高僑，余垚，蔡潔行

·論著·

不同外源基因拷貝數(shù)背景CHO細(xì)胞的宿主細(xì)胞蛋白種類的研究

高僑，余垚，蔡潔行

200137 上海藥明生物技術(shù)有限公司/復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)院遺傳工程國家重點(diǎn)實驗室（高僑）；200438 上海，復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)院遺傳工程國家重點(diǎn)實驗室（余垚）；200137 上海藥明生物技術(shù)有限公司（蔡潔行）

研究外源基因拷貝數(shù)、生產(chǎn)工藝、細(xì)胞多樣性對宿主細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響。

構(gòu)建空載體 CHO K1 細(xì)胞株，檢測其外源基因拷貝數(shù)，根據(jù)拷貝數(shù)的低、中、高對細(xì)胞進(jìn)行分類。使用不同的生產(chǎn)工藝測試低拷貝、中等拷貝和高拷貝的細(xì)胞群，觀察其宿主細(xì)胞蛋白表達(dá)之間的差異。最后將三個拷貝數(shù)水平的細(xì)胞群進(jìn)行混合，再生產(chǎn)，觀察其混合表達(dá)的宿主細(xì)胞蛋白與單獨(dú)生產(chǎn)時表達(dá)宿主細(xì)胞蛋白的差異。

研究結(jié)果顯示，不同拷貝數(shù)背景的細(xì)胞群之間表達(dá)宿主細(xì)胞蛋白相差 6% ~ 13%。相同的細(xì)胞進(jìn)行不同的工藝生產(chǎn)時，也因為基礎(chǔ)培養(yǎng)基和補(bǔ)料的不同而使宿主細(xì)胞蛋白的種類不同。細(xì)胞多樣性增加并不能引起宿主細(xì)胞蛋白表達(dá)的種類增多。

宿主細(xì)胞蛋白的表達(dá)與外源基因拷貝數(shù)、生產(chǎn)工藝以及細(xì)胞群的多樣性有關(guān)。

CHO 細(xì)胞； 宿主細(xì)胞蛋白； 外源基因拷貝數(shù)； 生產(chǎn)工藝； 多樣性

中國倉鼠卵巢細(xì)胞（Chineseovary cell，CHO），是治療性蛋白在工業(yè)生產(chǎn)中最為常用的哺乳動物細(xì)胞。它因為易于懸浮培養(yǎng)，具有良好的翻譯后修飾以及折疊等功能，產(chǎn)物胞外分泌，產(chǎn)量高而成為工業(yè)生產(chǎn)中最受歡迎的哺乳動物細(xì)胞。而在治療性蛋白生產(chǎn)的過程當(dāng)中，一些復(fù)雜的源于宿主細(xì)胞的蛋白也隨著治療性蛋白的表達(dá)而一起被表達(dá)出來，通常稱之為“宿主細(xì)胞蛋白”[1]，簡稱 HCPs。宿主細(xì)胞蛋白如果殘留在藥物制劑中，會引起人體的免疫應(yīng)答反應(yīng)，如：發(fā)熱、水腫甚至休克等[2]。藥物監(jiān)管部門最關(guān)注患者用藥的安全性，因此 HCPs 的監(jiān)控和殘留檢測變得越來越重要。市面上目前已經(jīng)有商業(yè)化 HCPs 檢測試劑盒（Cygnus F015），但 CHO HCPs 覆蓋率僅為 40% ~ 60%[3]。因此，藥監(jiān)局要求藥企在臨床 III 期使用特異性構(gòu)建的空載細(xì)胞株上清制備的 ELISA 試劑盒進(jìn)行 HCPs 殘留量檢測[4-5]。從側(cè)面說明 HCPs 的表達(dá)量可能與宿主類型、外源載體插入等因素相關(guān)[6]。目前對于 CHO 細(xì)胞宿主細(xì)胞蛋白表達(dá)與生產(chǎn)工藝的關(guān)聯(lián)，與外源基因插入拷貝數(shù)的關(guān)系；與細(xì)胞多樣性的關(guān)系研究較少。本實驗就此三方面利用野生型 CHO K1 細(xì)胞進(jìn)行外源基因的轉(zhuǎn)染和篩選，開展了相關(guān)研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 材料來源 本研究所使用的 CHO K1 細(xì)胞和載體均為上海藥明生物技術(shù)有限公司自主專利的產(chǎn)品。檢測空載質(zhì)?？截悢?shù)的探針及引物訂購于蘇州金唯智生物科技有限公司。

1.1.2 試劑和儀器 CD CHO 培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染使用的 Freestyle Max 系統(tǒng)、BM003H 培養(yǎng)基、殺稻瘟菌素、博來霉素以及細(xì)胞培養(yǎng)使用的 CO2靜置培養(yǎng)箱均購自賽默飛世爾科技有限公司；BM020H 培養(yǎng)基、FM020A 補(bǔ)料、FM016 補(bǔ)料購自 GE 生命科學(xué)公司；提取 DNA 使用的 DNeasy Blood &Tissue Kit 購買自美國 Qiagen 公司；細(xì)胞計數(shù)儀為 Beckman Coulter 公司產(chǎn)品；搖床為瑞士阿道夫科耐公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 表達(dá)外源基因的 CHO K1 空載體細(xì)胞株的建立 選用公司自主專利的空載體質(zhì)粒及 CHO K1 宿主細(xì)胞，該細(xì)胞使用 CD CHO 培養(yǎng)基，在 36.5 ℃，6% CO2、225 r/min 轉(zhuǎn)速下進(jìn)行培養(yǎng)。應(yīng)用 FreeStyle Max 轉(zhuǎn)染系統(tǒng)將兩個空載體質(zhì)粒 Vector 1 和 Vector 2 轉(zhuǎn)染至懸浮培養(yǎng)的 CHO K1細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后，對細(xì)胞進(jìn)行活細(xì)胞密度及細(xì)胞活率的檢測，根據(jù)該結(jié)果將細(xì)胞鋪板至 96 孔板中，同時更換為篩選性培養(yǎng)基，篩選抗生素為博來霉素和殺稻瘟菌素。隨后定期更換新鮮篩選培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，培養(yǎng)約 2 周后，待孔板內(nèi)細(xì)胞恢復(fù)，挑選恢復(fù)狀況良好的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，分別逐步擴(kuò)增至 24 孔板，6 孔板，最后至搖管。篩選期間，細(xì)胞在 36.5 ℃、6% CO2下進(jìn)行培養(yǎng)。進(jìn)入搖管后，依舊使用帶有篩選壓力的培養(yǎng)基進(jìn)行傳代，并對細(xì)胞進(jìn)行保種凍存，共傳 4 代。至此，能表達(dá)外源基因的空載體 CHO K1 迷你細(xì)胞群建立完成，該細(xì)胞群未進(jìn)行單克隆挑選的步驟。

1.2.2 外源基因相對拷貝數(shù)的檢測 選取已知 Vector 1 和 Vector 2 絕對拷貝數(shù)的克隆細(xì)胞株作為對照。利用 qPCR 技術(shù)進(jìn)行外源基因相對拷貝數(shù)的檢測。使用 DNeasy Blood & Tissue Kit 對細(xì)胞的 DNA 進(jìn)行抽提備用。設(shè)計針對載體序列的引物，以 B2M 管家基因為內(nèi)參，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，最后使用 ABI 7500 PCR 儀進(jìn)行檢測，7500 Software 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)讀取和分析。引物及探針序列設(shè)計如表 1 所示。根據(jù)外源基因相對拷貝數(shù)的結(jié)果，將細(xì)胞分為低拷貝、中等拷貝和高拷貝，共 3 類。并將每一類的迷你細(xì)胞群進(jìn)行混合，分別命名為 HCP mixture level 1（低拷貝）、HCP mixture level 2（中等拷貝）、HCP mixture level 3（高拷貝）三個細(xì)胞群。

1.2.3 不同生產(chǎn)工藝針對不同拷貝數(shù)背景的細(xì)胞群進(jìn)行宿主細(xì)胞蛋白的生產(chǎn) 選用兩個不同的批次補(bǔ)料工藝 A 和 B，工藝 A 與工藝 B 的參數(shù)設(shè)置如表 2。對 HCP mixture level 1、HCP mixture level 2、HCP mixture level 3 進(jìn)行批次補(bǔ)料實驗，批次補(bǔ)料期間，在補(bǔ)料當(dāng)天，利用 Vi-CELL XR 監(jiān)測期間活細(xì)胞密度和細(xì)胞活率的數(shù)值變化，考察基礎(chǔ)培養(yǎng)基和補(bǔ)料對三個細(xì)胞群的生長以及 HCPs 表達(dá)的影響。

表 1 引物及探針序列

1.2.4 不同多樣性細(xì)胞群進(jìn)行宿主細(xì)胞蛋白的生產(chǎn) 將 HCP mixture level 1、HCP mixture level 2、HCP mixture level 3 三個細(xì)胞群復(fù)蘇傳代后，再次進(jìn)行等密度混合，混合為一個 HCP 總細(xì)胞群，選擇表 1 中的工藝 A 進(jìn)行批次補(bǔ)料實驗。批次補(bǔ)料期間，在補(bǔ)料當(dāng)天，利用 Vi-Cell XR 監(jiān)測期間活細(xì)胞密度和細(xì)胞活率的數(shù)值變化，考察細(xì)胞群多樣性對 HCPs 表達(dá)的影響。

1.2.5 宿主細(xì)胞蛋白種類的分析與對比 收獲批次補(bǔ)料實驗的上清，研究胞外分泌的 HCPs，2D-Gel 法進(jìn)行宿主細(xì)胞蛋白種類分析。

2 結(jié)果

2.1 表達(dá)空載體 CHO K1 細(xì)胞群的篩選

本實驗成功構(gòu)建了表達(dá)外源基因的空載體細(xì)胞群，可正常在帶有篩選壓力的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中穩(wěn)定傳代存活。

表 2 批次補(bǔ)料實驗生產(chǎn)工藝參數(shù)對比

2.2 不同拷貝數(shù)背景的細(xì)胞群建立

通過 qPCR 方法對成功構(gòu)建的細(xì)胞群中的外源基因進(jìn)行了相對拷貝數(shù)的檢測，Vector 1 和Vector 2 相對拷貝數(shù)檢測分布如圖 1 所示。根據(jù)相對拷貝數(shù)的檢測結(jié)果，將兩個載體 Vector 1 和Vector 2 拷貝數(shù)均處于 1 ~ 10 之間的細(xì)胞群混合，命名為 HCP mixture level 1；兩個載體拷貝數(shù)中，只要有一方拷貝數(shù)處于 11 ~ 20 之間，將這一類細(xì)胞群進(jìn)行混合，命名為 HCP mixture level 2；兩個載體拷貝數(shù)中，只要有一方大于 21，將這一類細(xì)胞群進(jìn)行混合，命名為 HCP mixture level 3。

2.3 不同生產(chǎn)工藝的批次補(bǔ)料實驗

選擇 HCP mixture level 1、HCP mixture level 2、HCP mixture level 3 三個細(xì)胞群進(jìn)行批次補(bǔ)料實驗的研究。選用工藝 A 與工藝 B 進(jìn)行批次補(bǔ)料實驗，培養(yǎng) 2 周。生長曲線如圖 2 所示。

從批次補(bǔ)料實驗的結(jié)果來看，不同拷貝數(shù)背景的細(xì)胞群在工藝 A 下，活率變化并沒有太大的區(qū)別，而在活細(xì)胞密度的峰值上表現(xiàn)出不同，分布在 19E6 ~ 25E6 cells/ml 之間。不同拷貝數(shù)背景的細(xì)胞群在工藝 B 下，活率變化也沒有太大的區(qū)別，活細(xì)胞密度的峰值相差不大，但在第 6 天后，HCP mixture level 1 和 HCP mixture level 2 還繼續(xù)維持高密度的表現(xiàn)，而 HCP mixture level 3 活細(xì)胞密度則開始漸漸降低。

圖 1 qPCR 技術(shù)檢測細(xì)胞群外源基因相對拷貝數(shù)分布情況

Figure 1 The relative copy number distribution of exogenous genes using qPCR

Figure 2 Growth curves of pools with different copy number backgrounds in process A (A) and B (B)

A：HCP mixture level 1 在工藝 A 下 HCPs 2D-Gel 檢測膠圖；B：HCP mixture level 2 在工藝 A 下 HCPs 2D-Gel 檢測膠圖；C：HCP mixture level 3 在工藝 A 下 HCPs 2D-Gel 檢測膠圖；D：HCP mixture level 2 在工藝 B 下 HCPs 2D-Gel 檢測膠圖

A: HCPs 2D-Gel results of HCP mixture level 1 under process A; B: HCPs 2D-Gel results of HCP mixture level 2 under process A; C: HCPs 2D-Gel results of HCP mixture level 3 under process A; D: HCPs 2D-Gel results of HCP mixture level 2 under process B

圖 3 2D-Gel 檢測膠圖

Figure 3 2D-Gel results

2 周培養(yǎng)結(jié)束后，收獲上清，利用 2D-Gel 方法研究胞外分泌的宿主細(xì)胞蛋白，利用 PDQuest 軟件進(jìn)行 HCPs 種類的分析。結(jié)果如圖 3。PDQuest軟件分析 HCPs 種類，結(jié)果如表 3 所示。

從 HCPs 種類分析結(jié)果來看，在相同工藝 A 下，對比 HCP mixture level 1、2、3 三種拷貝數(shù)背景的 HCP 種類，HCP mixture level 2 > HCP mixture level 1 > HCP mixture level 3。以 HCP mixture level 1 為對比基準(zhǔn)，HCP mixture level 2 較 HCP mixture level 1 種類多 84 種，占 HCPs 基準(zhǔn)種類的 6%。HCP mixture level 2 較 HCP mixture level 3 種類多 167 種，占 HCPs 基準(zhǔn)種類的 13%。推測不同拷貝數(shù)背景的細(xì)胞群即使是在相同的工藝下，HCPs 的種類差別也較大。

表 3 HCPs 種類分析

對比 HCP mixture level 2 在不同的工藝 A、B 中，HCPs 種類相差 92 種，占 HCPs 基準(zhǔn)種類的7%。也可推測出，即使遺傳背景相同，不同的生產(chǎn)工藝也會在 HCPs 的表達(dá)上引起變化。

圖 4 HCPs 總細(xì)胞群在工藝 A 下生長曲線圖

Figure 4 Growth curves in HCPs mixed pools in process A

2.4 細(xì)胞多樣性

將 HCP mixture level 1、HCP mixture level 2、HCP mixture level 3 三個細(xì)胞群進(jìn)行混合，混合后成為多樣性最多的一個細(xì)胞群，選用工藝 A 進(jìn)行批次補(bǔ)料實驗，培養(yǎng) 2 周。生長數(shù)據(jù)如圖 4 所示。

從細(xì)胞生長上來看，混合后培養(yǎng)的活率變化與用 A 工藝單獨(dú)培養(yǎng) HCP mixture level 1、HCP mixture level 2、HCP mixture level 3 時無太大差別?；罴?xì)胞密度變化圖中可看出，活細(xì)胞密度峰值達(dá)到 20E6 cells/ml，與單獨(dú)培養(yǎng) HCP mixture level 1、HCP mixture level 2、HCP mixture level 3 時對比，處于中等水平。

培養(yǎng) 2 周結(jié)束，收獲上清，利用 2D-Gel 技術(shù)研究胞外分泌的宿主細(xì)胞蛋白的表達(dá)情況。如圖 5 所示。

經(jīng)過 PDQuest 軟件分析，HCPs 總細(xì)胞群在工藝 A 下所表達(dá) HCPs 共 1299 種。通過對比，HCPs 總細(xì)胞群與 HCP mixture level 1 相比少2 個點(diǎn)；與 HCP mixture level 2 相比少 86 個點(diǎn)，與 HCP mixture level 3 相比多 81 個點(diǎn)；并未出現(xiàn)預(yù)期中 HCPs 總細(xì)胞群所表達(dá)的宿主細(xì)胞蛋白種類為三個細(xì)胞群所表達(dá)宿主細(xì)胞蛋白種類的總和[7]。這可能是由于細(xì)胞群經(jīng)過再次混合，細(xì)胞群的多樣性增加，同時細(xì)胞與細(xì)胞之間競爭變得更加激烈[8]，生長快的細(xì)胞會逐漸占據(jù)優(yōu)勢，生長慢的細(xì)胞被逐漸淘汰，導(dǎo)致宿主細(xì)胞蛋白譜變窄，進(jìn)而最終影響到宿主細(xì)胞蛋白的表達(dá)[9-13]。

3 討論

HCPs 的去除和最終產(chǎn)品中其含量的鑒定，在工業(yè)生產(chǎn)和臨床申報中是十分重要的。雖然目前市面上已經(jīng)有商業(yè)化的 ELISA 試劑盒檢測產(chǎn)品中HCPs 的殘留，但由于其檢測HCPs 覆蓋率低，不能滿足臨床申報時 CFDA 的要求[14-15]。

圖 5 HCPs總細(xì)胞群在工藝 A 下HCPs 2D-Gel 檢測膠圖

Figure 5 HCPs 2D-Gel results of HCPs mixed pools

由于蛋白的表達(dá)可能受到外源基因插入的拷貝數(shù)、生產(chǎn)時所用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基、補(bǔ)料、生產(chǎn)所用的宿主細(xì)胞類型，以及生產(chǎn)所用細(xì)胞的多樣性等多方面因素影響。本實驗針對以上影響因素，設(shè)計了一系列實驗，成功構(gòu)建了 CHO K1 空載體宿主細(xì)胞，獲得了不同拷貝數(shù)背景的細(xì)胞群。通過對比，發(fā)現(xiàn)低拷貝、中等拷貝、高拷貝的細(xì)胞群在相同工藝進(jìn)行生產(chǎn)的情況下，宿主細(xì)胞蛋白的種類差異高達(dá) 6% ~ 13%，說明外源基因的拷貝數(shù)對宿主細(xì)胞蛋白的表達(dá)的確存在影響。選取中等拷貝數(shù)背景的 HCP mixture level 2 進(jìn)行不同生產(chǎn)工藝的 HCPs 對比，發(fā)現(xiàn)即使是同一株細(xì)胞，在不同的生產(chǎn)工藝下，HCPs 種類相差約 7%。分析原因，可能是由于基礎(chǔ)培養(yǎng)基或補(bǔ)料的成分中如某些氨基酸，維生素等的配比有所差別，而由于細(xì)胞群中某些細(xì)胞對某些氨基酸的消耗量要求更高，這種氨基酸的濃度缺失導(dǎo)致這類細(xì)胞生長及表達(dá)受到限制，細(xì)胞群中各類細(xì)胞的比例發(fā)生變化，進(jìn)而影響了整體 HCPs 的種類變化[16-18]。進(jìn)一步說明 HCPs 的表達(dá)實際上與生產(chǎn)工藝中的基礎(chǔ)培養(yǎng)基、補(bǔ)料等相關(guān)。

在對三個細(xì)胞群 HCP mixture level 1、HCP mixture level 2、HCP mixture level 3 進(jìn)行混合后，考察 HCPs 總細(xì)胞群的宿主細(xì)胞蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其 HCPs 表達(dá)種類有所減少，說明 HCPs 的種類并不如預(yù)期中越增加細(xì)胞群多樣性宿主細(xì)胞蛋白種類越多的設(shè)想[19-20]。由此對比市面上商業(yè)化試劑盒，該試劑盒為一個通用檢測試劑盒，試劑盒中所包含的抗 HCPs 抗體，有一些免疫原性比較弱或完全不具有免疫原性，造成其并不能很好地覆蓋產(chǎn)品中的 HCPs 種類，導(dǎo)致其特異性并不是很強(qiáng)，本實驗中特異性構(gòu)建的空載細(xì)胞群所生產(chǎn)的HCPs 相對于使用同宿主 CHO K1 構(gòu)建的單克隆細(xì)胞株而言，HCPs 的表達(dá)更有針對性。本實驗所構(gòu)建得到的不同拷貝數(shù)背景的空載體細(xì)胞群，可根據(jù)最終產(chǎn)品的最終生產(chǎn)工藝進(jìn)行選擇對應(yīng)的工藝生產(chǎn)，得到的 HCPs 種類可能會更加接近同種 CHO K1 細(xì)胞進(jìn)行產(chǎn)品生產(chǎn)時所產(chǎn)生的 HCPs。

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Research of the host cell protein species with different exogenous gene backgrounds in CHO cells

GAO Qiao, YU Yao, CAI Jie-xing

WuXi Biologics/State Key Laboratory of Genetic Engineering, School of Life Sciences, Fudan University (GAO Qiao); State Key Laboratory of Genetic Engineering, School of Life Sciences, Fudan University, Shanghai 200438, China

This research was designed to explore the effect of exogenous gene copy number, process of production and cell diversity on host cell protein expression in CHO K1 cell pools.

We successfully developed three null cell lines of CHO K1 to detect the exogenous gene copy number levels, and classify the cells according to high, medium, low levels of gene copy number. Two processes were selected to evaluate three pools for the differential expression of HCPs. Finally, all three pools were mixed together and then the differential expression of HCPs between the mixed pools with unmixed ones were evaluated by process A.

There were around 6% to 13% difference in HCPs expression among the pools with different exogenous gene copy number backgrounds. When we used the same cell line with different processes, the host cell proteins also showed differences from each other since the basic media and feed media were not the same. The addition of pool diversity didn’t lead to the increase of host cell protein species.

The host cell protein expression is influenced by exogenous gene copy number levels, process of the production and diversity of cells.

CHO cells; Host cell proteins; Exogenous gene copy number; Production process; Diversity of pools

CAI Jie-xing, Email: cai_jiexing@wuxiapptec.com

蔡潔行，Email：cai_jiexing@wuxiapptec.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.02.014

(YU Yao); WuXi Biologics (CAI Jie-xing), Shanghai 200137, China

2019-11-18