疫組腹腔注射制備的疫苗，對照組腹腔注射等量的磷酸緩沖液。二次免疫后1、7、14、21、28 d檢測血清凝集效價、血清中溶菌酶活性和酸性磷酸酶活性;二次免疫28 d后，對免疫組和對照組同時腹腔注射嗜水氣單胞菌進行攻毒，觀察鯽魚生長狀況，記錄死亡量。結果表明，免疫組血清凝集效價在免疫后逐漸升高，在21 d達到峰值，明顯高于對照組;血清中溶菌酶活性和酸性磷酸酶活性都于免疫后14 d達到峰值，明顯高于對照組;攻毒結果顯示，免疫組死亡率10.0%，對照組死亡率83.7%，相對保護率達到88.5%。說明制備的嗜水氣單胞菌滅活疫苗可以誘導鯽魚產(chǎn)生免疫應答反應，對嗜水氣單胞菌的感染具有較好的免疫保護作用。

關鍵詞：嗜水氣單胞菌;疫苗;免疫保護;鯽魚;血清凝集效價;溶菌酶;酸性磷酸酶

中圖分類號： S942.5文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）04-0168-04

收稿日期：2019-01-09

基金項目：國家大宗淡水魚產(chǎn)業(yè)體系上海綜合試驗站海豐農(nóng)場示范片（編號：CARS-46-30-6）。

作者簡介：祭仲石（1989—），男，江蘇鹽城人，碩士，水產(chǎn)工程師，主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病檢測與防治工作。E-mail：973691132@qq.com。

嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）屬于γ-變形菌綱氣單胞菌目氣單胞菌科氣單胞菌屬[1-2]。嗜水氣單胞菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖中多種疾病的病原菌，廣泛存在自然水體與養(yǎng)殖水體中，在池塘水質惡化、養(yǎng)殖對象體質下降時往往誘發(fā)疾病，給水產(chǎn)養(yǎng)殖帶來重大損失[3-5]。嗜水氣單胞菌是一種重要的淡水養(yǎng)殖病原菌，可以感染多種水產(chǎn)動物，其中以細菌性敗血癥最為嚴重，一般表現(xiàn)為體表和鰭條充血、肛門紅腫、腹部腫脹、有腹水等[6-7]。該病在每年的6—9月高發(fā)，暴發(fā)迅速，一旦暴發(fā)往往造成巨大的損失。目前，治療嗜水氣單胞菌引起的疾病主要還是依靠內(nèi)服抗生素和外用消毒劑來控制，但是，抗生素和消毒劑的長期不合理使用容易產(chǎn)生耐藥菌株[8-9]，同時抗生素和消毒劑在魚體內(nèi)殘留也導致了食品安全問題。因此，尋找安全有效的方法控制細菌性疾病對水產(chǎn)養(yǎng)殖及食品安全方面具有重要意義。

運用免疫學方法，制備細菌疫苗，是控制細菌性疾病最有效的途徑。疫苗是由病原微生物制成，常用的有滅活疫苗和弱毒疫苗，滅活疫苗安全性好、制備容易，但其表面部分抗原成分被破壞，所以免疫效果不佳;而弱毒疫苗是由弱毒株制備，免疫效果好，但弱毒疫苗是活菌，存在毒力恢復的風險，所以弱毒疫苗須謹慎使用[10]。水產(chǎn)中常用滅活疫苗免疫養(yǎng)殖魚類，近年來多項研究表明，嗜水氣單胞菌滅活疫苗可以使魚類取得較好的免疫效果[11-14]。本試驗以鯽魚為研究對象，使用甲醛滅活的嗜水氣單胞菌作為抗原，對鯽魚進行免疫，定期測定鯽魚血清凝集效價和免疫保護率，旨在為鯽魚細菌性出血病的防控提供參考。

1?材料與方法

1.1?試驗魚

從江蘇省鹽城市大豐區(qū)某鯽魚養(yǎng)殖場采購健康鯽魚，規(guī)格50 g左右，體表正常，無損傷。于實驗室暫養(yǎng)1周，水溫（20±0.5） ℃，溶氧含量≥5 mg/L，每天投喂配合飼料2次，及時清除糞便、殘餌。

1.2?疫苗制備

試驗用嗜水氣單胞菌于2018年分離自大豐某發(fā)病塘口，編號HFHL-3-24。將菌種接種于腦心浸液（BHI）液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)24 h，離心法收集菌體，使用滅菌的磷酸緩沖液（PBS）調(diào)節(jié)菌液濃度至1億CFU/mL。在菌液中添加甲醛，使甲醛終濃度為0.2%，30 ℃培養(yǎng)24 h，經(jīng)過涂板驗證徹底滅活后，離心法收集菌體，使用PBS清洗2～3次，最終調(diào)節(jié)濃度至1億CFU/mL，即制出嗜水氣單胞菌疫苗，置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3?疫苗安全性檢測

在超凈工作臺中吸取100 μL制備好的嗜水氣單胞菌滅活疫苗，涂布于BHI固體培養(yǎng)基上，設置3個重復，30 ℃培養(yǎng)48 h，觀察是否有菌落形成。取30尾鯽魚腹腔注射疫苗0.2 mL，另取30尾注射0.2 mL PBS作為對照，觀察2周。

1.4?免疫與血清收集

將暫養(yǎng)后的鯽魚隨機分為2組，每組50尾，分別于200 L水族缸中進行試驗。免疫組鯽魚每尾注射制備的滅活疫苗0.2 mL，對照組每尾注射等量的PBS，第1次免疫7 d后進行二次免疫，然后分別在1、7、14、21、28 d隨機從免疫組和對照組中取5尾鯽魚，尾柄靜脈取血，將血液放置于室溫下2 h，然后放置于4 ℃冰箱6～8 h，4 ℃下4 000 r/min離心10 min，收集上層血清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5?血清溶菌酶（LZM）和酸性磷酸酶（ACP）活力測定

按照南京建成生物工程研究所試劑盒說明書操作測定免疫組和對照組血清LZM和ACP。

計算公式為：

LZM活力=測定管（D2-D1）÷標準管（D2-D1）×標準管濃度（200 U/mL）×樣本稀釋倍數(shù)，U/mL。

ACP活力=測定管D÷標準管D×標準管酚含量（0.005 mg）×（100 mL÷0.05 mL），U/100 mL。

1.6?血清凝集效價

參考吳學婧等的方法[10]，使用96孔U型板進行血清凝集效價測定。在U型板1～12孔中加入100 μL PBS，在第1孔中加入100 μL血清，混勻后依次向后進行2倍稀釋，最后每孔加入100 μL的滅活疫苗，混勻后放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱2 h，4 ℃過夜，觀察凝集效果。凝集效果判定：“++”表示100%凝集，凝集顆粒明顯，液體透明;“+”表示50%凝集，液體較混濁;“-”表示未凝集，液體混濁。出現(xiàn)“+”以上的血清最大稀釋度為凝集效價。

1.7?免疫保護率測定

在二次免疫后28 d，從免疫組和對照組中隨機取30尾鯽魚，每尾魚腹腔注射0.2 mL嗜水氣單胞菌（1億CFU/mL），每天記錄死亡量，觀察2周并統(tǒng)計各組的死亡率，計算出相對免疫保護率。免疫保護率（RPS）=（1-免疫組死亡率/對照組死亡率）×100%。

2?結果與分析

2.1?疫苗安全性

將制備的疫苗涂布于BHI固體培養(yǎng)基上，作3個平行，28 ℃放置48 h后，3個平板上均未出現(xiàn)明顯菌落，說明嗜水氣單胞菌已完全滅活。鯽魚注射疫苗2周內(nèi)生活良好，未見明顯發(fā)病癥狀和死亡，說明制備的疫苗安全性較好，可以用于后續(xù)的試驗。

2.2?LZM活力隨時間變化

鯽魚二次免疫后，血清中LZM活力變化如圖1所示。可以看出，免疫組血清中LZM活力逐漸上升，在免疫后14 d達到最高值（188.6 U/mL），然后逐漸下降;對照組血清中溶菌酶活力無明顯變化，一直處于較低的水平，免疫組LZM活力14 d后開始明顯高于對照組。

2.3?ACP活力隨時間變化

鯽魚二次免疫后，免疫組血清中ACP活力在免疫后逐漸上升，在免疫后14 d達到最高值（26.4 U/mL），然后趨于穩(wěn)定，有緩慢下降;對照組血清中ACP活力無明顯變化，且一直處于較低的水平，免疫組ACP活力免疫后7 d開始明顯高于對照組（圖2）。

2.4?血清凝集效價

鯽魚注射嗜水氣單胞菌疫苗后，其血清抗體凝集效價見表1。結果表明，免疫組鯽魚血清對嗜水氣單胞菌具有明顯的凝集作用，免疫組鯽魚在二次免疫后，其血清凝集效價逐漸上升，在21 d達到最大值（1 ∶512）;對照組鯽魚的血清凝集效價一直處于較低的水平（1 ∶4），免疫組明顯高于對照組。

2.5?免疫保護率

二次免疫后28 d，使用嗜水氣單胞菌對免疫組和對照組鯽魚進行攻毒感染試驗，攻毒后飼養(yǎng)2周。由表2可知，攻毒2周后，免疫組鯽魚死亡3尾，死亡率10.0%;對照組鯽魚死亡26尾，死亡率86.7%。由免疫保護率公式計算得，嗜水氣單胞菌HFHL-3-24對鯽魚的免疫保護率為88.5%。

3?討論

魚類具有相對完善的免疫系統(tǒng)，主要免疫器官是胸腺、腎臟和脾臟，魚類的免疫系統(tǒng)可以對接種的疫苗產(chǎn)生一定的非特異性免疫和特異性免疫反應，從而保護魚體，阻止病原菌的入侵[15-17]。

魚類血清中具有多種體現(xiàn)免疫力的酶，溶菌酶和酸性磷酸酶活性是體現(xiàn)魚體免疫力的重要指標，通過檢測酶活性可以了解魚體的免疫能力。周勇等對施氏鱘免疫注射滅活嗜水氣單胞菌疫苗后發(fā)現(xiàn)，施氏鱘血清中的溶菌酶和酸性磷酸酶活性分別在免疫后7 d和14 d達到峰值，極顯著高于對照組[18];孫金輝等研究嗜水氣單胞菌滅活疫苗對虹鱒免疫力和抗病力的影響時發(fā)現(xiàn)，嗜水氣單胞菌滅活疫苗可以提高虹鱒血清溶菌酶活力，虹鱒免疫后14 d 顯著高于對照組，在21 d時達到最大值[11];毛會麗等研究發(fā)現(xiàn)，嗜水氣單胞菌滅活疫苗可以極大地提高溶菌酶和酸性磷酸酶活性[19]。本研究表明，鯽魚在注射嗜水氣單胞菌滅活疫苗7 d后，溶菌酶和酸性磷酸酶活性明顯增強，隨著時間推移不斷增高，在14 d達到最高峰，隨后逐漸下降，到28 d時仍然明顯高于對照組，說明嗜水氣單胞菌滅活疫苗有效促進了血清中溶菌酶和酸性磷酸酶活性，增強了鯽魚的非特異性免疫效果。

血清凝集效價是判斷血清中抗體水平的一項指標，周勇等對施氏鱘免疫注射滅活嗜水氣單胞菌疫苗后發(fā)現(xiàn)，血清抗體效價于免疫后21 d達到1 ∶203 的峰值，顯著高于對照組[18]。劉迅猛使用0.3%甲醛滅活疫苗免疫鯽魚后，血清抗體效價持續(xù)增高，在49 d達到最高值，然后開始下降[20]。本研究結果表明，免疫7 d后，即可見血清凝集效價明顯高于對照組，在21 d達到最高值，到試驗結束未見明顯下降，與其他研究結果略有差異，可能是不同嗜水氣單胞菌菌株的抗原決定簇不同和滅活條件不同等因素造成的。孫金輝等將嗜水氣單胞菌疫苗免疫虹鱒后發(fā)現(xiàn)，嗜水氣單胞菌滅活疫苗對虹鱒有較高的免疫保護作用，免疫保護率達到71.43%[11];蔣啟歡等研究表明，采用腹腔注射的方式，嗜水氣單胞菌疫苗對草魚的免疫保護率達到90%[12]。本研究的攻毒結果顯示，嗜水氣單胞菌滅活疫苗對鯽魚有較強的免疫保護作用，相對免疫保護率為88.5%，與相關研究結果相一致。

嗜水氣單胞菌是常見的水產(chǎn)致病菌，而抗生素和消毒劑的大量使用容易產(chǎn)生耐藥菌株，同時抗生素在魚體內(nèi)殘留也導致了食品安全問題。因此，應用免疫學原理，研究水產(chǎn)養(yǎng)殖用防控細菌性疾病的疫苗，對水產(chǎn)養(yǎng)殖的健康發(fā)展具有重要意義。本研究說明本方法制備的嗜水氣單胞菌可以誘導鯽魚產(chǎn)生非特異性和特異性免疫應答反應，對嗜水氣單胞菌的感染具有較好的免疫保護作用，后期還需對免疫途徑、免疫期和佐劑等進行研究，以期尋找適合當?shù)卮竺娣e生產(chǎn)使用的滅活疫苗。

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