王靜，戴成祥，李萍，沈美萍，李蘇克，劉必佐

·論著·

SB431542對人羊膜上皮細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

王靜*，戴成祥*，李萍，沈美萍，李蘇克，劉必佐

201210 上海賽比曼生物科技有限公司

探討通過添加 TGF-β 抑制劑 SB431542控制人羊膜上皮細(xì)胞的干性、表型和間質(zhì)特性，為SB431542 在預(yù)防人羊膜上皮細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）中的作用提供依據(jù)。

使用不同濃度 SB431542 培養(yǎng) P2 代人羊膜上皮細(xì)胞，通過細(xì)胞的增殖曲線和基因水平（CK8、ACTA2、OCT4 和 KLF4）表達(dá)的差異，篩選出最適濃度。以不加 SB431542 的細(xì)胞為對照組，以加最適濃度的 SB431542 為實驗組，比較不同代次的對照組和實驗組的細(xì)胞倍增時間，基因表達(dá)水平（CK8、CK19、OCT4、KLF4、Vimentin、ACTA2），流式檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物（CD146、CD105、SSEA4）和免疫熒光檢測細(xì)胞蛋白表達(dá)情況（CK8、ACTA2、EpCAM）的差異。

使用不同濃度 SB431542 培養(yǎng) P2 代人羊膜上皮細(xì)胞，5 μmol/L SB431542 培養(yǎng)條件下的細(xì)胞增殖曲線最優(yōu)，且基因水平（CK8、ACTA2、OCT4 和 KLF4）表達(dá)最優(yōu)，最終篩選最適藥物濃度為 5 μmol/L SB431542 完成后續(xù)實驗。在 5 μmol/L SB431542 培養(yǎng)條件下，P7 代實驗組的細(xì)胞倍增時間優(yōu)于對照組；P7 代實驗組細(xì)胞的 CK8、CK19、KLF4、OCT4 的表達(dá)水平明顯高于對照組細(xì)胞的表達(dá)水平，實驗組的 ACTA2（α-SMA）和 Vimentin 表達(dá)水平明顯低于對照組細(xì)胞的表達(dá)水平；P3 和 P5 代細(xì)胞的實驗組的間充質(zhì)標(biāo)志物 CD146、CD105 的表達(dá)量均比對照組的低，實驗組干細(xì)胞標(biāo)志物 SSEA4 的表達(dá)量均比對照組的高；P7 代實驗組的 CK8 和 EpCAM 表達(dá)效果強(qiáng)于 P7 代對照組細(xì)胞，且 P7 代實驗組的 α-SMA 基本不表達(dá)。

5 μmol/L SB431542 在人羊膜上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)7 個代次以內(nèi)可以有效地抑制其上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生。

人羊膜上皮細(xì)胞； TGF-β； SB431542； 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化； 干細(xì)胞

羊膜是位于胎兒胎盤內(nèi)側(cè)的一層薄膜。人羊膜上皮細(xì)胞（human amniotic epithelial cells，hAECs）表達(dá)多種胚胎干細(xì)胞表面標(biāo)志物：腫瘤排斥抗原 TRA1-60、TRA1-81，階段性特異性抗原 SSEA3、SSEA4，多潛能轉(zhuǎn)錄因子 NANOG、OCT4、SOX2[1]。這些因子相互協(xié)調(diào)，在維持胚胎干細(xì)胞的自我更新和多向分化潛能方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[2]。目前，人羊膜上皮細(xì)胞已在結(jié)膜重建、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、肝臟疾病等動物疾病模型中取得初步成效[3-6]。然而，要實現(xiàn)人羊膜上皮細(xì)胞的臨床應(yīng)用，仍有許多待解決的問題，特別是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生。人羊膜上皮細(xì)胞在體外擴(kuò)增過程中由于自發(fā)經(jīng)歷了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），其自身會發(fā)生性狀的改變[7]。EMT是上皮細(xì)胞獲得間充質(zhì)表型的一個轉(zhuǎn)分化過程。上皮細(xì)胞通常呈頂基極性，通過黏附連接和緊密連接表現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞-細(xì)胞黏附性，基底基質(zhì)主要由 IV 型膠原和層粘連蛋白組成[8]。EMT 誘導(dǎo)發(fā)生后，上皮細(xì)胞失去黏附性，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，并獲得了頂端到尾端的極性[8-9]。發(fā)生 EMT 的上皮細(xì)胞分裂并侵入基底膜，沿著纖維連接蛋白和 I 型膠原新形成的基質(zhì)遷移[9]。上皮細(xì)胞標(biāo)志物的豐度開始降低，而間質(zhì)標(biāo)志物的豐度開始增加。細(xì)胞通路信號，如 TGF-β、Wnt 和 FGF 可以抑制 EMT 以及促進(jìn)它的逆向過程 MET 的發(fā)生[10]。EMT 過程將會導(dǎo)致上皮細(xì)胞相關(guān)蛋白（E-Cadherin、Cytokeratin-8）表達(dá)的丟失，上調(diào)間充質(zhì)相關(guān)蛋白[如波形蛋白（Vimentin）、α 平滑肌肌動蛋白（α-SMA）]的表達(dá)[10-11]，特別是 EMT 顯著改變了人羊膜上皮細(xì)胞的生物學(xué)特性和再生潛力[12-13]。人羊膜上皮細(xì)胞 EMT 是一種依賴于 TGF-β 的現(xiàn)象，使用一種 TGF-β 受體抑制劑 SB431542 可以阻止 EMT的發(fā)生并保留人羊膜上皮細(xì)胞的上皮表型。SB431542 是一種 TGF-β I 型受體激活素受體樣激酶（ALK）5、ALK 4 和 ALK 7 的抑制劑，可以誘導(dǎo) Smad2/Smad4 和 Smad3/Smad4 依賴的轉(zhuǎn)錄，但對 BMP 信號通路沒有影響[14]。在 A498 細(xì)胞中，SB431542 抑制TGF-β I 誘導(dǎo)的膠原 Iα1 和 PAI-1 mRNA。此外，SB431542 抑制 TGF-β I 誘導(dǎo)的纖連蛋白 mRNA 和蛋白的表達(dá)[15]。SB431542 抑制 TGF-β 調(diào)節(jié)的生長因子，包括 PDGF-A、FGF-2 和 HB-EGF[16]。在 NMuMG 和 PANC-1 細(xì)胞中，SB431542 也抑制 TGF-β 調(diào)節(jié)的上皮細(xì)胞向間質(zhì)轉(zhuǎn)型[17]。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與耗材 人足月胎盤經(jīng)知情同意情況下獲得，符合倫理要求。上皮細(xì)胞培養(yǎng)基（EpiCM）購于美國 Sciencell 公司；10 × TrypLE、RevertAid? First Strand cDNA Synthesis Kit、TaqMan?Gene Expression assays、α-SMA 多克隆抗體、CK8 單克隆抗體均購于美國 Thermos 公司；SB431542 購于美國 Selleck 公司；RNAeasy? Plus 動物 RNA 抽提試劑盒（離心柱式）、CCK8 均購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；CD146-PE、CD324-FITC、SSEA4-FITC、CD105-APC 均購于美國 Biolegend 公司；DMSO 購于德國 WAK 公司；青鏈霉素購于德國 PAN Biotech 公司。

1.2 方法

1.2.1 人羊膜上皮細(xì)胞的分離 將胎盤的胎兒面朝上放置于紫外消毒生物安全柜，使用手術(shù)刀劃“十”字，四等分羊膜，使用無菌手術(shù)鑷、手術(shù)剪剝?nèi)√ケP表面的羊膜。第一次消化：①將羊膜置于 10 cm 直徑培養(yǎng)皿，培養(yǎng)皿中裝有 1/2 體積的含有抗生素（1% 青鏈霉素）的PBS。②用手術(shù)鑷夾持羊膜進(jìn)行漂洗，重復(fù)漂洗 2 ~ 3 遍，去除血細(xì)胞。③轉(zhuǎn)移羊膜至新的 10 cm 直徑培養(yǎng)皿中，添加 10 × TrypLE（10 ml/g 組織），將組織放置于恒溫?fù)u床中，37 ℃，100 r/min 消化0.5 h。④消化完畢，將組織及消化液轉(zhuǎn)入 15 cm 直徑的培養(yǎng)皿中，使用細(xì)胞刮鏟，輕刮細(xì)胞。⑤將羊膜組織轉(zhuǎn)入新的 10 cm 直徑培養(yǎng)皿中，用于第二次消化。細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入50 ml 離心管中，以 4 ℃、300 ×條件離心10 min。⑥棄去上清液，使用 20 ml PBS 重懸沉淀，4 ℃保存。第二次消化：①在 10 cm 直徑培養(yǎng)皿的羊膜組織中，添加 10 × TrypLE 20 ml，將組織放置于恒溫?fù)u床中，37 ℃、100 r/min 消化0.5 h。②消化完畢，將組織及消化液轉(zhuǎn)入 15 cm 直徑的培養(yǎng)皿中，使用細(xì)胞刮鏟，輕刮細(xì)胞。③細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入 50 ml 離心管中，以 4 ℃、300 ×條件離心10 min。④棄去上清液，使用 20 ml PBS 重懸沉淀，4 ℃保存。⑤將第一次和第二次消化的細(xì)胞懸液混勻，臺盼藍(lán)計數(shù)，按照 2 × 104/cm2接種 T75 培養(yǎng)瓶，37 ℃體積分?jǐn)?shù) 5% CO2培養(yǎng)。⑥ 48 h 換液，以后每 2 天換液 1 次，直至細(xì)胞可以進(jìn)行傳代。

1.2.2 人羊膜上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng) 細(xì)胞接種密度為 2 × 104/cm2，37 ℃體積分?jǐn)?shù) 5% CO2培養(yǎng)。使用未添加 SB431542 的上皮完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。上皮完全培養(yǎng)基的配制按照EpiCM 的使用說明進(jìn)行。人羊膜上皮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)：人羊膜上皮細(xì)胞生長至 90% 時，每個 T75 培養(yǎng)瓶加入 2 ml TrypLE 進(jìn)行消化傳代。消化 2 min，加未加藥物的上皮完全培養(yǎng)基終止消化，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至50 ml 離心管中，1200 r/min 離心 5 min，棄上清，計數(shù)，按照 1 × 104/cm2接種，置于 37 ℃體積分?jǐn)?shù) 5% CO2培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)基：上皮完全培養(yǎng)基中添加不同濃度的 SB431542。

1.2.3 篩選最適濃度 SB431542 ①將 SB431542 溶于 DMSO，濃度配制成 10 mmol/L。②將 10 mmol/L SB431542 加入至上皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基中，分別配制成 0、1、5、10、50 μmol/L 濃度。③取 P2 代人羊膜上皮細(xì)胞，使用不同藥物濃度的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每 2 天換一次加藥培養(yǎng)基。④使用 CCK8，對培養(yǎng) 1、2、3、4 d 的 P2 代細(xì)胞進(jìn)行生長曲線測定。⑤使用 qPCR 檢測培養(yǎng) 3 d 的 P2 代細(xì)胞的 CDH1、CK8、OCT4、KLF4、ACTA2（α-SMA）的基因表達(dá)情況。⑥篩選出最適的藥物濃度完成后續(xù)實驗。

1.2.4 細(xì)胞生長曲線測定 取不添加 SB431542 的上皮完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的 P1 代人羊膜上皮細(xì)胞，經(jīng) TrypLE 消化，以 1 × 104/cm2的密度接種于96 孔板，每個藥物濃度的細(xì)胞接種 2 孔。以對應(yīng)的藥物濃度的完全培養(yǎng)基作為空白對照，接種2 孔，SB431542 的濃度分別為 0、1、5、10、50 μmol/L。使用 CCK8 試劑盒測試在不同濃度 SB431542 的培養(yǎng)條件下，人羊膜上皮細(xì)胞在 1、2、3、4 d 的代謝值，并篩選出細(xì)胞代謝最高值對應(yīng)的藥物濃度。

1.2.5 細(xì)胞倍增時間測定 取不添加 SB431542 的上皮完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的 P1 代人羊膜上皮細(xì)胞，經(jīng) TrypLE 消化，以 1 × 104/cm2的密度接種于T25 培養(yǎng)瓶。對照組細(xì)胞使用不加 SB431542 的上皮完全培養(yǎng)基，實驗組細(xì)胞使用最適濃度的 SB421542 的上皮完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，等細(xì)胞90% 融合度，進(jìn)行傳代，標(biāo)記為 P2 代細(xì)胞，以此類推，計算出 P1 ~ P7 代每個代次的人羊膜上皮細(xì)胞的倍增時間。細(xì)胞倍增時間計算：DT = t×[lg2/（lgNt – lgN0）]（t：培養(yǎng)時間；N0 為接種細(xì)胞數(shù)，Nt 為 t 時間后的細(xì)胞數(shù)）。

1.2.6 熒光定量 PCR（qPCR）檢測 使用 RNA 抽提試劑盒抽提 RNA，使用 RevertAid? First Strand cDNA Synthesis Kit 反轉(zhuǎn)錄 1 μg RNA。根據(jù)實驗要求，使用 TaqMan?Gene Expression assays 中的探針為引物（表 1），熒光定量 PCR 檢測相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子 mRNA 表達(dá)量。并以 GAPDH 為內(nèi)參，實驗重復(fù) 3 次。PCR 結(jié)束后收集 Ct 值，使用 2-??CT法對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

表 1 熒光定量 PCR 引物設(shè)計

注：使用TaqMan Gene Expression assays進(jìn)行 qPCR 分析，評估相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的 mRNA 表達(dá)水平情況。

Note: TaqMan Gene Expression assays were used for qPCR analysis to evaluate mRNA expression levels of related transcription factors.

1.2.7 免疫熒光鑒定羊膜上皮細(xì)胞 ①取出12 孔板，將涂有多聚賴氨酸的細(xì)胞爬片置于孔內(nèi)；②以不加藥物培養(yǎng)的 P1、P3、P7 人羊膜上皮細(xì)胞作為陰性對照，以最適濃度 SB431542 培養(yǎng)的 P1、P3、P7 人羊膜上皮細(xì)胞作為實驗組，以 1 × 104/cm2密度接種；③細(xì)胞爬片按以下步驟進(jìn)行染色：PBS 漂洗 3 次，細(xì)胞經(jīng) 4% 多聚甲醛溶液室溫固定20 min；PBS 漂洗 3 次，使用 0.5% Triton X-100 進(jìn)行破膜；加入 500 μl 封閉液（PBS 含0.1% 的BSA 稀釋）室溫封閉30 min；分別加入一抗 CK8、EpCAM、α-SMA 在 4 ℃條件下孵育過夜；PBS 漂洗 3 次，加入二抗，室溫避光孵育 1 h；PBS 漂洗 3 次，加入1 μg/ml 的DAPI 500 μl，孵育10 min。漂洗、晾干、封固后熒光顯微鏡下觀察。

1.2.8 流式檢測人羊膜上皮細(xì)胞 ①以不加藥物培養(yǎng)的 P3、P5、P7 人羊膜上皮細(xì)胞作為陰性對照，以最適濃度 SB431542 培養(yǎng)的 P3、P5、P7 人羊膜上皮細(xì)胞作為實驗組。收集細(xì)胞懸液，1500 r/min 離心 5 min，棄上清（留 100 μl 左右液體）。②加抗體（CD324、CD146、CD105、SSEA4），避光 20 min孵育。③加 1 ml/管 PBS，1500 r/min 離心 5 min，棄上清。④加 500 μl PBS，樣品用于上機(jī)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

使用 GraphPad Prism 5.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 5 μmol/L SB431542 為最適藥物濃度

使用 CCK8 檢測 P2 代人羊膜上皮細(xì)胞在不同濃度藥物影響下每天的代謝450值。從實驗數(shù)據(jù)來看（圖 1A），50 μmol/L SB431542 對細(xì)胞的增殖具有顯著抑制作用，低劑量 SB431542（0、1、5、10 μmol/L）對于細(xì)胞的增殖沒有抑制作用。

使用 qPCR 檢測不同濃度藥物影響的 P2 代人羊膜上皮細(xì)胞的基因表達(dá)水平情況。使用的Marker 為上皮標(biāo)志物CK8、間充質(zhì)標(biāo)志物 ACTA2（α-SMA）、干細(xì)胞特性標(biāo)志物 OCT4 和 KLF4。從實驗數(shù)據(jù)來看（圖 1B），5 μmol/L SB431542 和對照組 0 μmol/L SB431542 在 CK8 和 KLF4 的基因表達(dá)水平上具有顯著性差異（< 0.05）。

綜上，挑選最適藥物濃度為 5 μmol/L SB431542完成后續(xù)對不同代次人羊膜上皮細(xì)胞的上皮表型影響的實驗。

2.2 5 μmol/L SB431542 對人羊膜上皮細(xì)胞的增殖影響

記錄每個代次 90% 融合度的細(xì)胞數(shù)和時間（h），計算每個代次細(xì)胞倍增所需要的時間。對照組為不加藥的細(xì)胞，實驗組為 5 μmol/L SB431542 處理的細(xì)胞。

實驗數(shù)據(jù)（圖 2）表明，P1 ~ P6 人羊膜上皮細(xì)胞加藥和不加藥的細(xì)胞倍增時間基本一致。在 P7 代，加藥的細(xì)胞倍增時間為 43.5 h，不加藥的細(xì)胞倍增時間為 61.4 h。5 μmol/L SB431542 在7 個代次內(nèi)可維持羊膜上皮細(xì)胞的增殖。

圖 1 5 μmol/L SB431542 為 hAECs 生長的最佳的濃度（A：每天將 CCK8 加入不同濃度 SB431542 培養(yǎng)的細(xì)胞中，根據(jù)OD450讀數(shù)繪制生長曲線；B：使用 qPCR 檢測不同濃度 SB431542 培養(yǎng)的 P2 hAECs 的生物標(biāo)志物的表達(dá)水平情況；*P < 0.05）

Figure 1 5 μmol/L of SB431542 was considered as the optimal concentration [A: The growth curve was drawn based on the450read after CCK8 was added to cells cultured with different concentration of SB431542 each day; B: The expression of biological markers including cytokeratin 8 (CK8), mesenchymal marker ACTA2 (α-SMA), and stem cell markers OCT4 and KLF4 were assessed by qPCR analysis in P2 hAECs treated with SB431542 at different concentrations;*< 0.05]

圖 2 5 μmol/L SB431542 對不同代次的人羊膜上皮細(xì)胞的倍增時間影響

Figure 2 Effect of SB431542 on doubling time of hAECs at different generation

2.3 5 μmol/L SB431542 對人羊膜上皮細(xì)胞的基因表達(dá)水平的影響

使用 qPCR 檢測對照組和實驗組 P1、P3、P7 代人羊膜上皮細(xì)胞的基因表達(dá)水平情況。使用的Marker 為上皮標(biāo)志物角蛋白 8（CK8）和 19（CK19）、干細(xì)胞標(biāo)志物 OCT4 和 KLF4、間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物波形蛋白和 ACTA2（α-SMA）。從實驗數(shù)據(jù)（圖 3）來看，對照組和實驗組在 CK8、CK19、KLF4、OCT4、波形蛋白和 ACTA2（α-SMA）的基因表達(dá)水平上都有顯著性差異（< 0.05）。且在 P7 代時，實驗組細(xì)胞的 CK8、CK19、KLF4、OCT4 的表達(dá)水平明顯高于對照組細(xì)胞的表達(dá)水平；實驗組細(xì)胞的 ACTA2（α-SMA）和波形蛋白明顯低于對照組的表達(dá)水平。

圖 3 使用 qPCR 方法檢測對照組和實驗組的 P1、P3、P7 hAECs 基因表達(dá)情況（*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001）

Figure 3 The qPCR analysis was performed to assess gene expression in the P1, P3 and P7 hAECs of the control and experimental groups (*< 0.05,**< 0.01,***< 0.001)

2.4 5 μmol/L SB431542 對人羊膜上皮細(xì)胞的表面標(biāo)志物的影響

流式檢測技術(shù)檢測對照組和實驗組 P3、P5、P7 代人羊膜上皮細(xì)胞的表面標(biāo)志物的變化情況。使用的 Marker 為間充質(zhì)標(biāo)志物 CD146、CD105 和干細(xì)胞標(biāo)志物 SSEA4。從實驗數(shù)據(jù)（表 2）來看，P3 和 P5 代細(xì)胞的對照組的間充質(zhì)標(biāo)志物 CD146、CD105 的表達(dá)量都要比實驗組的高，對照組 SSEA4 的表達(dá)量都要比實驗組的低。

2.5 5 μmol/L SB431542 對人羊膜上皮細(xì)胞的蛋白表達(dá)的影響

免疫熒光檢測 P1 和 P7 代人羊膜上皮細(xì)胞的表面標(biāo)志物的變化情況。使用的 Marker 為上皮細(xì)胞標(biāo)志物CK8 和 EpCAM、間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物 α-SMA。從實驗結(jié)果來看（圖 4），P1 代實驗組的 CK8 和 EpCAM 表達(dá)效果強(qiáng)于 P1 代對照組細(xì)胞，α-SMA 都為弱表達(dá)；P7 代實驗組的 CK8 和 EpCAM 表達(dá)效果強(qiáng)于 P7 代對照組細(xì)胞，且 P7 代實驗組的 α-SMA 基本不表達(dá)。

3 討論

本研究證實了 TGF-β 抑制劑 SB431542 在人羊膜上皮細(xì)胞體外擴(kuò)增過程中維持其上皮表型、保持干性的作用。新鮮分離的人羊膜上皮細(xì)胞表達(dá)高水平的上皮標(biāo)志物 CK8 和低水平的間充質(zhì)標(biāo)志物 α-SMA。然而，隨著傳代次數(shù)的增加，CK8 的表達(dá)量減少，α-SMA 的表達(dá)量增加。α-SMA 是EMT 過程中蛋白組成的一部分[18]。由于 CK8 和 α-SMA 在 EMT 和 MET 過程中具有快速的調(diào)節(jié)作用，因此被選為首選的 EMT 標(biāo)記物[19]。KLF4 在 EMT 過程中也被鑒定為 TGF-β 調(diào)控基因[20-21]。人羊膜上皮細(xì)胞具有較強(qiáng)的KLF4 表達(dá)，隨著傳代次數(shù)的增加，KLF4 表達(dá)逐漸減少，最終消失。波形蛋白的存在也被認(rèn)為是細(xì)胞發(fā)生 EMT 的一個重要標(biāo)志[22]。此外，在上皮細(xì)胞向間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程中，波形蛋白的表達(dá)已被證明會誘導(dǎo)細(xì)胞的表型、活力和細(xì)胞黏附能力發(fā)生改變[23]。

表 2 5 μmol/L SB431542 對于不同代數(shù)人羊膜上皮細(xì)胞的表面標(biāo)志物影響

注：使用流式檢測方法，觀察對照組和實驗組中 P3、P5、P7 hAECs 相關(guān)表面標(biāo)志物的變化情況。

Note: The changes of surface markers of P3, P5 and P7 of hAECs between control group and experimental group were observed by flow cytometry.

在 P7 代時，使用 SB431542 處理過的人羊膜上皮細(xì)胞的 CK8、CK19、KLF4、OCT4 的基因表達(dá)水平高于對照組細(xì)胞的表達(dá)水平；實驗組細(xì)胞的 ACTA2（α-SMA）和波形蛋白的基因表達(dá)水平低于對照組的表達(dá)水平。從實驗數(shù)據(jù)可以看出，SB431542 在基因水平上有抑制人羊膜上皮細(xì)胞的 EMT 的發(fā)生，同時不影響人羊膜上皮細(xì)胞的干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)。使用 SB431542 處理過的P3、P5 代人羊膜上皮細(xì)胞的間充質(zhì)表面標(biāo)志物CD146、CD105 的表達(dá)量都要比對照組的低，而 SSEA4 的表達(dá)量都要比對照組的高。實驗結(jié)果表明，SB431542 在蛋白表達(dá)水平上能抑制人羊膜上皮細(xì)胞的 EMT 的發(fā)生，但同時促進(jìn)干細(xì)胞特性相關(guān)蛋白 SSEA4 的表達(dá)。P1 代實驗組的 CK8 和 EpCAM 表達(dá)效果強(qiáng)于 P1 代對照組細(xì)胞，α-SMA 都為弱表達(dá)；P7 代實驗組的 CK8 和 EpCAM 表達(dá)效果強(qiáng)于 P7 代對照組細(xì)胞，且 P7 代實驗組的 α-SMA 基本不表達(dá)。使用 SB431542 處理后的人羊膜上皮細(xì)胞在 P7 代仍能夠形成緊密的“鋪路石”上皮樣，但是對照組的細(xì)胞呈間充質(zhì)特點的“長梭形”。

圖 4 5 μmol/L SB431542 對于不同代次羊膜上皮細(xì)胞的蛋白表達(dá)情況影響（對照組：未經(jīng) SB431542 處理的 hAECs；實驗組：使用 5 μmol/L SB431542 處理過的 hAECs；熒光標(biāo)記：綠色；DAPI：藍(lán)色；標(biāo)尺：50 μm）

Figure 4 Effect of 5 μmol/L SB431542 on protein expression in different generations of hAECs (Control group: hAECs without SB431542 treatment; Experimental group: hAECs treated by 5 μmol/L SB431542; Markers: Green; DAPI: Blue; Scale bar: 50 μm)

TGF-β 對細(xì)胞的生長、分化和免疫功能都有重要的調(diào)節(jié)作用。TGF-β 能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖[24]，抑制上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞的增殖[25]。同時 TGF-β 在治療傷口愈合[26]，促進(jìn)軟骨和骨修復(fù)[27]以及通過免疫抑制治療自身免疫性疾病[28]等方面有潛在的應(yīng)用前景。在本研究中使用了 TGF-β 抑制劑 SB431542 處理了人羊膜上皮細(xì)胞，但其在體內(nèi)的生物學(xué)安全性仍有待后續(xù)研究。

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Effect of SB431542 on epithelial mesenchymal transformation of human amniotic epithelial cells

WANG Jing, DAI Cheng-xiang, LI Ping, SHEN Mei-ping, LI Su-ke, LIU Bi-zuo

Cellular Biomedicine Group, Shanghai 201210, China

SB431542 was added to control the stemness, phenotype and mesenchymal characteristics of human amniotic epithelial cells. The objective of this study is to provide evidence for the role of TGF-β inhibitor SB431542 in preventing epithelial mesenchymal transformation of human amniotic epithelial cells.

Different concentrations of SB431542 was used to culture P2 human amniotic epithelial cells, and the optimal concentration was selected through cell proliferation curve and gene expression (CK8, ACTA2, OCT4 and KLF4). Cells without SB431542 were used as the control group, while cells with SB431542 were experimental group. Cells doubling time, gene expression levels (CK8, CK19, OCT4, KLF4, Vimentin, ACTA2), the mesenchymal biomarkers (CD146, CD105, SSEA4) and epithelial biomarker levels (CK8, ACTA2, EpCAM) were detected by cellular number accounting, qPCR, flow cytometry and immunofluorescence, respectively, and compared between the control group and the experimental group.

When cultured P2 human amniotic epithelial cells were treated with different concentration of SB431542, the cell proliferation and the gene expression (CK8, ACTA2, OCT4 and KLF4) were the best after treatment with 5 μmol/L SB431542. Therefore, 5 μmol/L SB431542 was used in the following experiments. Under the culture condition of 5 μmol/L SB431542, the doubling time of P7 cell group was better than that of control group. Also, the gene expression levels of CK8, CK19, KLF4, OCT4 in P7 cell group with 5 μmol/L SB431542 were significantly higher than that in control group, while ACTA2 (α-SMA) and Vimentin in P7 cell group with 5 μmol/L SB431542 were significantly lower than that in control group. Expression levels of mesenchymal markers CD146, CD105 in P3 and P5 cells group with 5 μmol/L SB431542 were lower, while SSEA4 was higher, than that in the control group. The expressions of epithelial markers CK8 and EpCAM in the P7 cell group with 5 μmol/L SB431542 were higher than that in the P7 control group, while the α-SMA in the P7 experimental group was undetectable.

5 μmol/L SB431542 can inhibit the occurrence of epithelial mesenchymal transformation effectively in human amniotic epithelial cells culturedwithin 7 generations.

Human amniotic epithelial cells; TGF-β; SB431542; Epithelial mesenchymal transformation; Stem cells

·協(xié)會之窗·

中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會積極配合多部委開展新冠肺炎干細(xì)胞治療應(yīng)急科研課題備案

新型冠狀病毒感染作為一個全新的疾病，目前對其診治還有很多處于摸索階段，為此部分醫(yī)療機(jī)構(gòu)提出了開展干細(xì)胞治療新冠肺炎臨床研究的課題，科技部也啟動了相關(guān)的應(yīng)急科研立項。為了加快相關(guān)干細(xì)胞臨床研究的備案，中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會作為干細(xì)胞臨床研究備案技術(shù)審核單位，積極配合國家衛(wèi)生健康委、國家藥監(jiān)局、科技部，開通干細(xì)胞治療新冠肺炎臨床研究備案審核的快速通道，組織專家提前介入，完善研究方案，協(xié)助相關(guān)課題的備案工作。

中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會關(guān)于設(shè)立新分支機(jī)構(gòu)的公告

根據(jù)《民政部關(guān)于貫徹落實國務(wù)院取消全國性社會團(tuán)體分支機(jī)構(gòu)、代表機(jī)構(gòu)登記行政審批項目的決定有關(guān)問題的通知》（民發(fā)[2014]38 號）和《中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會分支機(jī)構(gòu)管理辦法》等有關(guān)規(guī)定，由有關(guān)專家和機(jī)構(gòu)發(fā)起，經(jīng)協(xié)會第六屆理事會第二次理事會議審議通過，決定設(shè)立“中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會臨床前評價技術(shù)專業(yè)委員會”、“中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會臨床研究專業(yè)委員會”、“中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會神經(jīng)修復(fù)與再生分會”、“中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會醫(yī)工結(jié)合分會”等4 個新分支機(jī)構(gòu)。

LI Ping, Email: freezonli@aliyun.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.02.013

李萍，Email：freezonli@aliyun.com

2019-09-17

*同為第一作者