凌莉 席靜 王瑩 周廣彪 劉婧文 魏霜 李志勇

摘要：為建立創(chuàng)傷弧菌的重組酶聚合酶擴增技術（RPA）檢測方法，根據(jù)編碼創(chuàng)傷弧菌DNA促旋酶的B亞單位蛋白（Gyrase Beta Subunit，gryB）的基因保守序列，設計RPA特異性引物，建立創(chuàng)傷弧菌gryB基因的RPA檢測方法并測試其特異性、靈敏度和應用效果。結果發(fā)現(xiàn)，建立的RPA檢測方法特異性好，能夠從創(chuàng)傷弧菌中檢測到234 bp的特異性條帶，僅需在37 ℃下恒溫反應40 min，不需要特殊的儀器設備;該方法的靈敏度與PCR相當，可達到0.1 ng/μL，應用檢測結果也表明該方法與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相當。因此，本研究建立的RPA方法檢測gryB特異性強、靈敏度高，無需特殊的儀器設備，適合實驗室快速檢測。

關鍵詞：創(chuàng)傷弧菌;gryB基因;RPA;檢測

中圖分類號：S182?文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）04-0073-04

收稿日期：2018-12-06

基金項目：廣東省基金團隊項目（編號：S2012030006235）;廣東省科技計劃（編號：2016A050503031）;廣東出入境檢驗檢驗局科技計劃（編號：2017GDK48）;廣東省汕頭市科技計劃（編號：汕府科[2017]166號-38）。

作者簡介：凌?莉（1978—），女，廣東人，碩士，高級工程師，主要從事食品安全研究。E-mail：joiceling@163.com。

通信作者：李志勇，博士，研究員，主要從事食品安全研究。E-mail：lizy@iqtc.cn。

創(chuàng)傷弧菌是一種帶有莢膜的革蘭氏陰性嗜鹽弧菌，在海水養(yǎng)殖的牡蠣、蝦和蟹等貝類、甲殼類水生動物中分布廣泛，是流行程度、危害程度最高的食源性致病菌之一[1-2]。人食用生的或未經充分加工的海產品，以及通過皮膚創(chuàng)口接觸海水入血均可感染，并在短時間內出現(xiàn)敗血癥“蜂窩組織炎”出血性大疤，半數(shù)以上患者可因多臟器功能衰竭而死亡，因此創(chuàng)傷弧菌又被稱為“海洋中的無聲殺手”[3]。當下世界上大部分沿海國家均有創(chuàng)傷弧菌的致病報道，我國江浙、閩粵沿海及臺灣地區(qū)亦有較多的感染報道，更有數(shù)例因創(chuàng)傷弧菌感染引起的敗血癥患者，在3～4 d內均出現(xiàn)腹腔內廣泛性壞死、多器官功能衰竭而死亡的案例，是公眾飲食健康的重大威脅之一，所以對創(chuàng)傷弧菌的檢測在公共衛(wèi)生上具有十分重要的意義[4]。

目前，對創(chuàng)傷弧菌的檢測仍主要依靠傳統(tǒng)方法，即首先利用選擇性培養(yǎng)基增菌，進而結合生化及血清學方法進行鑒定。傳統(tǒng)方法檢測結果準確，但是存在檢測效率低、檢測目標單一、靈敏度低且耗時長、操作繁瑣等不足。為滿足致病菌快速檢測的要求，技術人員發(fā)展了酶聯(lián)熒光免疫檢測法（VIDAS-CHL）、酶免疫法（EIA）、聚合酶鏈式反應（PCR）、膠體金試紙條法、API生化鑒定試紙條法、環(huán)介導恒溫擴增（LAMP）技術和實時熒光PCR等方法。其中，實時熒光PCR及PCR相關的其他改良技術以操作簡便快捷、靈敏度高等顯著優(yōu)勢，近年來在致病菌檢測中的應用越來越廣泛[5]，但熒光檢測設備普遍售價偏高、產物片段偏小、引物探針設計要求較高等不可回避的缺陷，在一定程度上限制了其推廣應用，尤其是不利于非實驗室環(huán)境下現(xiàn)場檢測以及基層實驗室的推廣應用。

RPA（recombinase polymerase amplifcation）是繼LAMP之后的另一種等溫核酸擴增技術[6]，該技術擴增利用單鏈DNA結合蛋白（single-stranded DNA binding protein，SSB）將雙鏈模板DNA解鏈，在DNA聚合酶的作用下，引物與特定模板正確配對形成復合體，然后由DNA聚合酶延伸引物生成新的DNA互補鏈。該方法主要具備以下優(yōu)點：（1）恒溫37 ℃下即可反應，不需要高低溫度循環(huán)實現(xiàn)核酸解鏈和退火;（2）只需要1對引物，反應時間短，僅需40 min;（3）結果易辨識，RPA擴增產物具有特定大小的條帶[7]，而且還可進行進一步的測序確認。

目前，國內尚未見到利用RPA技術檢測創(chuàng)傷弧菌的報道，本研究擬根據(jù)編碼創(chuàng)傷弧菌DNA促旋酶的B亞單位蛋白（Gyrase Beta Subunit）的gryB基因，設計RPA檢測引物，構建創(chuàng)傷弧菌的RPA檢測方法，并驗證其特異性和靈敏度，建立一種快速檢測創(chuàng)傷弧菌gryB的簡便高效、特異性強、靈敏度高、適于現(xiàn)場應用檢測的技術方法。

1?材料與方法

1.1?材料與試劑

創(chuàng)傷弧菌（ATCC27562）、擬態(tài)弧菌（ATCC33653）、副溶血弧菌（ATCC17802）、河流弧菌（ATCC33809）、溶藻弧菌（ATCC17749）、霍亂弧菌（ATCC39315）、哈維氏弧菌（ATCC33842）、沙門氏菌（ATCC14028）、大腸埃希菌（ATCC25922）、金黃色葡萄球菌（ATCC25923）和單增李斯特菌（ATCC19114）均為本機構購買的標準菌株，其購買來源為中國科學院水生生物研究所、廣東食品微生物安全工程技術研究開發(fā)中心和美國MBL公司。應用檢測的樣品均為本機構2016年法定和委托檢驗中的留樣，所用細菌基因組DNA提取試劑盒為天根生化科技有限公司產（貨號DP302），引物由上海生物工程技術有限公司安排合成，電泳級瓊脂糖、DNA Marker及顯色劑購自寶生物大連生物技術有限公司，RPA擴增試劑盒為TwistDX公司產TwistAmp Basic kits。

1.2?主要儀器與設備

PCR擴增儀（Veriti，ABI公司）、核酸蛋白分析儀（ND-1000，Thermo公司）、電泳儀（DYY-6C，北京六一）、凝膠成像系統(tǒng)（Tanon-1 600，天能公司）。

1.3?方法

1.3.1?基因組DNA提取

先將上述標準菌株按照國家標準GB4789進行復壯增菌及生化鑒定，再參照試劑盒說明書，提取上述增菌液的基因組DNA，使用核酸蛋白分析儀檢測DNA濃度及純度并統(tǒng)一稀釋為100 ng/μL備用。

1.3.2?引物設計

參考RPA引物設計的要求，根據(jù)gryB基因的保守序列，使用Oligo V6.22軟件進行引物的設計和篩選，入選序列再利用Primer Blast工具（NCBI官方網(wǎng)站提供）進行特異性確認，最終交由上海生物工程技術有限公司安排合成。最終設計檢測創(chuàng)傷弧菌的RPA檢測引物，擴增條帶234 bp，序列具體如下：上游引物：5′-GCTTGAATACCACCTTCATACATGAAGTGATC-3′;下游引物：5′-TCATGGTGTGCCTGATGCACCGCTTGCTAT-3′。

1.3.3?RPA檢測方法建立

以“1.3.1”節(jié)中制備的DNA為模板，采用上述引物進行RPA擴增，同時設置超純水為陰性對照，測試恒溫37 ℃反應時長分別為30、40、50、60 min時的擴增效果。RPA擴增體系的配制方法如下：向含有凍干酶粉的0.2 mL Twist Amp反應管（Twist AmpBasic kits，Twist）中加入再水化緩沖液（Rehydration Buffer）29.5 μL，去離子水12.5 μL，上、下游引物各2 μL（終濃度為0.4 μmol/L），模板DNA 1.0 μL，最后再加入醋酸鎂溶液2.5 μL（280 mmol/L）。RPA反應結束后，向RPA擴增產物中加入50.0 μL苯酚/氯仿溶液，充分混勻后12 000 r/min離心2 min，取上清液5 μL點樣于1.5%瓊脂糖凝膠，使用1×TBE緩沖液進行電泳，電泳條件為5 V/cm，恒壓電泳40～60 min，最終在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結果。

1.3.4?RPA檢測方法特異性評價

按照“1.3.3”節(jié)的RPA檢測反應體系及適用擴增時長，對前述11種標準菌株的基因組DNA進行檢測，對所建立的RPA檢測方法特異性進行評價。

1.3.5?RPA檢測方法靈敏度評價

將創(chuàng)傷弧菌基因組DNA進行10倍梯度稀釋，共5個稀釋度，以梯度稀釋的DNA為模板，按照“1.3.3”節(jié)所示RPA檢測反應體系進行RPA靈敏度試驗，并與蔣蔚等報道的PCR檢測方法的靈敏度[8]進行比較，評價RPA檢測方法的靈敏度。

1.3.6?RPA檢測方法應用效果評價

選取本機構2016年檢測留樣樣品50份，包括20份陽性樣品，其中創(chuàng)傷弧菌確認陽性檢出2份。樣品主要為凍蝦仁、凍鳳尾對蝦、凍牡蠣、活青蟹、金鯧魚以及水質監(jiān)控樣本，參考食品衛(wèi)生微生物學檢驗國家標準進行樣品處理，使用堿性蛋白胨水增菌培養(yǎng)10 h，取2 mL 增菌液離心富集，使用細菌基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司，貨號DP302）提取DNA，使用建立的RPA方法進行創(chuàng)傷弧菌檢驗，以結果的一致性來評價方法的應用效果。

2?結果與分析

2.1?RPA檢測方法的構建

以創(chuàng)傷弧菌標準菌株基因組DNA為模板，并以超純水為陰性對照，測試了不同擴增時長的RPA檢測效果，由圖1可知，在40 min時便可達到較為理想的擴增效果，gryB擴增條帶與預期目的條帶大小一致，約234 bp，陰性對照沒有條帶，建立的RPA檢測體系能夠準確檢測到gryB基因。

2.2?RPA檢測方法的特異性評價

由圖2可知，gryB的RPA特異性評價結果顯示，創(chuàng)傷弧菌能夠檢測到234 bp的特異性條帶，其他10株標準菌株：擬態(tài)弧菌、副溶血弧菌、河流弧菌、溶藻弧菌、霍亂弧菌、哈維氏弧菌、沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌均未檢測到條帶，說明該方法具有較強的特異性。

2.3?RPA檢測方法的靈敏度評價

靈敏度測試結果（圖3）顯示，當RPA檢測方法反應時間為40 min，DNA含量為0.1 ng時，可檢測234 bp大小目的條帶，該靈敏度結果與蔣蔚等建立的檢測創(chuàng)傷弧菌groEL基因的PCR方法一致;當DNA含量為0.01 ng時，2種方法均未能擴增到目的條帶，說明RPA方法與PCR方法的靈敏度相當。

2.4?RPA檢測方法的應用效果

應用建立的RPA檢測方法，對本機構2016年檢測的20份陽性檢出留樣（其中創(chuàng)傷弧菌確認陽性檢出2份）和30份陰性留樣進行了復檢，結果共有2份樣本檢出創(chuàng)傷弧菌，該留樣檢測結果與之前傳統(tǒng)培養(yǎng)及生化鑒定的結果完全一致，表明該方法具有較好的應用效果。

3?討論

RPA技術是近些年興起的常溫擴增技術，目前在病毒、病原菌及轉基因的檢測中均有成功應用的先例[8-14]，但尚未見創(chuàng)傷弧菌的相關研究報道。本研究建立了針對創(chuàng)傷弧菌特異性gryB基因的RPA檢測方法，并對該方法進行了應用測試，結果顯示該方法特異性強，靈敏度與普通PCR相當，可較好應用于水生動物及其加工產品的檢測，且反應耗時短、對設備依賴程度低，適合基層單位和現(xiàn)場檢測使用，為創(chuàng)傷弧菌的疫情監(jiān)控、污染監(jiān)測等提供了更為簡便高效的解決手段。

研究表明，gryB基因與DNA復制、限制、修飾和修復相關，在細菌DNA的轉錄和復制中發(fā)揮重要作用，近年來常被選用于細菌系統(tǒng)發(fā)育分析及細菌鑒定[15-16]。本研究亦是基于gryB基因保守序列建立了RPA檢測方法，在特異性、靈敏度及應用檢測方面上也均達到了預期效果。

RPA技術最大的優(yōu)點在于在37 ℃恒溫反應，不需要進行復雜的反應參數(shù)優(yōu)化，本研究也只是對比測試不同反應時長的擴增效果，發(fā)現(xiàn)在40 min時擴增產物基本可滿足檢測需求，考慮時效性及污染防控，未選用擴增更長但可能更靈敏的反應參數(shù)。此外，RPA技術反應溫度接近人體溫，可不依賴PCR擴增儀，有學者利用該特性建立了一種僅僅利用人體溫度即能完成DNA擴增的RPA檢測方法[17]，顯著拓展了該技術的應用條件。

靈敏度是評價檢測方法優(yōu)劣的一個關鍵參數(shù)，本研究建立的RPA技術用于檢測gryB方法，其靈敏度和普通PCR方法相當，也與已報道的LAMP檢測方法[18-20]相當。但RPA技術相比普通PCR，反應更為快速（僅需30～40 min），且不依賴PCR儀;同時相比LAMP、RPA技術引物設計難度小，產物片段單一，便于后續(xù)進行測序確證，具有更高的實用價值。

同PCR方法一樣，RPA技術也是擴增檢測特定基因序列，該序列與目標菌的性狀及行為表現(xiàn)并無必然的對應關系，當目標菌數(shù)量較少、活力較弱時，使用傳統(tǒng)微生物檢驗方法不一定能檢出為陽性，故在應用檢測中可能存在假陰性問題[21]。本研究建立的RPA檢測方法，對本機構的50例留樣的應用檢測并未發(fā)現(xiàn)假陰性問題，可能與研究的樣本數(shù)量偏小有關。

當然，RPA技術作為一種后起的檢測手段，也有不足之處需要完善。首先，RPA體系對于蛋白活性要求比較高，需要保證體系中的各種酶觸反應準確進行，其技術的提升依賴現(xiàn)代酶學的發(fā)展應用;其次，RPA擴增體系中存在大量蛋白酶，故直接電泳無法分辨出目的核酸片段，必須經過純化去除蛋白質[7];再次，RPA的關鍵技術有知識產權的保護，試劑成本相對較高。但RPA技術作為一種新的核酸擴增技術，具有特異性強、靈敏度高、操作快速便捷等優(yōu)點，被譽為“一種可替代PCR的技術”，在病原體檢測及食品安全等眾多領域已經有了越來越多的推廣應用，技術發(fā)展及應用前景均較為廣闊。

參考文獻：

[1]王一梅，熊?燕，梁建生，等. 洪澇漬水中檢出1株創(chuàng)傷弧菌[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志，2016，26（24）：3643-3644.

[2]陳佳璇，鄧志愛，和?鵬，等. 2014年廣州市生吃水產品中創(chuàng)傷弧菌污染狀況調查分析[J]. 醫(yī)學動物防制，2017，33（6）：664-666.

[3]張?晶，張欣強，周?勇，等. 廣州地區(qū)海產品中創(chuàng)傷弧菌病原學特征分型[J]. 中國食品衛(wèi)生雜志，2016，28（4）：422-425.

[4]陳樂川，朱紅軍，周澤妍，等. 汕頭地區(qū)4例散發(fā)創(chuàng)傷弧菌感染的實驗室診斷[J]. 中國感染控制雜志，2016，15（4）：272-276.

[5]李丹丹，徐義剛，邱索平，等. 基于vvhA基因檢測創(chuàng)傷弧菌實時熒光PCR方法的建立[J]. 食品與機械，2016，32（9）：31-33，70.

[6]Lutz S，Weber P，F(xiàn)ocke M，et al. Microfluidic lab-on-a-foil for nucleic acid analysis based on isothermal recombinase polymerase amplification（RPA）Lab chip[J]. Lab on a Chip，2010，10（7）：887-893.

[7]張?娜，乾義柯，魏?霜，等. 基于重組酶聚合酶擴增技術（RPA）的葡萄卷葉伴隨病毒3號檢測方法[J]. 新疆農業(yè)科學，2016，53（2）：302-308.

[8]蔣?蔚，易?力，陳永軍，等. 水產品中霍亂弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌多重PCR檢測方法的建立[J]. 中國動物傳染病學報，2016，24（1）：44-51.

[9]Milena E，Yongjie W，Peter O，et al. Recombinase polymerase amplification assay for rapid detection of francisella tularensis[J]. Journal of Clinical Microbiology，2012，50（2）：232-234.

[10]Boyle D S，Lehman D A，Lillis L，et al. Rapid detection of HIV-1 proviral DNA for early infant diagnosis using recombinase polymerase amplification[J]. mBio，2013，4（2）：49-52.

[11]劉冬虹，王德蓮，郭燕華，等. 重組酶聚合酶擴增技術的研究進展[J]. 檢驗檢疫學刊，2016（5）：65-68.

[12]王建昌，王金鳳，劉立兵，等. 非洲豬瘟病毒RPA等溫檢測方法的建立[J]. 中國動物檢疫，2016（7）：78-81，94.

[13]魏梅生，田?茜，趙文軍，等. 番茄細菌性葉斑病菌RPA檢測技術[J]. 植物保護，2016（1）：150-153.

[14]鄧婷婷，黃文勝，程?奇，等. 重組酶聚合酶擴增技術檢測轉基因水稻中的Cry1Ab/c基因[J]. 中國食品學報，2015（3）：187-193.

[15]張新中，張世秀，李海平，等. 多重PCR在創(chuàng)傷弧菌快速檢測中的應用[J]. 水產科學，2007，26（12）：668-670.

[16]郝云婕，韓素貞. gyrB基因在細菌系統(tǒng)發(fā)育分析中的應用[J]. 生物技術通報，2008，2（2）：39-41.

[17]Crannell Z A，Rohrman B，Richards-Kortum R. Equipment-Free incubation of recombinase polymerase amplification reactions using body heat[J]. PLoS One，2014，9（11）：146.

[18]Kiddle G，Hardinge P，Buttigieg N，et al. GMO detection using a bioluminescent real time reporter （BART） of loop mediated isothermal amplification （LAMP） suitable for field use[J]. BMC Biotechnology，2012，12（1）：15.

[19]周?順，高志鑫，張?敏. 創(chuàng)傷弧菌和副溶血弧菌雙重LAMP檢測方法的建立及初步應用[J]. 中國獸醫(yī)學報，2016，36（11）：1875-1881.

[20]張麗娜，王明義，楊小蕾，等. 海洋創(chuàng)傷弧菌LAMP快速診斷方法的建立與評價[J]. 國際檢驗醫(yī)學雜志，2016，37（5）：577-579，582.

[21]謝朝梅，肖慧芳，劉保湘，等. 水產品中霍亂弧菌4種檢測方法的效果比較[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志，2016，26（8）：1119-1121.