萬(wàn)友名，馬 宏，劉雄芳，張 序，安 靜，劉秀賢，李正紅

(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲(chóng)研究所，云南 昆明 650224)

植物可通過(guò)感知光周期的晝夜變化和季節(jié)日照時(shí)間的長(zhǎng)短，來(lái)調(diào)節(jié)啟動(dòng)開(kāi)花的時(shí)間[1-2]，這是內(nèi)部節(jié)律基因與外部環(huán)境信號(hào)參與時(shí)間調(diào)控機(jī)制相互作用的結(jié)果[3]。FKF1是在研究晚花突變體時(shí)發(fā)現(xiàn)的藍(lán)光特異性光受體基因[4-5]，它受晝夜節(jié)律鐘和光信號(hào)調(diào)控，位于開(kāi)花促進(jìn)基因CO、FT的上游[3]。在藍(lán)光介導(dǎo)下，F(xiàn)KF1能與GI蛋白發(fā)生互作形成FKF1-GI復(fù)合體，該復(fù)合體能通過(guò)泛素化途徑的26S蛋白酶復(fù)合體降解CO的抑制因子CDF1，進(jìn)而正向調(diào)節(jié)CO的轉(zhuǎn)錄水平[4,6-7]；另外，F(xiàn)KF1還能與開(kāi)花促進(jìn)基因CO直接互作并穩(wěn)定CO的表達(dá)[8-9]。因此，在光周期途徑中，F(xiàn)KF1在應(yīng)答光信號(hào)、節(jié)律信號(hào)以及調(diào)控下游開(kāi)花促進(jìn)基因CO上起著重要的作用。目前，有關(guān)FKF1基因的研究主要集中在1年生草本植物中，而在多年生木本植物中的研究相對(duì)較少。在擬南芥（Arabidopsis thalia-na （Linn.) Heynh.）[5,7]、大豆（Glycine max (Linn.)Merr.）[10]中，fkf1突變體會(huì)延遲開(kāi)花，而過(guò)量表達(dá)則引起提前開(kāi)花。在水稻（Oryza sativa Linn.）中，F(xiàn)KF1的調(diào)控功能仍不清楚，它不受光周期影響就能促進(jìn)開(kāi)花，可能是一種自主的成花啟動(dòng)因子，也可能是通過(guò)其特異的功能來(lái)調(diào)控水稻特異基因Ehd2、Ghd7、Ehd1的表達(dá)[11]。因此，F(xiàn)KF1基因在不同光周期類型的植物中存在功能差異。

馥郁滇丁香（Luculia gratissima (Wall.) Sweet）屬于典型的短日照多年生木本植物[12]，是一種具有較高觀賞價(jià)值的木本花卉，既可盆栽又可園林配置[13]。本課題組在前期的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中鑒定出馥郁滇丁香FKF1的同源基因，并發(fā)現(xiàn)其相對(duì)于非誘導(dǎo)光周期，在誘導(dǎo)光周期下呈顯著下調(diào)表達(dá)，這與報(bào)道的草本植物的光周期成花表達(dá)模式相反。本研究根據(jù)轉(zhuǎn)錄組的信息，利用RACE技術(shù)克隆獲得LgFKF1基因的cDNA全長(zhǎng)序列，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析；同時(shí)，利用qRT-PCR對(duì)LgFKF1在特異組織中的節(jié)律表達(dá)進(jìn)行分析，旨在為進(jìn)一步研究FKF1的生物學(xué)功能提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料準(zhǔn)備

以馥郁滇丁香品種‘香妃’扦插苗為試材。于2016年12月15日扦插，當(dāng)生根的幼苗新長(zhǎng)出2～3個(gè)莖節(jié)時(shí)，去除所有植株的頂端分生組織，并移入非誘導(dǎo)光周期（22：00～2：00暗中斷補(bǔ)光，光照強(qiáng)度為 1.8～2.3 μmol·m-2·s-1）的溫室中培養(yǎng)；同時(shí)，在自然環(huán)境中放置部分植株設(shè)為對(duì)照。當(dāng)對(duì)照植株出現(xiàn)花芽分化后，開(kāi)始進(jìn)行誘導(dǎo)光周期（光照/黑暗為10 h/14 h）處理。

1.2 材料處理

1.2.1 基因克隆 根據(jù)前期的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果為依據(jù)，選取誘導(dǎo)光周期處理7、10、13、19 d 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)選10株單株，每個(gè)單株取主枝上的1個(gè)芽，共10個(gè)芽，采集的樣品液氮速凍后-80℃保存。等量混合4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的樣品進(jìn)行cDNA全長(zhǎng)序列克隆。

1.2.2 光周期表達(dá)分析 參照萬(wàn)友名等[12]的方法，將非誘導(dǎo)光周期中培養(yǎng)的植株移入誘導(dǎo)光周期中進(jìn)行誘導(dǎo)處理。自處理開(kāi)始，每隔3～5 d隨機(jī)選取10株植株，每株采集健壯主枝上的頂芽1個(gè)，共10個(gè)芽混合為1個(gè)樣，重復(fù)3次。與此同時(shí)，每次都采用相同的方法在非誘導(dǎo)光周期中采集樣品設(shè)為對(duì)照。每次在上午9：00—11：30采樣。采樣自誘導(dǎo)光周期處理開(kāi)始至花蕾現(xiàn)蕾。所有樣品采集后液氮速凍并保存在-80℃冰箱中用于qRT-PCR分析。然后，根據(jù)萬(wàn)友名等[12]的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果，選取誘導(dǎo)光周期處理7 d（未分化期）、10 d（總苞原基分化期）、13 d（花序原基分化期）、19 d（小花原基分化期）4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的樣品及其對(duì)照樣品進(jìn)行qRT-PCR分析，共24個(gè)樣。

1.2.3 特異組織表達(dá)分析 于‘香妃’的盛花期，選取一天24 h，從早8：00開(kāi)始，每隔3 h從種植條件一致的同一批試驗(yàn)材料中分別采集根（T1）、莖（T2）、葉（T3）、營(yíng)養(yǎng)芽（T4）、著色期花蕾（T5）、露白期花蕾（T6）及開(kāi)放的花朵（T7）1次，每次每個(gè)組織取300～500 mg，重復(fù)3次。所有樣品采集后立即液氮速凍并保存于-80℃冰箱中用于qRT-PCR分析。

1.3 RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

樣品經(jīng)液氮研磨后，按照生工生物工程（上海）公司提供的柱式植物總RNA抽提純化試劑盒（SKB8661）說(shuō)明書(shū)操作提取總RNA。利用第一鏈cDNA合成試劑盒（RevertAid Premium Reverse Transcriptase）(Thermo ScientificTMEP0733)按說(shuō)明書(shū)操作將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.4 基因克隆

以轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果為基礎(chǔ)，經(jīng)信息分析獲得與FKF1功能相似的 Unigene片段，并命名為L(zhǎng)gFKF1。采用 Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物（表1）。然后，以合成的cDNA為模板，利用LA Taq(TaKaRa DRR02AG)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，具體方法按照說(shuō)明書(shū)操作。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸 60 s，33個(gè)循環(huán)，72℃ 修復(fù)延伸 7 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。采用柱式DNA膠回收試劑盒（生工B518131）回收目的條帶?；厥盏哪康钠芜B接pGM-T載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，篩選陽(yáng)性克隆送至生工生物工程（上海）公司測(cè)序。

1.5 生物信息學(xué)分析

克隆拼接獲得的序列經(jīng)NCBI的ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)分析翻譯成氨基酸序列，然后，通過(guò)BLAST（http://b-last.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行蛋白序列的同源性比對(duì)，同時(shí)，選取部分相似度高的同源蛋白序列利用DNAMAN5.1軟件進(jìn)行同源性比對(duì)；利用ProtParam（http://www.expasy.org/tools/protp-aram.html）在線工具軟件預(yù)測(cè)分析蛋白的理化性；利用ProtScale（https://web.expas-y.org/cgi-bin/pro-tscale/protscale.pl）進(jìn)行親/疏水性預(yù)測(cè)分析；利用SignalP 4.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測(cè)蛋白的信號(hào)肽；利用PROTTER（http://wlab.ethz.ch/protter/start/）建立蛋白跨膜結(jié)構(gòu)模型；利用SOPMA（ https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）在線軟件分析蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成；利用 SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）同源建模方法得到蛋白的三維預(yù)測(cè)模型；利用ProtComp9.0(http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=protcompan&grou-p=programs&subgroup=proloc)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)；利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

表 1 LgFKF1克隆及qRT-PCR的引物Table 1 Primers for LgFKF1 cloning and qRT-PCR

1.6 基因qRT-PCR分析

總RNA的提取及cDNA反轉(zhuǎn)錄同上，引物詳見(jiàn)表1。以cDNA為模板，LgACT為內(nèi)參基因，在LightCycler480 II上按照羅氏公司的SG Fast qPCR Master Mix（2×）(B639271)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行qRTPCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為：SybrGreen qPCR Master Mix（2×）10 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各0.4 μL，ddH20 7.2 μL，cDNA 模板 2 μL，總體系共20.0 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性90 s，95℃變性5 s，60℃退火15 s，72℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)。所有樣品反應(yīng)設(shè)3次技術(shù)重復(fù)。

利用2-ΔΔCT法計(jì)算基因的表達(dá)量。采用Excel2010和SPSS16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因克隆

將轉(zhuǎn)錄組獲得的LgFKF1核心序列與克隆的5xRACE序列、3xRACE序列（圖1）比對(duì)拼接后，獲得LgFKF1的cDNA全長(zhǎng)序列。利用DNAMAN5.1軟件對(duì)序列分析表明：該序列片段大小為2 271 bp，A、C、G、T堿基含量分別為26.9%、18.5%、26.1%、28.5%。經(jīng)NCBI的ORF Finder軟件分析，LgFKF1基因開(kāi)放閱讀框?yàn)? 917 bp，編碼一個(gè)638個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)（圖2A）。將翻譯成氨基酸的序列用BLASTp比對(duì)表明：該序列與扁果樹(shù)（Kaliphora madagascariensis AML77708.1）、軟枝黃蟬（Allamanda cathartica AML77851.1）、納塔爾倒吊筆（Wrightia natalensis AML76886.1）、馬利筋（Asclepias curassavica AML76817.1）的 FKF1一致性較高，達(dá)92.59%（圖2B）。

圖 1 馥郁滇丁香LgFKF1基因的PCR擴(kuò)增Fig. 1 PCR amplification of LgFKF1 in L. gratissima

2.2 蛋白序列分析

在線工具ProtParam蛋白理化性分析表明：蛋白質(zhì)分子式為C3101H4889N881O942S28，相對(duì)分子量為70.483 kD，等電點(diǎn)（pI）5.63，不穩(wěn)定指數(shù)為49.94，推測(cè)屬于不穩(wěn)定蛋白，酸性氨基酸殘基總數(shù)（Asp+Glu）為84，堿性氨基酸殘基總數(shù)（Arg+Lys）為69，平均親水系數(shù)（GRAVY）為-0.294，脂肪系數(shù)為83.97。

圖 2 核苷酸、氨基酸序列及氨基酸同源序列比對(duì)Fig. 2 Sequence of nucleotide and amino acid, and homologous alignment of amino acid sequences

LgFKF1蛋白通過(guò)軟件SOPMA分析二級(jí)結(jié)構(gòu)組成表明：二級(jí)結(jié)構(gòu)由45.92%的無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)、24.29%的α螺旋結(jié)構(gòu)、23.04%的擴(kuò)展長(zhǎng)鏈和6.74%的β-轉(zhuǎn)角構(gòu)成（圖3A）；軟件SWISS-MODEL蛋白的三維預(yù)測(cè)建模發(fā)現(xiàn)：三級(jí)結(jié)構(gòu)由α螺旋、擴(kuò)展長(zhǎng)鏈和無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成（圖3B），與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的結(jié)果基本一致。SignalP4.1 Server預(yù)測(cè)表明：不存在信號(hào)肽。PROTTER預(yù)測(cè)表明：無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)（圖3C），說(shuō)明該蛋白屬于非分泌蛋白，在細(xì)胞質(zhì)中合成后不被轉(zhuǎn)運(yùn)；軟件ProtScale預(yù)測(cè)蛋白親/疏水性結(jié)果表明：蛋白親水性氨基酸均占65%，疏水性氨基酸均占35%（圖4），由此說(shuō)明，親水區(qū)域分布面積較廣，所占比例較高；疏水區(qū)域分布面積較少，所占的比例較低，因此，推測(cè)LgFKF1蛋白為親水性蛋白。在線軟件ProtComp 9.0預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位在細(xì)胞核中的可能性最大，為9.92。蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析（圖5)表明：LgFKF1蛋白與扁果樹(shù)（Kaliphora madagascariensis AML77708.1）親緣關(guān)系最近，軟枝黃蟬（Allamanda cathartica AML77851.1）、納塔爾倒吊筆（Wrightia natalensis AML76886.1）、馬利筋（Asclepias curassavica AML76817.1）次之，與舞草（Codariocalyx motorius AML78631.1）、菜豆（Phaseolus vulgaris XP-007160435.1）最遠(yuǎn)。

注：A：二級(jí)結(jié)構(gòu)。藍(lán)色表示α螺旋，紫色表示無(wú)規(guī)則卷曲，紅色表示延伸鏈，綠色表示β-轉(zhuǎn)角；B：三級(jí)結(jié)構(gòu)；C：跨膜結(jié)構(gòu)模型Notes:A: Secondary structure. The blue stands for alpha helix, the purple stands for random coil, the red stands for extended strand, and the green stands for beta turn; B: Three-dimensional structure; C: Transmembrane model

圖 4 LgFKF1蛋白的親疏水性預(yù)測(cè)結(jié)果Fig. 4 Bioinformatic prediction for hydrophily/hydrophobicity of LgFKF1 protein

2.3 特異組織節(jié)律表達(dá)分析

2.3.1 不同光周期的表達(dá)分析 在短日照誘導(dǎo)光周期處理7 d時(shí)，LgFKF1較長(zhǎng)日照非誘導(dǎo)光周期的表達(dá)量高，之后，在處理10、13、19 d的表達(dá)量均低于長(zhǎng)日照的表達(dá)量，并且在成花形態(tài)發(fā)生明顯轉(zhuǎn)變時(shí)（即花序原基分化期，短日照處理13 d）表達(dá)量達(dá)最低（圖6）。由此說(shuō)明，LgFKF1在成花轉(zhuǎn)變狀態(tài)下呈下調(diào)表達(dá)，這與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果一致。

2.3.2 特異組織表達(dá)分析 一天24 h中，LgFKF1基因在各組織中的表達(dá)分析(圖7）表明：在根中，14:00為一天中表達(dá)量最低點(diǎn)，之后逐漸升高，并于23:00達(dá)到最高峰，隨后又波動(dòng)降低；在莖中，8:00為一天中表達(dá)量最低點(diǎn)，隨后逐漸升高，并于20:00達(dá)到第1個(gè)高峰后又逐漸降低直至2:00，之后又開(kāi)始升高，并于5:00達(dá)到與第一個(gè)峰值相當(dāng)?shù)牡?個(gè)高峰，隨后又降低進(jìn)入下一輪循環(huán)；在葉中，8:00 為一天中表達(dá)最高峰，11:00為一天中表達(dá)的最低峰，之后在14:00回升后又逐漸降低直至23:00，隨后又在2:00升高達(dá)到第二個(gè)高峰后再次降低進(jìn)入下一輪循環(huán)；在頂芽中，8:00為一天中表達(dá)最低點(diǎn)，之后逐漸升高，直至23:00達(dá)到最高峰，隨后逐漸降低進(jìn)入下輪循環(huán)；在著色期和露白期花蕾中，表達(dá)規(guī)律基本一致，即11:00為一天中表達(dá)最低點(diǎn)，之后逐漸升高，直至23:00達(dá)到一天中最高峰后又逐漸降低進(jìn)入下輪循環(huán)；在開(kāi)放花朵中，14:00為表達(dá)最低點(diǎn)，之后逐漸升高，直至23:00后小幅度降低后又在5:00升高到一天中的最高峰，隨后降低進(jìn)入下輪循環(huán)?？傮w看，LgFKF1一天24 h內(nèi)在各組織中在20:00—5:00期間的表達(dá)量較高，而在11:00—14:00期間的表達(dá)量較低。從各組織的平均表達(dá)情況看，平均表達(dá)量由高到低的順序依次為：葉＞開(kāi)放花朵＞著色期花蕾＞頂芽＞露白期花蕾＞莖＞根。

圖 5 LgFKF1蛋白的進(jìn)化樹(shù)Fig. 5 Phylogenetic tree of LgFKF1 protein

圖 6 LgFKF1在不同光周期下的表達(dá)Fig. 6 Expression of LgFKF1 under different photoperiods

圖 7 LgFKF1的時(shí)空表達(dá)Fig. 7 Spatio-temporal expression of LgFKF1

3 討論

本研究中，同源性比對(duì)結(jié)果顯示，LgFKF1與扁果樹(shù)、軟枝黃蟬、納塔爾倒吊筆、馬利筋的FKF1具有較高的同源性，而與研究成熟的擬南芥、水稻等草本模式植物的FKF1比對(duì)則沒(méi)有達(dá)到較高的同源性。然而，與LgFKF1同源性較高的這些物種的FKF1生物學(xué)功能研究目前未見(jiàn)報(bào)道。因此，推測(cè)LgFKF1由于序列結(jié)構(gòu)有別于草本模式植物，其功能也可能與草本模式植物存在差異。另外，生物信息學(xué)分析表明，LgFKF1蛋白具有不含信號(hào)肽，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)，屬于非分泌型親水蛋白，亞細(xì)胞預(yù)測(cè)定位在細(xì)胞核，符合擬南芥[14]、大豆[10]FKF1蛋白的特征，滿足FKF1基因發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的要求。

在擬南芥中，AtFKF1在長(zhǎng)日照下促進(jìn)開(kāi)花，短日照下開(kāi)花表型不明顯[4-5]；而大豆GmFKF1轉(zhuǎn)基因植株在長(zhǎng)日照下大部分稍微晚花，而過(guò)表達(dá)植株在短日照下有50%以上表現(xiàn)為極早花[10]。在本研究中，相對(duì)于非誘導(dǎo)光周期，LgFKF1在誘導(dǎo)光周期下除了在較短時(shí)間處理上上調(diào)表達(dá)外，隨處理時(shí)間延長(zhǎng)均下調(diào)表達(dá)。由此暗示，馥郁滇丁香LgFKF1在成花狀態(tài)下處于下調(diào)表達(dá)，其功能可能與擬南芥、大豆的FKF1有所不同，值得進(jìn)一步進(jìn)行功能驗(yàn)證。

不同植物的FKF1同源基因節(jié)律表達(dá)規(guī)律不盡相同。在擬南芥中，AtFKF1在長(zhǎng)日照下表達(dá)峰值出現(xiàn)在早上10:00，在短日照下表達(dá)峰值出現(xiàn)在早上7:00[15]；大豆GmFKF1的表達(dá)在短日照下僅在早上10：00達(dá)到峰值，在長(zhǎng)日照下僅在早上12:00達(dá)到峰值[10]；短日照洋蔥（Allium cepa）品種中，AcFKF1在長(zhǎng)日照和短日照下的表達(dá)都出現(xiàn)在早上7:00—8:00[16]。研究表明，F(xiàn)KF1在許多組織中均有表達(dá)，而以葉片中的表達(dá)量最高[17]。本研究中，LgFKF1除葉片中在早上8:00的表達(dá)峰值出現(xiàn)在白晝中，其余各組織中的表達(dá)峰值均出現(xiàn)在夜間，并且一些組織中還出現(xiàn)表達(dá)雙峰值，這與報(bào)道的草本植物存在差異。由此推測(cè)，馥郁滇丁香LgFKF1基因在成花調(diào)控中可能具有特異的生物學(xué)功能。

4 結(jié)論

從馥郁滇丁香中克隆獲得了FKF1同源基因LgFKF1，該基因編碼長(zhǎng)度為638 aa的蛋白質(zhì)，具有不含信號(hào)肽、無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)、屬于非分泌型親水蛋白以及亞細(xì)胞預(yù)測(cè)定位在細(xì)胞核等特征。隨誘導(dǎo)光周期處理時(shí)間延長(zhǎng)，LgFKF1相對(duì)于非誘導(dǎo)光周期呈下調(diào)表達(dá)；在誘導(dǎo)光周期下，根、芽及花蕾中出現(xiàn)單峰表達(dá)，而莖、葉及開(kāi)放的花朵中出現(xiàn)雙峰表達(dá)；除早上8:00葉片中的表達(dá)峰值出現(xiàn)在白晝，其余各組織中的表達(dá)峰值均出現(xiàn)夜間；一天中，葉片中的表達(dá)量最高。本研究為L(zhǎng)gFKF1基因生物功能的進(jìn)一步研究提供參考依據(jù)。