楊呂娟 張子俊 張衛(wèi)紅

摘要：擬蛹螺屬（Pseudonapaeus）種類(lèi)多為農(nóng)牧業(yè)的害蟲(chóng)，不僅危害各種蔬菜、花卉，其中某些種類(lèi)還是家畜、家禽雙腔科吸蟲(chóng)的中間宿主。本研究主要探究該屬形態(tài)相似2種蝸牛的形態(tài)解剖學(xué)和分子生物學(xué)特征，確定它們分類(lèi)，為該類(lèi)動(dòng)物的防治和系統(tǒng)分類(lèi)學(xué)研究提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。形態(tài)結(jié)果顯示，2種蝸牛的生境，貝殼質(zhì)地、大小和顏色，齒舌以及顎片的形態(tài)結(jié)構(gòu)相似;但貝殼形狀、殼口齒數(shù)、生殖系統(tǒng)的解剖特征等存在顯著差異。其中，一種為鉆擬蛹螺Pseudonapaeus miser（Martens，1874），另一種為新種，即吐?tīng)柛鶖M蛹螺Pseudonapaeus tuegenensis sp. nov.。分子結(jié)果顯示：（1）基于COⅠ基因序列（651 bp）構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，新種和鉆擬蛹螺以高支持率（后驗(yàn)概率96%）形成一個(gè)單系（支系A(chǔ)），顯示二者有密切的親緣關(guān)系，但是鉆擬蛹螺3個(gè)個(gè)體以高支持率（后驗(yàn)概率100%）聚為一支，與新種產(chǎn)生分異;（2）基于ITS1基因序列（610 bp），新種與鉆擬蛹螺之間的遺傳距離為13.7%（12.5%～15.1%）（與本屬其他種間的遺傳距離更大），顯著高于種內(nèi)遺傳距離2.5%（1.3%～3.5%）。結(jié)合COⅠ基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的結(jié)果，支持二者為不同種。分子分析的結(jié)果支持比較形態(tài)學(xué)的結(jié)果，確定吐?tīng)柛鶖M蛹螺P.tuegenensis sp. nov.不同于鉆擬蛹螺P.miser（Martens，1874）為一新種，利用分子系統(tǒng)學(xué)方法研究該屬的分類(lèi)問(wèn)題在國(guó)內(nèi)為首次。

關(guān)鍵詞：擬蛹螺屬;形態(tài)解剖;COⅠ基因;ITS1;新種;新疆

中圖分類(lèi)號(hào)：S433.89?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）04-0121-06

收稿日期：2018-11-17

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31260506）。

作者簡(jiǎn)介：楊呂娟（1992—），女，四川遂寧人，碩士，主要從事貝類(lèi)學(xué)研究。E-mail：YLJ687592@163.com。

通信作者：張衛(wèi)紅，碩士，副教授，主要從事貝類(lèi)學(xué)研究。E-mail：zwh6879a@163.com。

擬蛹螺屬（Pseudonapaeus）由Westerlund于1887年建立，隸屬于腹足綱（Gastropoda）柄眼目（Stylommatophora）艾納螺科（Enidae）。該屬的多數(shù)種類(lèi)是農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)的害蟲(chóng)，常危害各種蔬菜、花卉的幼芽、嫩葉等，其中某些種類(lèi)為家畜、家禽及野生動(dòng)物雙腔科吸蟲(chóng)的中間宿主[1-2]。陳德牛等報(bào)道雙腔吸蟲(chóng)病在新疆牧區(qū)廣為流行，大大影響家畜的體膘和產(chǎn)毛量，甚至引起牲畜死亡，其中間宿主為某些陸生螺類(lèi)（包括艾納螺科的一些種類(lèi)）[3]。

擬蛹螺屬地理分布較窄，主要分布于中亞以及印度半島西北部，現(xiàn)記載有40余種[4]。我國(guó)對(duì)該屬的研究相對(duì)不足，到目前為止僅報(bào)道一種，即鉆擬蛹螺P.miser（Martens，1874）。該種在國(guó)外分布于塔吉克斯坦、哈薩克斯坦、吉爾吉斯斯坦、俄羅斯、土耳其等地區(qū)，在我國(guó)僅在新疆阿勒泰、木壘、庫(kù)爾勒、烏什、阿克蘇及天山一帶農(nóng)田和牧區(qū)有分布[5-8]。本研究采用比較形態(tài)解剖學(xué)和分子分析的方法，對(duì)采自新疆伊犁貝殼相似的擬蛹螺屬2種蝸牛的貝殼形態(tài)，齒舌、顎片的電鏡掃描結(jié)構(gòu)，生殖系統(tǒng)的解剖特征，線(xiàn)粒體基因（COⅠ）以及核基因（ITS1）的DNA序列進(jìn)行詳盡的比較研究，確定它們的分類(lèi)，其中一種為鉆擬蛹螺P.miser，另一種為新種吐?tīng)柛鶖M蛹螺P.tuegenensis sp. nov.。本研究首次應(yīng)用比較形態(tài)解剖學(xué)和分子序列分析的方法探討該屬的分類(lèi)問(wèn)題，研究結(jié)果可以促進(jìn)我國(guó)陸生貝類(lèi)系統(tǒng)分類(lèi)學(xué)的研究，也可為該類(lèi)動(dòng)物的防治提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?樣本

鉆擬蛹螺P.miser（Martens，1874）6只標(biāo)本（XJU E.13031）于2013年8月12日，采自新疆伊寧縣多浪農(nóng)場(chǎng)3隊(duì)（81°38′E，43°46′N(xiāo)，海拔721 m），采集人為張衛(wèi)紅;53只標(biāo)本（XJU E.13003）于2015年4月17日，采自新疆新源縣鐵木里克村（83°08′E，43°33′N(xiāo)，海拔887 m），采集人為楊松（新種采集信息見(jiàn)新種描述）。標(biāo)本處理參考陳德牛等的方法[9]，保存于無(wú)水乙醇中。Orculidae科與艾納螺科（Enidae）親緣關(guān)系較近[10]，故在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中選取Orculidae科2個(gè)種：Schileykula trapezensis（Stojaspal，1981）、Sphyradium doliolum（Bruguiere，1792）的COⅠ基因序列作為外群用于系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析，并選取數(shù)據(jù)庫(kù)中擬蛹螺屬所有種類(lèi)的ITS1基因共4條序列以及艾納螺科相關(guān)種類(lèi)COⅠ基因共7條序列用于參考分析（NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中僅有擬蛹螺屬部分種類(lèi)ITS1的基因序列，沒(méi)有該屬種類(lèi)COⅠ基因的序列）（表1）。

1.2?形態(tài)測(cè)量與比較

用游標(biāo)卡尺（錫工牌0～150 mm）對(duì)2種各14只成體螺進(jìn)行了測(cè)量。螺層數(shù)的計(jì)算采用Kerney等描述的方法[11]。貝殼照片用Nikon SMZ25數(shù)碼體式顯微鏡拍攝。在Olympus SZ2-ILST解剖鏡下對(duì)2種各3只成體螺進(jìn)行軟體解剖[12]及齒舌、顎片電鏡樣品制備[13-14]。生殖系統(tǒng)解剖圖參考iphone手機(jī)拍攝的照片手繪完成。齒舌、顎片用LEO143OVT電子掃描顯微鏡掃描拍照。標(biāo)本保存于新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院。

1.3?分子分析

每種各3只標(biāo)本，分別取腹足肌肉約30 mg，采用血液/細(xì)胞/組織基因組提取試劑盒（TIANGEN，北京）提取基因組DNA。線(xiàn)粒體COⅠ基因PCR擴(kuò)增引物參照文獻(xiàn)[15]：LCO1490（5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTG-3′），HCO2198（5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′）;核基因內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1基因PCR擴(kuò)增引物參照文獻(xiàn)[16]：ITS1L（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGAT-3′），58C（5′-TGCGTTCAAGATATCGATGTTCAA-3′），引物由北京華大基因公司合成。PCR反應(yīng)體系為20.0 μL，其中包括2×Taq PCR Master Mix10.0 μL、7.0 μL ddH2O、正反向引物各0.5 μL、DNA模板2.0 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性1 min;94 ℃變性30 s，45 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，運(yùn)行35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。通過(guò)MEGA 5.0進(jìn)行序列比對(duì)和編輯[17]，基于Kimura-2-parameter（K2P）模型進(jìn)行遺傳距離分析，采用鄰接法（NJ）構(gòu)建分子系統(tǒng)樹(shù)，利用Sequin軟件將序列上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中。

2?結(jié)果與分析

2.1?鉆擬蛹螺Pseudonapaeus miser（Martens，1874）（圖1，圖2-a）

Buliminus miser Martens，1874：21-22，fig.17.

Pseudonapaeus miser（Martens，1874）Schileyko，1952：204，fig.117.

Pseudonapaeus miser（Martens，1874）陳德牛，1987：56，fig.67.

Pseudonapaeus miser（Martens，1874）Sysoev，2009：68-69，fig.29I.

Pseudonapaeus miser（Martens，1874）錢(qián)周興，2013：56.

2.1.1?形態(tài)特征

貝殼：貝殼小型，殼質(zhì)厚，堅(jiān)實(shí)，不透明，呈蛹形。有5.1～6.0個(gè)螺層。殼高7.78～10.92 mm[（9.26±0.36） mm]，殼寬3.34～4.72 mm[（4.10±0.36） mm]，殼口高2.76～4.12 mm[（3.47±0.31） mm]，殼口寬2.14～3.34 mm[（2.74±0.32） mm]。殼面黃棕色或淺黃棕色、光滑、有光澤，具有不均勻分布的稀疏生長(zhǎng)線(xiàn)和螺紋特點(diǎn)，殼頂鈍、縫合線(xiàn)深，殼口呈橢圓形、口緣外折、臍孔狹小，呈縫隙狀。殼口具3齒，為軸唇齒、腔壁齒、腭壁齒（圖1-A至圖1-E）。

齒舌：角質(zhì)，長(zhǎng)帶狀，其上具100～102行齒，齒式為（12～13） ∶（10～11） ∶1 ∶（10～11） ∶（12～13）。中央齒三錐型、主錐尖、呈菱形，明顯長(zhǎng)于基板（圖1-F）。側(cè)齒雙錐型，主錐和外錐均比中央齒的大（圖1-G）。緣齒雙錐型，靠近外側(cè)的緣齒外錐常分裂為2～4枚小齒（圖1-H）。顎片小、幾丁質(zhì)、半月形、棕色，具明顯的縱行肋紋（圖1-I）。

生殖系統(tǒng)：陰莖圓柱狀，較長(zhǎng)，陰莖基背板中等長(zhǎng)度，鞭狀器退化幾乎闕如，具盲突、陰莖附屬器官各部分（A-1+A-2、A-3、A-4、A-5）均有發(fā)育。陰道短，陰道與游離輸卵管長(zhǎng)度比為1 ∶3。受精囊管長(zhǎng)，受精囊無(wú)柄，少數(shù)質(zhì)地較薄，受精囊管分支盲囊不膨大（圖2-A）。

棲息環(huán)境：鉆擬蛹螺生活在山區(qū)、丘陵地帶灌木叢以及農(nóng)田附近潮濕的草叢中，石塊或落葉下，有時(shí)也躲在石縫里。本研究的標(biāo)本采自海拔為700～900 m天然草場(chǎng)的草叢中。

2.1.2?分類(lèi)學(xué)比較

本研究的標(biāo)本貝殼形態(tài)及大小與文獻(xiàn)中對(duì)鉆擬蛹螺P.miser（Martens，1874）的描述[4-7，18]總體一致。但陳德牛等[5]和錢(qián)周興等[7]描述的該種標(biāo)本貝殼呈角褐色，與本研究的標(biāo)本略有差異;錢(qián)周興等描述的標(biāo)本殼口具2枚齒[7]，與本研究的標(biāo)本存在差異。本研究的標(biāo)本貝殼形態(tài)與部分文獻(xiàn)中的描述略有差異，但是與模式標(biāo)本的描述總體一致，并且陸生貝類(lèi)同種不同種群、不同個(gè)體間貝殼形態(tài)會(huì)存在一定的變化[19]，綜合分析本研究的標(biāo)本為鉆擬蛹螺。

2.2?吐?tīng)柛鶖M蛹螺

新種Pseudonapaeus tuergenensis sp.nov.（圖2-B、圖3），正模標(biāo)本：殼高9.42 mm，殼寬4.48 mm，殼口高3.52 mm，殼口寬3.38 mm。2015年4月21日采自新疆伊犁新源縣吐?tīng)柛r(nóng)場(chǎng)（83°20′E，43°32′N(xiāo)，海拔911 m），1只（XJU E.13001），采集人楊松。

副模標(biāo)本：殼高9.42～11.12 mm[（10.14±0.62） mm]，殼寬4.48～5.9 mm[（5.10±0.40） mm]，殼口高3.52～4.60 mm[（4.06±0.30） mm]，殼口寬3.38～4.00 mm[（3.70±0.23） mm]，43只（XJU E.13002），采集信息同正模。

2.2.1?形態(tài)特征

貝殼：貝殼小型、殼質(zhì)厚、堅(jiān)實(shí)、不透明、呈塔形。有6.1～7.0個(gè)螺層，倒數(shù)第一、二螺層呈不均勻的灰白色或黃灰色，其余螺層呈淺棕色。殼面有光澤，具不均勻分布的稀疏生長(zhǎng)線(xiàn)和螺紋;殼頂鈍;縫合線(xiàn)深;殼口呈橢圓形，口緣向外擴(kuò)大。臍孔狹小，呈縫隙狀（圖3-A至圖3-D）。

齒舌：角質(zhì)，長(zhǎng)帶狀，其上具90～92行齒，齒式為（12～13） ∶（9～10） ∶1 ∶（9～10） ∶（12～13）。中央齒三錐型，主錐尖、呈菱形、略長(zhǎng)于基板（圖3-E）。側(cè)齒雙錐型，主錐和外錐均比中央齒的大（圖3-F）。緣齒雙錐型，靠近外側(cè)的緣齒外錐常分裂為2～4枚小齒（圖3-G）。顎片：小，幾丁質(zhì)，半月形，棕色，具縱行肋紋（圖3-H）。

生殖系統(tǒng)：陰莖圓柱狀，較短，陰莖基背板中等長(zhǎng)度，鞭狀器退化幾乎闕如，具盲突。陰莖附屬器官（A-1+A-2、A-3、A-4、A-5）均有發(fā)育。陰道長(zhǎng)，陰道與游離輸卵管長(zhǎng)度比為1 ∶1.6。受精囊管中等長(zhǎng)度，受精囊中等大小，橢球形，受精囊管無(wú)分支盲囊（圖2-B）。

2.2.2?分類(lèi)學(xué)比較

吐?tīng)柛鶖M蛹螺P.tuergenensis sp. nov.與新種鉆擬蛹螺P.miser（Martens，1874）均分布于新疆伊犁，它們的生境，貝殼質(zhì)地、大小和顏色及齒舌和顎片的形態(tài)結(jié)構(gòu)相似。但鉆擬蛹螺貝殼較小，呈蛹形，殼口具3枚齒，陰莖較長(zhǎng)，陰道較短，受精囊管有分支盲囊。新種貝殼較大，呈塔形，殼口無(wú)齒，陰莖較短，陰道較長(zhǎng)，受精囊管無(wú)分支盲囊，與前者差異明顯[4，6-7]。

P.submucronatus（Lindholm，1927）分布于吉爾吉斯斯坦天山山脈，其貝殼呈塔形、殼口無(wú)齒，形態(tài)與新種相似。但P.submucronatus貝殼較大（殼高13～17 mm，殼寬7～9 mm），陰莖較長(zhǎng)，鞭狀器明顯，陰道長(zhǎng)（陰道與游離輸卵管長(zhǎng)度比為3 ∶1），受精囊管有分支盲囊，與新種差異明顯[18]。由于缺少P.submucronatus的分子系統(tǒng)學(xué)數(shù)據(jù)，對(duì)于2種的比較有待進(jìn)一步研究。

2.3?分子系統(tǒng)學(xué)分析

共測(cè)得10條基因序列，其中ITS1基因序列6條（鉆擬蛹螺、吐?tīng)柛鶖M蛹螺各3條），有效長(zhǎng)度為610 bp;COⅠ基因序列4條（鉆擬蛹螺3條、吐?tīng)柛鶖M蛹螺1條），有效長(zhǎng)度為651 bp，其中3條鉆擬蛹螺COⅠ基因共享一個(gè)單倍型。8條序列上傳至GenBank（MK131271～MK131276、MK138523～MK138524）。

基于COⅠ基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果（圖4）顯示，新種和鉆擬蛹螺以高支持率（后驗(yàn)概率96%）與其他各屬種分開(kāi)，形成一個(gè)單系（支系A(chǔ)），顯示二者有密切的親緣關(guān)系;但鉆擬蛹螺3個(gè)個(gè)體以高支持率（后驗(yàn)概率100%）聚為一支，與新種產(chǎn)生分異?；贗TS1基因序列遺傳距離的結(jié)果（表2）顯示，新種與鉆擬蛹螺之間的遺傳距離為13.7%（12.5%～15.1%），顯著高于種內(nèi)遺傳距離（吐?tīng)柛鶖M蛹螺種內(nèi)遺傳距離為2.5%（1.3%～3.5%），鉆擬蛹螺的種內(nèi)遺傳距離為1.4%（1.2%～1.5%）且無(wú)重疊，顯示二者之間的遺傳分異已達(dá)到種的水平，為不同種。結(jié)合比較形態(tài)學(xué)的結(jié)果，進(jìn)一步確定吐?tīng)柛鶖M蛹螺為一新種。

3?結(jié)論與討論

Martens 1874年建立P.miser時(shí)將其歸為Buliminus屬，后Schileyko（1952，1998）基于生殖系統(tǒng)的特征將其移入Pseudonapaeus屬（Pseudonapaeus屬鞭狀器退化幾乎闕如、陰莖基背板具盲突、陰莖末端無(wú)膨大現(xiàn)象;而B(niǎo)uliminus屬鞭狀器長(zhǎng)、陰莖基背板無(wú)盲突、陰莖末端膨大）。依據(jù)線(xiàn)粒體COⅠ基因序列構(gòu)建的艾納螺科7屬9種間的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示，本研究中P.miser和新種以高支持率（后驗(yàn)概率96%）形成支系A(chǔ)，與Buliminus屬2種形成的分支明顯分開(kāi)，該結(jié)果支持P.miser不應(yīng)隸屬于Buliminus屬。鉆擬蛹螺在我國(guó)僅分布于新疆，該種的內(nèi)部解剖結(jié)構(gòu)和分子序列過(guò)去未見(jiàn)報(bào)道?本研究

首次對(duì)鉆擬蛹螺生殖系統(tǒng)以及齒舌、顎片的形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了描述并對(duì)其線(xiàn)粒體基因（COⅠ）和核基因（ITS1）的DNA序列進(jìn)行了報(bào)道，為該種的準(zhǔn)確鑒定提供了更詳盡的數(shù)據(jù)依據(jù)。

擬蛹螺屬目前在我國(guó)僅有本研究報(bào)道的2種。該屬分子數(shù)據(jù)貧乏，NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中僅有該屬4種4條ITS1基因序列數(shù)據(jù)，關(guān)于這2個(gè)種的系統(tǒng)發(fā)育位置有待后續(xù)研究。由于我國(guó)對(duì)該屬缺乏系統(tǒng)的研究，該類(lèi)群對(duì)新疆農(nóng)牧區(qū)的危害情況尚屬未知。本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究該類(lèi)群的分類(lèi)學(xué)、生物學(xué)、生態(tài)學(xué)和害蟲(chóng)防治提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

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