趙唯含，于 勇，陳泳凝，簡(jiǎn)祿勇，沈家林，陳 璐*

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西 咸陽(yáng) 712000；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712046）

慢性萎縮性胃炎（Chronic atrophic gastritis,CAG）為消化系統(tǒng)常見(jiàn)疾病，發(fā)病率占慢性胃炎的10%～20%。CAG動(dòng)物模型的建立，是進(jìn)行慢性萎縮性胃炎病因病機(jī)研究的重要基礎(chǔ)。幽門(mén)彈簧植入術(shù)配合高鹽熱淀粉糊灌胃法及MNNG復(fù)合多因素法均為目前常用的萎縮性胃炎造模方法。本研究擬分別采用這兩種方法復(fù)制慢性萎縮性胃炎模型，對(duì)比兩種模型的特征及穩(wěn)定性，為今后進(jìn)一步研究藥物防治CAG的實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 健康雄性Wistar大鼠220只，體質(zhì)量（160±20）g，SPF級(jí)，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，動(dòng)物許可證編號(hào)：SCXK（京）20090007，飼養(yǎng)于北京市中醫(yī)研究所SPF級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)間，12 h光照/黑夜循環(huán)，相對(duì)恒溫（25℃），恒濕（75%）。

1.2 試劑 氯化鈉（分析純，北京化工廠）；可溶性淀粉（分析純，天津福晨化學(xué)試劑廠）；MNNG（日本TCI公司）；鹽酸雷尼替丁膠囊（石家莊中諾藥業(yè)有限公司）；無(wú)水乙醇（北京化工廠）；PGE1酶聯(lián)免疫試劑盒（武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司，批號(hào)：SEA165Ra），PGE2酶聯(lián)免疫試劑盒（武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司，批號(hào)：SEA166Ra），GAS酶聯(lián)免疫試劑盒（美國(guó)abcam，批號(hào)：ab133049）。

1.3 主要儀器 活性金屬環(huán)型165宮內(nèi)節(jié)育器（上海醫(yī)用縫合針廠），分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司天平儀器廠），石蠟切片機(jī)（SLEE），離心機(jī)（Centrifuge 5415D，Eppendorf），BT224S 電子天平（德國(guó) Sartouris 公司）。

1.4 模型的構(gòu)建和分組 適應(yīng)性飼養(yǎng)大鼠7d后，按隨機(jī)對(duì)照表分為空白組10只、假手術(shù)組10只、手術(shù)模型組100只和MNNG模型組100只。

1.4.1 幽門(mén)彈簧植入術(shù)配合高鹽熱淀粉糊灌胃法的萎縮性胃炎大鼠模型構(gòu)建。

1.4.1.1 手術(shù)造模期 1）制備幽門(mén)彈簧：將活性金屬環(huán)型165宮內(nèi)節(jié)育器剪成2 cm長(zhǎng)的彈簧，螺距約為0.02～0.03 cm，所有彈簧經(jīng)高溫蒸汽滅菌后使用；2）彈簧幽門(mén)植入術(shù)：雄性Wistar大鼠禁食不禁水16 h，以10%的水合氯醛腹腔注射麻醉，開(kāi)腹暴露胃，將制備好的彈簧插入幽門(mén)，逐層縫合胃及腹壁切口。假手術(shù)組不放入彈簧，其余操作相同。手術(shù)后禁食不禁水24 h，連續(xù)3 d予青霉素腹腔注射，每只每天40萬(wàn)單位，恢復(fù)性飼養(yǎng)1周[1]。

1.4.1.2 藥物造模期 手術(shù)后第2周開(kāi)始，造模大鼠給予含15%氯化鈉和25%可溶性淀粉的高鹽熱淀粉糊溶液灌胃，溫度控制在60℃左右，每只大鼠灌胃2 mL，每周2次，共造模4個(gè)月。

1.4.2 MNNG負(fù)荷乙醇、雷尼替丁、饑飽失常法的萎縮性胃炎大鼠模型構(gòu)建 造模大鼠每天自由飲用MNNG溶液（120 μg·mL-1），同時(shí)每天予雷尼替丁溶液灌胃（0.03 g·kg-1），每周禁食1次，每次16 h，禁食第2天不予雷尼替丁灌胃，代之以體積分?jǐn)?shù)45%的乙醇（每只1 mL），連續(xù)造模14周[2]。

1.5 標(biāo)本的采集 實(shí)驗(yàn)大鼠禁食水16 h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，沿胃大彎剪開(kāi)，先進(jìn)行大體觀察；取幽門(mén)與前胃與腺胃交界線連線的2/5部分，用10%中性福爾馬林液固定，石蠟包埋。動(dòng)脈血置于離心管中常溫3 000 r·min-1離心10 min，取上清，-80℃保存，用于血清學(xué)指標(biāo)測(cè)定。

1.6 模型評(píng)價(jià)

1.6.1 一般情況 觀察動(dòng)物一般狀況體征的變化，每周給大鼠稱(chēng)量體質(zhì)量，每天記錄進(jìn)食量、飲水量，并觀察大鼠的毛發(fā)情況、排泄情況以及一般活動(dòng)狀況。

1.6.2 胃組織病理學(xué)評(píng)價(jià) 病理分析標(biāo)準(zhǔn)采用中國(guó)慢性胃炎共識(shí)意見(jiàn)中的病理診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。

1.6.3 血清PG I、PG II及GAS含量測(cè)定 按照說(shuō)明書(shū)要求雙抗體兩步夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定大鼠血清胃蛋白酶原I（pepsinogen I,PG I），胃蛋白酶原II（pepsinogen II,PG II）和血清胃泌素（Gastrin,GAS）水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較計(jì)量資料符合正態(tài)分布且方差齊采用單因素方差分析，符合正態(tài)分布且方差不齊采用Welch檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 兩種模型在造模過(guò)程中均出現(xiàn)體質(zhì)量降低，進(jìn)食及飲水量較空白組減少，兩者之間對(duì)比無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。幽門(mén)彈簧植入術(shù)配合高鹽熱淀粉糊灌胃法制備萎縮性胃炎大鼠模型死亡率為26.6%，MNNG負(fù)荷乙醇、雷尼替丁、饑飽失常法制備萎縮性胃炎大鼠模型死亡率為20%。

2.2 造模期間各組大鼠體質(zhì)量變化比較 與空白組比較，手術(shù)造模組及MNNG模型組大鼠毛發(fā)松散凌亂，沒(méi)有光澤，進(jìn)食、飲水量均減少，體質(zhì)量減輕，手術(shù)模型組從第2周開(kāi)始差異明顯有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），MNNG模型組從第4周開(kāi)始差異具有統(tǒng)計(jì)意義（P＜0.01），從第8周開(kāi)始MNNG模型組體質(zhì)量減輕更為明顯。假手術(shù)組體重減輕介于空白組及手術(shù)模型組之間。見(jiàn)表1。

表1 造模期間各組大鼠體質(zhì)量變化比較（±s） g

表1 造模期間各組大鼠體質(zhì)量變化比較（±s） g

注：與空白組比較，# P＜0.05，## P＜0.01

2.3 大鼠造模16周期間進(jìn)食量變化比較 與空白組比較，手術(shù)模型組及MNNG模型組進(jìn)食量均明顯減少，假手術(shù)組進(jìn)食量介于空白組及模型組之間。

2.4 大鼠造模16周期間飲水量比較 與空白組比較，手術(shù)模型組及MNNG模型組的飲水量均減少，MNNG模型組減少尤為明顯，假手術(shù)組飲水量介于空白組及模型組之間。

2.5 各組大鼠血清PG I、PG II及PG I/PG II水平比較 見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清PG I、PG II及PG I/PG II水平比較（±s）

表2 各組大鼠血清PG I、PG II及PG I/PG II水平比較（±s）

注：與空白組比較，## P＜0.01

2.6 各組大鼠血清GAS水平比較 見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血清GAS水平比較（±s） pg·mL-1

表3 各組大鼠血清GAS水平比較（±s） pg·mL-1

注：與空白組比較，## P＜0.01

2.7 大鼠胃組織病理情況

2.7.1 肉眼觀察 空白組和假手術(shù)組：前胃無(wú)明顯變化，腺胃黏膜被覆較多黏液，黏膜紅潤(rùn)，胃壁質(zhì)地柔軟有彈性；手術(shù)模型組：腺胃黏膜表面黃染，暴露黏膜顏色較空白組和假手術(shù)組略白，胃壁質(zhì)地較僵硬，彈性下降。MNNG模型組大鼠固有層腺體減少，排列不規(guī)則，間隙較大。

2.7.2 HE染色光鏡下觀察 空白組及假手術(shù)組大鼠黏膜結(jié)構(gòu)正常，腺體排列緊密、整齊；手術(shù)模型組大鼠胃黏膜見(jiàn)不同程度的萎縮，黏膜層變薄，固有層腺體減少，排列稀疏不規(guī)則，細(xì)胞核著色深染，有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜肌層增厚。MNNG模型組大鼠胃黏膜見(jiàn)明顯萎縮，固有層腺體減少，有腸上皮化生，少數(shù)見(jiàn)異型增生，細(xì)胞核著色深染，有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠胃組織觀察（HE，×100）

3 討論

慢性萎縮性胃炎（CAG）是消化系統(tǒng)常見(jiàn)病，但其病因和發(fā)病機(jī)制至今仍未闡明，治療上也缺乏特異有效的藥物，因此建立理想的、模擬人類(lèi)CAG發(fā)病機(jī)制的動(dòng)物模型對(duì)于研究CAG發(fā)病機(jī)制和防治方法有著很重要的意義。

3.1 幽門(mén)彈簧植入術(shù)配合高鹽熱淀粉糊灌胃法的萎縮性胃炎大鼠模型特點(diǎn) 萎縮性胃炎發(fā)病與膽汁反流、高鹽飲食、高熱飲食等相關(guān)。研究[4]表明，膽汁反流與胃黏膜的腺體萎縮以及腸上皮化生呈正相關(guān)，也可以誘導(dǎo)胃癌發(fā)生。飲食溫度過(guò)高也是萎縮性胃炎發(fā)生的致病因素[5]，過(guò)熱飲食會(huì)對(duì)消化道造成刺激并損傷黏膜，甚至造成癌變。高鹽飲食是致癌因素之一[6]，其可能機(jī)制為氯化鈉濃度高時(shí)可以延長(zhǎng)胃排空時(shí)間，導(dǎo)致致癌物質(zhì)侵入胃黏膜。本次實(shí)驗(yàn)選擇的15%氯化鈉溶液灌胃，同時(shí)加入25%的可溶性淀粉，可以使食鹽在胃內(nèi)停留時(shí)間更長(zhǎng)，出現(xiàn)持續(xù)性的胃黏膜損傷。

3.2 MNNG負(fù)荷乙醇、雷尼替丁、饑飽失常法的萎縮性胃炎大鼠模型特點(diǎn) 該模型是以化學(xué)致癌劑MNNG作為工具藥造模，模擬人不當(dāng)攝入硝酸鹽在胃內(nèi)轉(zhuǎn)化為亞硝酸胺等致癌物質(zhì)，作用于胃黏膜而成模的。亞硝酸鹽在胃內(nèi)會(huì)被轉(zhuǎn)化成亞硝基化合物，進(jìn)而產(chǎn)生氧自由基，進(jìn)一步會(huì)發(fā)生癌變[7]。雷尼替丁是臨床常用的選擇性的H2受體拮抗劑，給大鼠每日灌胃雷尼替丁以期抑制其胃酸分泌，促使飲用入胃的硝酸鹽轉(zhuǎn)為亞硝酸鹽,起到加速致模作用。研究[8]證實(shí)飲酒后，乙醇先停留在胃部，對(duì)胃及十二指腸的影響極大，可誘發(fā)多種急性或慢性胃或十二指腸的疾病。MNNG給藥同時(shí)負(fù)荷饑飽失常和酒精刺激，模擬人的不健康飲食習(xí)慣，多因素誘發(fā)大鼠黏膜病變。

3.3 手術(shù)模型組與MNNG模型組的區(qū)別 2種模型在造模過(guò)程中均出現(xiàn)體質(zhì)量降低，進(jìn)食及飲水量較空白組減少，幽門(mén)彈簧植入術(shù)模型死亡率為26.6%，MNNG負(fù)荷多因素法模型死亡率為20%。2種模型的病理均出現(xiàn)黏膜萎縮，固有層腺體減少等。但MNNG模型組大鼠胃黏膜可見(jiàn)明顯腸上皮化生及異型增生，幽門(mén)彈簧植入術(shù)淋巴濾泡較多，炎癥反應(yīng)明顯。兩種模型比較，幽門(mén)彈簧植入術(shù)造模更符合萎縮性胃炎的病理變化，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較MNNG模型明顯，而MNNG造模腸上皮化生較為明顯，更趨向于萎縮性胃炎癌前病變的病理變化。

血清胃泌素（GAS）以及胃蛋白酶原（PG I）和（PG II）的檢測(cè)可以判斷萎縮有無(wú)以及萎縮的部位，對(duì)于模型起到輔助診斷的作用。GAS由胃竇G細(xì)胞分泌，當(dāng)胃竇部發(fā)生萎縮時(shí)，G細(xì)胞數(shù)量減少，所以GAS下降可以認(rèn)為是胃竇萎縮的標(biāo)志[9]。胃蛋白酶原（PG）分為胃蛋白酶原I（PG I）和胃蛋白酶原II（PG II），它是胃蛋白酶的前體[10]，當(dāng)萎縮發(fā)生在胃體時(shí)，PG I/PG II比值下降。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MNNG模型組PG I/PG II含量較空白組下降（P＜0.05），MNNG模型組及手術(shù)模型組GAS含量均較正常組顯著降低（P＜0.01）。結(jié)合病理切片分析，幽門(mén)彈簧植入術(shù)誘導(dǎo)的CAG大鼠模型萎縮部位為胃竇部，MNNG誘導(dǎo)的CAG大鼠模型存在全胃萎縮，以胃竇萎縮為主。

綜上所述，幽門(mén)彈簧植入術(shù)配合高鹽熱淀粉糊灌胃法和MNNG負(fù)荷乙醇、雷尼替丁、饑飽失常法均可以成功構(gòu)建CAG模型。病理方面，幽門(mén)彈簧植入術(shù)誘導(dǎo)的CAG模型大鼠可導(dǎo)致胃竇黏膜萎縮，而且胃黏膜炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較明顯，更符合萎縮性胃炎的病理變化；MNNG誘導(dǎo)的CAG大鼠模型可導(dǎo)致全胃萎縮，而且胃黏膜腸上皮化生較為明顯，并且可以出現(xiàn)異型增生，更趨向于萎縮性胃炎癌前病變的病理變化。