崔銀 李明 杜道林

摘要：鄰苯二甲酸酯（PAEs）類化合物是一種被廣泛使用的環(huán)境激素類塑化劑，其對環(huán)境和人類健康的危害已經(jīng)引發(fā)多方關注，該類物質(zhì)的檢測，特別是簡便快速檢測對于保障環(huán)境食品安全及消費者健康具有重要意義。目前，已有一系列免疫快速檢測技術以其簡單快速、低成本、高靈敏、高特異性、高通量的優(yōu)勢而被應用于PAEs檢測，可以彌補色譜檢測技術設備昂貴、操作繁瑣、需要專業(yè)技術人員、難以實現(xiàn)大量樣品篩選目標等不足。本文介紹了PAEs抗體及其免疫快速檢測技術的研究進展，并進行評價和展望，以期為PAEs快速檢測技術的發(fā)展和應用提供指導和幫助。

關鍵詞：鄰苯二甲酸酯;塑化劑;免疫檢測;研究進展

中圖分類號： X132;TS207文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）04-0033-08

收稿日期：2019-01-09

基金項目：中國博士后基金（編號：2016M601745）;江蘇大學高級人才啟動基金（編號：16JDG035）。

作者簡介：崔?銀（1994—），女，江蘇鎮(zhèn)江人，碩士研究生，主要從事有毒有害物質(zhì)的快速分析研究。Tel：（0511）88790955;E-mail：candyminicy@163.com。

通信作者：杜道林，博士，教授，主要從事環(huán)境污染物的生態(tài)效應和毒理研究。Tel：（0511）88790955;E-mail：ddl@ujs.edu.cn。

鄰苯二甲酸酯（phthalic acid esters，簡稱PAEs，別稱酞酸酯）類化合物是廣泛存在的一類環(huán)境激素類塑化劑，其作為增塑劑、軟化劑、載體及添加劑，被廣泛用于塑料、汽車、潤滑劑、化妝品、服裝、農(nóng)藥等行業(yè)[1-4]。PAEs具有很強的生物富集性和抗降解性，不僅對人體生殖、發(fā)育有很大影響，對神經(jīng)系統(tǒng)也有較大危害，此外還有致癌風險和環(huán)境生態(tài)風險[5-8]。隨著長期使用和暴露，PAEs在環(huán)境介質(zhì)中釋放和進入食物供應鏈，導致其在大氣、水體、土壤和食品中均有不同程度的檢出，對環(huán)境和人體有極大的風險[9-11]。

2011年“中國臺灣塑化劑風波”和2012年“大陸白酒塑化劑事件”使PAEs為廣大消費者熟知并引起一定程度的恐慌[12-13]。近年來，PAEs的環(huán)境食品污染和毒理學研究已經(jīng)受到廣泛關注并成為當前的研究熱點。PAEs種類繁多，其20余種常見品種及其化學結構式見表1，最常見的是DBP、DEHP，其中DEHP已經(jīng)被美國國家環(huán)境保護局（Environmental Protection Agency，簡稱USEPA）列為2B類致癌物[14]。許多國家已經(jīng)將多種PAEs確定為環(huán)境優(yōu)先控制的污染物，并制定限量或禁用標準。美國不允許在食品接觸材料中添加DBP、DIBP和DEHP，要求兒童玩具或兒童護理用品中6種PAEs（DEHP、DBP、BBP、DINP、DIDP、DnOP）的總含量不得超過0.1%[15]。歐盟指令2008/105/EC規(guī)定，地表水中DEHP的限值為1.3 μg/L。此外，歐盟不允許在食品接觸材料中添加DIBP，允許DBP、DEHP在非油脂食品接觸材料中使用，遷移限量為0.3 mg/kg[16]。原中國衛(wèi)生部規(guī)定（衛(wèi)辦監(jiān)督函[2011]551號），食品及食品添加劑中DBP、DEH、DINP的最大殘留量分別為0.3、1.5、9.0 mg/kg。GB 5749—2006《生活飲用水衛(wèi)生標準》中水質(zhì)參考指標及限值規(guī)定，DEP的限值為0.3 mg/L，DBP的限值為0.003 mg/L，水質(zhì)非常規(guī)指標及限值規(guī)定，DEHP的限值為0.008 mg/L[17]。

關于PAEs檢測方法的報道以氣相色譜法（GC）、高效液相色譜法（HPLC）、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS）等色譜檢測技術和一系列免疫快速檢測技術為主。加強PAEs檢測技術，特別是高靈敏、簡便快速、高通量篩選、現(xiàn)場檢測方法的應用，對于保障環(huán)境生態(tài)安全和食品消費安全尤為重要。本文重點闡述國內(nèi)外廣泛關注的PAEs免疫快速檢測技術的研究進展，以期為PAEs快速檢測技術的發(fā)展和應用提供研究思路和方向。

免疫快速檢測方法的靈敏度和特異性與抗體的質(zhì)量和分析方法的類型密切相關。半抗原、人工抗原、抗體、標記物是免疫分析的基本要素，其中抗體是免疫分析的核心試劑，半抗原、抗原的合成是小分子化合物抗體制備和分析方法建立的關鍵步驟[18]。研究表明，半抗原的結構、連接臂的長度和結構及其活性基團的連接位點、抗體獲得途徑對抗體的特異性識別和靈敏度具有不同程度的影響。

1.1?抗原

對PAEs類塑化劑的化學結構式進行分析可知，該類化合物擁有1個相同剛性平面芳烴-鄰苯二甲酸酯基團，區(qū)別在于2個可塑的非線性脂肪側鏈基團。因此，PAEs半抗原化學合成改造也具有相似的途徑。分析當前的報道可知，目前主要采用3種策略合成PAEs半抗原。第1種策略如Ius等以4- 羥基鄰苯二甲酸、甲醇為原料，合成4-羥基DMP后，與羧甲基羥胺半鹽酸鹽進行化學反應，獲得帶有—COOH間隔臂的DMP目標半抗原[19]。第2種策略如Yanaihara等以4-硝基鄰苯二甲酸和甲醇為原料，從DMP分子苯環(huán)的酯基間位引入—NO2，合成4-硝基DMP，酯化反應和還原反應后獲得4-氨基DMP半抗原[20]。第3種策略如Tang等在DMP的苯環(huán)酯基間位引入—NH2后，通過縮合反應與羧甲基羥胺半鹽酸鹽、丁二酸酐分別合成了2種長度—COOH間隔臂的DMP半抗原[21]。在PAEs免疫分析研究中，研究人員主要采用上述第2種策略，即從PAEs分子苯環(huán)酯基間位引入—NH2活性基團的策略化學合成半抗原。在隨后的研究中，研究人員同樣采用第2種策略分別合成DCHP、DMP、DPrP、DIBP、DEP和DBP的4-氨基半抗原[22-31]。

在PAEs半抗原合成的基礎上，研究人員通常采用重氮法將—NH2化半抗原與牛血清白蛋白（BSA）或雞卵清蛋白（OVA）分別偶聯(lián)獲得免疫抗原和包被抗原，采用碳二亞胺法將—COOH半抗原與載體蛋白偶聯(lián)制備人工抗原。

1.2?抗體

研究人員用制備獲得的人工免疫抗原免疫新西蘭大白兔，從兔血清中分別純化獲得DCHP多克隆抗體、DPrP多克隆抗體、DIBP多克隆抗體、DEP多克隆抗體、DBP多克隆抗體和DMP多克隆抗體[22，24-26，28，30，32-33]。Wei等通過小白鼠免疫、細胞融合、雜交瘤細胞篩選和抗體生產(chǎn)等流程，獲得DBP單克隆抗體[29，31]。Ius等用連接臂較長的DMP半抗原偶聯(lián)蛋白制備抗原后免疫新西蘭大白兔，獲得的多克隆抗體對DMP和其他多種PAEs均表現(xiàn)出較高程度的親和力，可以作為廣譜抗體對多種PAEs塑化劑進行多組分檢測，表明較長的間隔臂有利于制備廣譜PAEs抗體[19，21]。

2?PAEs免疫的快速分析檢測

根據(jù)檢測模式、載體和標記物的不同，多種免疫快速檢測技術被開發(fā)用于PAEs的分析檢測。研究人員將各種免疫分析模式和標記物質(zhì)用于PAEs的快速分析檢測，開發(fā)獲得一系列免疫分析方法，并對方法的性能開展詳細的評估，使PAEs分析檢測技術得到極大的豐富，可以為PAEs安全風險監(jiān)控儲備關鍵技術和重要生化材料。

2.1?微孔免疫分析檢測

2.1.1?酶免疫分析檢測?作為免疫分析方法的經(jīng)典方法和基礎方法，酶聯(lián)免疫吸附分析方法（ELISA）被廣泛用于PAEs分析方法的開發(fā)和應用中，其中針對DMP、DBP的ELISA研究最多，也最深入。Zhang等將DMP多克隆抗體和辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)獲得酶標記抗體，建立直接競爭ELISA（dc-ELISA）檢測DMP，線性范圍為0.1～2 000 ng/mL，檢測限為0.09 ng/mL，與其他結構類似物的交叉反應很低（<8.8%）[23]。Sun等在將DMP抗體生物化的基礎上，建立生物素-鏈霉親和素放大ELISA方法檢測DMP，檢測范圍為24～6 027 ng/mL，IC50為356 ng/mL，檢測限（LOD）為8.2 ng/mL，特異性較高，與類似物的交叉率低于10%，在檢測實際牛奶和奶制樣品中表現(xiàn)出很高的準確度和精密度，并用GC-MS驗證其檢測結果[27]。Wei等采用聚乙烯微孔表面羧基化和1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺（EDC）偶聯(lián)反應將半抗原4-氨基DBP直接固定，建立基于單克隆抗體DBP的間接競爭ELISA（ic-ELISA）方法，相比于將包被抗原固定在微孔表面（IC50為106 ng/mL），這種直接固定半抗原的策略使靈敏度得到很大提高（IC50為14.6 ng/mL）。在特異性方面，除了對BBP的交叉率為21.3%外，其余的均低于7.98%，在食品樣品檢測中也表現(xiàn)出良好的準確性和精確性，并通過GC-MS驗證[29]。萬宇平等建立白酒中DBP檢測的ELISA方法，并研制成功試劑盒應用于白酒樣品的檢測，方法檢測IC50為86.5 ng/mL，檢測范圍為0～1 620 ng/mL，在特異性方面對DIBP有45%的交叉率，對其他的交叉率均較低[34]。Xu等建立ic-ELISA檢測白酒中的DBP，檢測限達到64.5 ng/mL，檢測范圍為64.5～1 606.2 ng/mL，并與GC-MS進行比對，發(fā)現(xiàn)其相關系數(shù)為0.928[30]。Sun等將DBP多克隆抗體生物素化，建立生物素-親和素系統(tǒng)放大的ELISA檢測方法，檢測限達到5 pg/mL，IC50為0.36 ng/mL，檢測范圍為0.45～7.06 ng/mL，具有很高的特異性（<3.8%），在飲料和應用水檢測中發(fā)現(xiàn)0.45～7.06 ng/mL的DBP被檢出[35]。Zhou等設計合成DBP半抗原和人工抗原，制備獲得單克隆抗體，建立的ELISA的最低檢測限為0.06 ng/mL，IC50為7.34 ng/mL，具有很高的特異性（<1.25%），該方法比多克隆抗體提高了1 000 倍的靈敏度，比其他報道的單抗靈敏度高5倍，并被應用于人類尿液中DBP含量的分析檢測。結果表明，在1 246份尿液樣本中，有72.87%的檢出率，濃度為0～42.98 ng/mL，年輕人體內(nèi)的濃度低于年長者體內(nèi)的濃度[31]。

關于其他幾種PAEs的ELISA報道主要有DPrP、DEP、DEHP。Zhang等將DPrP包被抗原和HRP偶聯(lián)作為標記物，建立直接競爭化學發(fā)光ELISA（CL-ELISA）用于水樣、牛奶樣品中DPrP的檢測，IC50為0.19 ng/mL，LOD為0.03 ng/mL，交叉反應率低于9%，樣品未經(jīng)凈化處理和濃縮，表現(xiàn)出很小的基質(zhì)影響，很好地展示出該免疫分析方法的簡便性[24]。Zhang等建立DEP的ic-ELISA，檢 測 范 圍為0.005～18.6 ng/mL，檢測限為0.004 9 ng/mL，與其他結構類似物的交叉反應率很低（<9%），在果汁、奶茶、純奶和酸奶樣品中的添加回收率在91.1%～109.3%之間[26]。Zhang等制備獲得DEHP多克隆抗體并與HRP偶聯(lián)作為檢測探針建立了dc-ELISA方法，最低檢測限為0.004 2 ng/mL，檢測范圍為0.001～1 000 ng/mL，與結構類似物的交叉反應率低于1%，并且被成功應用于嬰兒用品中DEHP的檢測[36]。

2.1.2?熒光免疫分析檢測?熒光免疫分析方法（FIA）以熒光物質(zhì)作為標記物，熒光信號賦予該分析方法更高的特異性和更高的光量子效率，使檢測準確性和靈敏度獲得進一步提高。Zhang等建立了基于多克隆抗體的DBP間接競爭FIA，方法檢測限為0.02 ng/mL，IC50為10.53 ng/mL，檢測范圍為0.1～300 ng/mL，與其他PAEs塑化劑的交叉率低于9.6%，并對稻田水、河水、自來水、礦泉水進行了添加檢測[28]。Zhang等將異硫氰酸熒光素（FITC）和羊抗兔二抗偶聯(lián)制備熒光標記二抗，結合制備的DCHP兔源多克隆抗體建立了FIA，DCHP檢測范圍為0.1～200 ng/mL，檢測限為0.05 ng/mL，特異性較高[交叉反應率（CR）<8.7%]，在多種水樣檢測中均表現(xiàn)出良好的重現(xiàn)性[22]。Zhang等在用dc-ELISA檢測DMP的研究中，還將DMP多克隆抗體和FITC偶聯(lián)制備熒光標記抗體，建立了DMP直接競爭FIA（dc-FIA），線性范圍為0.05～30 ng/mL，檢測限為0.02 ng/mL，在使用同種抗原和抗體的情況下，靈敏度較dc-ELISA提高了4倍以上，并被應用于水樣的檢測[23]。Zeng等在制備特異性DBP單克隆抗體的基礎上，建立FIA分析方法對DBP在小鼠體內(nèi)的分布進行了檢測，并建立了ic-ELISA檢測小鼠不同臟器內(nèi)DBP的累積情況，將免疫分析技術很好地應用到生物活體檢測方面[37]。Cui等制備獲得DIBP多克隆抗體和羊抗兔-FITC，建立間接競爭FIA方法用于食用油樣品中DIBP的檢測，方法檢測限達到5.82 ng/mL，IC50為61.2 ng/mL，檢測范圍為10.47～357.06 ng/mL，方法具有很高的特異性（CR<1.5%）[25]。

2.1.3?均相免疫分析檢測?免疫分析檢測從非均相模式轉變?yōu)榫嗄Ｊ綄⑹狗治鰴z測步驟更加簡便，檢測時間明顯縮短，偏振檢測技術、磁分離技術的應用可以實現(xiàn)均相模式的檢測，進而簡化檢測程序和提高檢測效率。Tian等用FITC標記DEP抗體，開發(fā)了DEP的熒光偏振免疫分析方法（FPIA），檢測限為6.0 ng/mL，IC50為40.4 ng/mL，線性范圍為10～200 ng/mL，瓶裝水樣品的檢測限為1.46 ng/mL，果汁樣品的檢測限為340 ng/mL，藥物膠囊樣品的檢測限為50 000 ng/g，3種樣品的回收率為85.9%～114.9%，相對標準偏差為4.3%～17.0%[38]。筆者所在研究室的Zhu等將DEP多克隆抗體通過羊抗兔二抗定向負載在磁珠表面，包被抗原與銪離子螯合劑偶聯(lián)作為標記物，建立了1種磁珠均相直接競爭時間分辨熒光免疫分析方法（TRFIA），方法的檢測限達到5.92 pg/mL，并且被應用于鎮(zhèn)江市水環(huán)境中的DEP分布檢測，實際檢測到的DEP濃度為2.98～306.19 ng/mL[39]。這2種PAEs免疫分析技術將均相模式、磁分離的高效性和熒光信號的高靈敏度結合，使檢測能力顯著提升，可為其他物質(zhì)高靈敏、均相、高效痕量檢測提供參考。

2.2?超靈敏PCR免疫分析檢測

隨著人類對環(huán)境和食品安全意識的提高，對有毒有害物質(zhì)的檢測也提出了更高要求。在此情形下，能夠準確靈敏地檢測樣品中超低含量有毒有害物質(zhì)的檢測技術被極大地需求和歡迎。Sun等報道了基于金納米顆粒的實時定量-免疫PCR分析技術用于DEP的超高靈敏度檢測，檢測范圍為4 fg/mL～40 pg/mL，檢測限為1.06 fg/mL，特異性很高（CR<5%），進而被用于食品中DEP的痕量檢測[27]。該報道將免疫分析和超靈敏PCR技術結合，使得DEP的檢測靈敏度得到極大提高（理論提高3個數(shù)量級以上），是當前靈敏度最高的標記檢測策略，對于其他有毒有害物質(zhì)的超痕量檢測發(fā)展具有重要指導價值。

2.3?多組分免疫分析檢測

隨著PAEs塑化劑在環(huán)境中長期暴露，環(huán)境樣品中同時存在多種PAEs的可能性大大增強，當前主要是針對單一組分的檢測方法難以滿足多組分同時檢測的需求。為了擴大免疫分析的檢測范圍，研究人員將研究目標投向多種分析物分析，也叫作寬譜特異性分析、多組分分析或寬選擇性分析[40]。區(qū)別于單組分分析的是，多組分分析可以對多種分析物進行總量的檢測或分別進行定量檢測，在初篩或初檢中是一種很好的方法[41]。Ius等將多克隆抗體生物素化，將鏈霉親和素與鑭系絡合物的雙向螯合劑（BCPDA）偶聯(lián)作為標記物，建立了廣譜PAEs的TRFIA，與DMP、DEP、DBP、BBP、DNOP的交叉率分別為100%、110%、106%、104%、97%，與其他類似物的交叉率低于3.5%，可用于這5種PAEs塑化劑的同時分析檢測，且交叉率相近，檢測范圍為0.5 pmol/mL～2 nmol/mL[19]。Tang等通過合成PAEs通用半抗原，免疫制備獲得多克隆抗體，能夠識別多種PAEs（包括DMP、DEP、DBP、DNOP、BBP、DEHP、DCHP），交叉反應率在63.9%～103.6%之間，IC50在17.12～102.57 ng/mL之間，最低檢測限在0.012～0.042 ng/mL之間，檢測到溫室土壤樣品中的PAEs濃度為1 260～3 580 ng/g，且使用10年的溫室土壤比使用5年的能夠檢測出更高PAEs濃度[21]。PAEs多組分免疫分析檢測技術的開發(fā)，為樣品中多種PAEs同時存在提供了便捷的篩選手段，對于簡化初篩程序、提高檢測效率具有重要價值。

2.4?免疫親和層析分析檢測

免疫親和層析分析技術是通過層析技術將免疫分析技術展示出來，便于更直觀、更便捷地分析待測物質(zhì)，可以實現(xiàn)定性和半定量檢測。關于PAEs免疫分析主要是前文提到的方法，沒有采用免疫親和層析技術對其進行研究的報道，但在實際應用中，研究人員采用免疫親和層析技術開發(fā)PAEs檢測卡，也有多家生化試劑公司生產(chǎn)和銷售PAEs類塑化劑檢測卡。

3?PAEs免疫檢測裝置及應用

PAEs免疫檢測裝置主要是免疫檢測試劑盒和檢測卡，這2種裝置分別以ELISA、膠體金免疫親和層析為核心技術，在此基礎上進行產(chǎn)品化，形成可用于生產(chǎn)實際中PAEs污染檢測的產(chǎn)品。當前，國內(nèi)外已有多個生化試劑公司生產(chǎn)和銷售PAEs類試劑盒和檢測卡。如國內(nèi)的北京勤邦生物技術有限公司可以提供用于白酒樣本中DBP、DIBP檢測的ELISA試劑盒、化學發(fā)光試劑盒和檢測卡，其中ELISA試劑盒的靈敏度為10 ng/mL，樣品檢測限為100 ng/mL，檢測回收率穩(wěn)定，變異系數(shù)小于10%。北京普贊生物技術有限公司的DBP檢測試劑盒的靈敏度達30 ng/mL，樣品回收率為（95±20）%，變異系數(shù)、交叉率均低于10%，可用于定性、定量檢測飲用水、飲料、酒等樣品中的DBP。美國REAGEN公司的DBP試劑盒檢測靈敏度為50 ng/mL，回收率為70%～130%。美國GTX公司的DEHP試劑盒檢測限達100 ng/mL，適用于肌肉和肝臟組織、尿樣、血清、飼料中DEHP的檢測。在檢測裝置的應用方面，也有相關報道，曹必溥等將北京普贊生物技術有限公司生產(chǎn)的塑化劑ELISA檢測試劑盒應用于紅酒中DBP的快速檢測，并用GC-MS法對檢測結果進行比較研究，結果表明，試劑盒能夠滿足對DBP的初篩要求，且樣品前處理簡單、檢測快速、特異性高[42]。PAEs檢測試劑盒和檢測卡的生產(chǎn)和供應，可為環(huán)境和食品安全檢測提供便捷快速的保障。

4?PAEs免疫快速檢測技術的發(fā)展趨勢

PAEs免疫快速檢測技術作為一種簡便快速的技術手段，在前期抗原抗體制備和免疫分析方法開發(fā)的基礎上形成常見PAEs塑化劑檢測的技術儲備，并且重點部分種類已經(jīng)有檢測試劑盒和檢測卡產(chǎn)品儲備和商品化。這一系列PAEs免疫分析技術的開發(fā)可以為儀器分析檢測提供替代和補充方法。由于這些免疫分析技術本身性能的差異和獨特優(yōu)勢能夠滿足不同檢測場所和檢測需求，消費者在實際應用時可以靈活選擇。然而，目前尚未有關于多種PAEs免疫快速分析方面的研究報道，有必要將此不足補充完善作為重要技術儲備。此外，鑒于環(huán)境和食品中PAEs廣泛存在、暴露風險大、超痕量水平樣品難以準確檢測，對免疫分析檢測的質(zhì)量要求也更加嚴格。免疫分析檢測能否獲得更高的靈敏度和特異性，以及更加簡便快捷的操作，作為核心試劑的抗體起著關鍵作用。然而，用傳統(tǒng)經(jīng)典方法從動物體內(nèi)獲得的抗體，其質(zhì)量和性狀難以改變和提高。因此，加強PAEs抗體和免疫分析方法的研究，特別是應用新技術新方法制備高靈敏度、高特異性、多功能的抗體，對于推動免疫快速分析技術更多更廣地應用于PAEs分析檢測中具有重要意義。當前的免疫快速檢測裝置主要是試劑盒和檢測卡，前期研究中靈敏度更為顯著的熒光免疫分析和PCR免疫分析技術，以及更加便捷高效的均相免疫分析技術應該更好地將其產(chǎn)品化并加以推廣應用，以便進一步完善免疫快速檢測體系，更好地保護環(huán)境和食品安全，保障消費者健康。

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