秦利萍 董二飛 白 洋 周 練 任嵐揚(yáng) 張任鳳 劉朝顯蔡一林

玉米tasselseed突變體的遺傳分析與分子鑒定

秦利萍**董二飛**白 洋 周 練 任嵐揚(yáng) 張任鳳 劉朝顯*蔡一林*

西南大學(xué)玉米研究所 / 南方山地農(nóng)業(yè)教育部工程研究中心, 重慶 400715

性別決定與玉米雄穗和雌穗發(fā)育密切相關(guān), 性別決定基因功能研究對(duì)性別決定分子機(jī)制的解析具有重要意義。利用甲基磺酸乙酯(EMS)處理B73花粉, 獲得了一個(gè)玉米雄穗結(jié)實(shí)突變體()。用掃描電鏡對(duì)突變體雄穗的形態(tài)學(xué)觀察, 發(fā)現(xiàn)未成熟雄穗長13 mm時(shí), 小穗呈現(xiàn)出明顯的雌性化特征。利用圖位克隆的方法, 把定位于分子標(biāo)記LM4和RM5之間, 物理距離約為290 kb, 該區(qū)間共有9個(gè)注釋基因, 其中包括已報(bào)道的性別決定基因()。通過克隆突變體中基因編碼序列, 發(fā)現(xiàn)基因編碼區(qū)第196個(gè)堿基鳥嘌呤被替換為腺嘌呤, 導(dǎo)致該位點(diǎn)編碼的甘氨酸被替換為精氨酸, 由此推測該保守位點(diǎn)突變可能是tasselseed表型產(chǎn)生的原因。和等位性測驗(yàn)結(jié)果表明所有F1、F2代植株雄穗均可產(chǎn)生花絲, 推測是基因一個(gè)新的等位突變體。以加外源茉莉酸(JA, 1 mmol L–1)處理突變體, 發(fā)現(xiàn)處理后的小穗大部分可恢復(fù)正常?；虮磉_(dá)分析揭示在正常植株未成熟雄穗中的表達(dá)量最高, 其次是未成熟雌穗及葉片中; 在未成熟雄穗和雌穗中, 該基因的表達(dá)量極顯著降低。保守位點(diǎn)的突變及其引起的表達(dá)量的降低可能是tasselseed表型產(chǎn)生的原因。

;; 雄穗結(jié)實(shí); 精細(xì)定位; 等位測驗(yàn)

玉米(L.)是典型的雌雄同株、雌雄異花植物, 是研究性別決定的重要模式植物之一[1]。玉米花序發(fā)育過程中產(chǎn)生了4種類型的側(cè)生分生組織, 在發(fā)育中按產(chǎn)生先后順序分為側(cè)支分生組織、小穗成對(duì)分生組織、小穗分生組織和小花分生組織[2]。玉米小花分生組織繼續(xù)分化形成包括3個(gè)雄蕊和3個(gè)心皮的兩性花, 隨后雄穗中的雌蕊原基和雌穗中的雄蕊原基分別發(fā)生選擇敗育, 最終形成了單性花, 這一性別決定過程是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程, 受到植物激素、遺傳因子和環(huán)境因素的共同調(diào)控[3]。

大量研究表明植物激素茉莉酸(jasmonic acid, JA)、赤霉素(GA)和油菜素內(nèi)酯(BR)等參與了玉米性別決定過程。前人研究表明、、、和與JA信號(hào)通路有關(guān), 該通路調(diào)控了玉米雄蕊和雌蕊的發(fā)育。編碼一個(gè)脂氧合酶[4], 是JA合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶; 其功能的缺失導(dǎo)致脂氧合酶活性消失, 玉米內(nèi)源JA濃度下降, 最終導(dǎo)致雄穗性別反轉(zhuǎn), 小穗雌性化, 產(chǎn)生大量花絲?；蚓幋a一個(gè)短鏈乙醇脫氫酶[5], 該酶可能會(huì)產(chǎn)生一個(gè)促進(jìn)凋亡的信號(hào)或者降解細(xì)胞存活所需要的底物[6-7];基因功能的喪失同樣會(huì)導(dǎo)致玉米雄穗產(chǎn)生與突變體類似的tasselseed表型。不同于和基因功能喪失后表現(xiàn)為隱性突變,為顯性突變體, 除了雄穗小穗性別發(fā)生反轉(zhuǎn), 產(chǎn)生雌性化的小穗外, 雌穗下位花不能敗育, 導(dǎo)致果穗籽粒排列紊亂;編碼一個(gè)創(chuàng)傷誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白酶ZmCYP94B1, 該酶可使有生物活性的JA和異亮氨酸偶聯(lián)物JA-Ile失活, 影響了JA的代謝, 致使植株內(nèi)源JA含量降低, 最終影響性別決定[8]。對(duì)、和突變體施加外源JA, 均可恢復(fù)小穗雄蕊發(fā)育, 產(chǎn)生有功能的花粉[4,8], 該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了這3個(gè)基因與JA代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程密切相關(guān)。在玉米雄穗發(fā)育過程中,和基因調(diào)控了雄穗和雌穗下位花雌蕊的敗育, 與此相反,基因促進(jìn)雌蕊的發(fā)育[9]?；蛲蛔兒? 導(dǎo)致雌穗不能正常產(chǎn)生花絲;基因過表達(dá)導(dǎo)致T0代轉(zhuǎn)基因植株雄穗完全雌性化, 雌穗上位花和下位花雌蕊均可發(fā)育?；蚓幋a一個(gè)UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶, 該酶可能使過氧化物酶體中的JA或者JA前體失活, 從而破壞了JA信號(hào)通路, 使和調(diào)控的雌蕊敗育過程受阻[10];發(fā)揮功能的區(qū)域因受到基因的限制, 而僅限于雌穗上位花, 從而保證了雄穗中的雌蕊和雌穗下位花雌蕊的敗育[11]。與擬南芥直系同源的玉米基因和, 在單個(gè)基因功能喪失情況下, JA合成沒有受到明顯影響, 雄穗和雌穗均能正常發(fā)育; 然而在雙突變體中, JA的含量顯著下降, 雄穗明顯表現(xiàn)出類似和的雌性化特征, 施加外源JA則可使雄穗發(fā)育恢復(fù)正常[12-13]。

除了JA, 赤霉素在玉米性別決定中也扮演了重要角色。矮稈突變體、、、和均表現(xiàn)為雄蕊不能正常敗育[14], 這是因?yàn)槌嗝顾卣：铣赏緩绞艿揭种圃斐傻腫15-16], 施加外源赤霉素則可恢復(fù)正常表型[17]。同時(shí)用外源赤霉素對(duì)性別分化前正常植株持續(xù)處理, 會(huì)導(dǎo)致部分雄穗小穗雄蕊完全轉(zhuǎn)變成雌蕊[18], 這充分說明了赤霉素在玉米雌蕊發(fā)育中發(fā)揮重要作用。亦有研究表明油菜素內(nèi)酯等激素參與了玉米性別決定過程。通過對(duì)經(jīng)典矮稈突變體的鑒定, 發(fā)現(xiàn)植株在BR生物合成途徑中攜帶一個(gè)功能缺失突變的同源基因[19], 導(dǎo)致DET2特異性底物累積, 下游BR代謝物減少。用BR生物合成抑制劑處理野生型玉米植株完全模擬了突變體的矮化和tasselseed表型, 揭示了BR對(duì)玉米性別的控制作用。此外,和分子機(jī)制的闡釋, 揭示了其在轉(zhuǎn)錄調(diào)控水平上, 而不是在激素的生物合成上發(fā)揮的重要作用。編碼一個(gè)花同源異型基因-like轉(zhuǎn)錄因子, 在小穗分生組織的確定性方面具重要功能;編碼一個(gè)microRNA zma-MIR172e, 其調(diào)控了基因的表達(dá)[20]。

我們利用EMS誘變B73花粉, 獲得了一個(gè)tasselseed突變體。本研究對(duì)的表型進(jìn)行了鑒定, 利用F2作圖群體開展了目標(biāo)基因的分子定位, 并與突變體進(jìn)行了等位性測驗(yàn)。該研究為進(jìn)一步深入解析玉米性別決定分子機(jī)制提供了有價(jià)值的參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

突變體(-N2409)來自Maize Genetics Cooperation Stock Center (http://maizecoop.cropsci.uiuc. edu/)。2016年3月于重慶市北碚區(qū)西南大學(xué)歇馬實(shí)驗(yàn)基地種植自交系B73和Mo17。參照Neuffer等[21]的方法, 用EMS和液體石蠟配制體積比6.7×10–4∶1的工作液對(duì)B73花粉進(jìn)行誘變處理, 將誘變后的花粉用毛筆涂抹于Mo17花絲; 同年9月于云南玉溪播種獲得的M0代籽粒并自交。2017年6月在誘變?nèi)后w中鑒定出3個(gè)雄穗結(jié)實(shí)突變體, 依次命名為和; 同時(shí)用與Mo17建構(gòu)F2分離群體, 用于的分子定位。2018年6月, 在植株雌性化雄穗未抽出前套袋, 待雌性化雄穗抽出后, 把花粉授予植株雌性化雄穗, 得到F1代雜交籽粒; 同年9月把雜交后代種植于云南玉溪, 觀察F1代植株雄穗發(fā)育形態(tài), 且對(duì)能產(chǎn)生花粉的植株進(jìn)行自交。

1.2 Simple sequence repeat (SSR) 標(biāo)記開發(fā)及連鎖標(biāo)記篩選

從Gramene (http://www.gramene.org/)數(shù)據(jù)庫下載玉米基因組序列, 用SSR Hunter[22]搜索構(gòu)成重復(fù)元件核苷酸數(shù)最多是4個(gè), 重復(fù)次數(shù)最少為4次的SSR序列; 然后在NCBI網(wǎng)站 (https://blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行Blast比對(duì), 以單拷貝SSR序列為模板用Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm. nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi)設(shè)計(jì)引物。正向引物位于模板1~150 bp之間, 反向引物位于170~308 bp之間, 擴(kuò)增片段最低120 bp, 正、反向引物長22 bp, 最短20 bp, 最長不超過25 bp, GC含量在40%~60%之間, 正、反向引物退火溫度差異不超過1℃, 其他參數(shù)為默認(rèn)設(shè)置。然后利用開發(fā)的SSR標(biāo)記對(duì)B73和Mo17基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增, PCR產(chǎn)物經(jīng)6%聚丙烯酰胺電泳及銀染后判斷其是否具有多態(tài)性[23]。

在F2分離群體中, 根據(jù)表型分別取10株正常植株和突變植株葉片提取DNA, 等量混合構(gòu)建野生型DNA池和突變體DNA池; 用在B73和Mo17之間具有多態(tài)性的432對(duì)SSR標(biāo)記[24]對(duì)2個(gè)DNA池?cái)U(kuò)增, 鑒定出與連鎖的分子標(biāo)記。用篩選出的及新開發(fā)的SSR標(biāo)記(附表1)對(duì)所有突變體個(gè)體的基因型進(jìn)行分析, 鑒定出發(fā)生染色體片段交換的突變植株, 對(duì)基因精細(xì)定位。

1.3 ts12形態(tài)學(xué)觀察

將F2分離群體播于大田, 20 d后取幼苗葉片, 提取DNA, 進(jìn)行個(gè)體基因型鑒定。篩選出帶型與突變體、雜合帶型植株及與Mo17一致的純合帶型植株(野生型)。待玉米生長至V7時(shí)期, 剝離不同發(fā)育階段和野生型植株新鮮未成熟雄穗, 直接在掃描電鏡(Hitachi SU3500, Tokyo, Japan)下觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。

1.4 外源JA處理

將JA溶于無水乙醇, 配成1 mmol L–1的工作液, 保存于4℃; 以0.05%乙醇為對(duì)照。待F2群體中植株及野生型植株生長至35 d, 每天下午5:00左右用移液器吸取1 mL 1 mmol L–1JA溶液和0.05%乙醇注入玉米心葉, 持續(xù)處理14 d。統(tǒng)計(jì)JA、乙醇處理及無任何處理的雄穗結(jié)實(shí)數(shù)。

1.5 精細(xì)定位區(qū)間基因注釋

在Gramene網(wǎng)站下載精細(xì)定位區(qū)間內(nèi)基因及其編碼蛋白序列, 然后以蛋白序列為種子序列Blast比對(duì)NCBI蛋白質(zhì)無冗余數(shù)據(jù)庫(Non-redundant protein sequences), 搜索目標(biāo)蛋白在其他物種中的注釋及功能, 從而對(duì)玉米中的同源基因進(jìn)行功能注釋。

1.6 ts12突變體中ts2基因的克隆和序列分析

根據(jù)基因(Zm00001d028806)序列, 利用Primer-BLAST設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物(附表1)擴(kuò)增B73和雄穗cDNA。PCR擴(kuò)增體系含模板cDNA 1 μL、2 × KOD buffer 10 μL、KOD FX NEO (1.0 U μL–1) 0.5 μL、引物 (10 μmol L–1) 1.5 μL、dNTPs (10 mmol L–1) 0.2 μL, 添加ddH2O至20 μL。PCR擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5 min, 94℃變性10 s, 62℃退火30 s, 68℃延伸1 min, 擴(kuò)增35個(gè)循環(huán), 最后68℃延伸5 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測, 膠回收PCR產(chǎn)物后連接到PEASY-Blunt載體上, 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞, 經(jīng)過PCR鑒定后, 選取含有目的條帶的5個(gè)菌株樣本送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。使用DNAMAN (https://www.lynnon.com/)比對(duì)分析測序結(jié)果。

1.7 RNA提取及基因表達(dá)量分析

對(duì)F2分離群體植株基因型鑒定后, 取V7時(shí)期及野生型植株的根、莖、葉、雄穗(1~2 cm), V9時(shí)期的雌穗(1~2 cm), 及未抽出苞葉的花絲和授粉后20 d的胚、胚乳, 速凍于液氮, 于–80℃保存。在150℃烘箱中對(duì)研缽處理4 h后, 將各組織研磨。用RNA提取試劑盒(RNAprep Pure Plant Kit)和RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RevertAid RT Reverse Transcription Kit)提取RNA及合成cDNA第1鏈。以cDNA為模板, 用定量引物-qPCR (附表1), 以為內(nèi)參, 在實(shí)時(shí)定量PCR儀(Analytik Jena qTOWER, Jena, Germany)上定量分析。PCR擴(kuò)增體系含cDNA 1 μL、引物0.75 μL、SYBR 6.25 μL, 補(bǔ)超純水至13 μL。PCR擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性3 min; 95℃變性15 s, 62℃退火15 s, 循環(huán)數(shù)為40。使用公式2–DDCT計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 ts12突變體表型觀察及遺傳方式分析

突變體營養(yǎng)生長階段發(fā)育正常, 與野生型植株沒有明顯差異; 然而抽雄后成熟雄穗產(chǎn)生大量花絲(圖1-B), 授粉后能正常結(jié)實(shí); 同時(shí)發(fā)現(xiàn)雄穗主穗及側(cè)枝頂端部分小穗仍能正常發(fā)育、散粉(圖1-C), 自交后可獲得純合突變體。在掃描電鏡下觀察V7階段未成熟雄穗可見, 野生型未成熟雄穗長約12 mm時(shí), 小穗分生組織分化產(chǎn)生雄蕊和雌蕊(圖1-D), 但未見雌蕊產(chǎn)生心皮組織; 相反, 在未成熟雄穗長約13 mm時(shí), 則明顯可見雌蕊產(chǎn)生胚珠原基和心皮結(jié)構(gòu)(圖1-E)。表明突變體雄穗長約13 mm時(shí)小穗發(fā)育異常, 表現(xiàn)出了雌性化的特征。

用純合突變體與Mo17雜交產(chǎn)生的F1代雄穗發(fā)育為正常植株, 然后自交構(gòu)建了F2分離群體。在F2代群體150個(gè)植株中, 突變植株35株, 正常植株115株(表1)。經(jīng)過卡平方檢驗(yàn), 野生型和突變體符合3∶1的分離比例(χ2= 0.22 <χ20.05= 3.84), 說明突變體是由隱性單基因控制。

2.2 ts12精細(xì)定位

用在B73和Mo17之間有多態(tài)性且能覆蓋整個(gè)玉米基因組的432對(duì)SSR標(biāo)記, 對(duì)構(gòu)建的突變體DNA池和野生型植株DNA池進(jìn)行連鎖標(biāo)記的篩選。結(jié)果顯示第1染色體1.04 bin的SSR標(biāo)記umc1169的擴(kuò)增產(chǎn)物在兩個(gè)DNA混合池之間具有多態(tài)性(圖2-A); 用該標(biāo)記對(duì)15個(gè)植株基因型鑒定發(fā)現(xiàn), 除了交換單株基因型為雜合外(圖2-B), 其他植株基因型均與表型一致, 推測umc1169與呈連鎖關(guān)系。在umc1169附近開發(fā)了6個(gè)SSR標(biāo)記(附表1), 并分別對(duì)F2群體中501株突變體的基因型進(jìn)行鑒定。在umc1169位點(diǎn)鑒定交換單株86個(gè), 且在這86株中分別鑒定出24、12、6個(gè)植株分別在RM1、RM2和RM3位點(diǎn)發(fā)生了交換; 在LM1位點(diǎn)鑒定交換單株28個(gè), 且在28個(gè)重組植株中, 有10株在LM2位點(diǎn)發(fā)生了交換, 從而把目標(biāo)基因初步定位于SSR標(biāo)記LM2和RM3之間, 物理距離約為1.6 Mb的區(qū)間內(nèi)(圖3-A)。然后繼續(xù)開發(fā)SSR和InDel標(biāo)記, 并分別在LM3、LM4位點(diǎn)鑒定4個(gè)和2個(gè)交換單株, 在RM4和RM5位點(diǎn)分別鑒定交換單株2個(gè)和1個(gè), 最終把目標(biāo)基因定位于InDel標(biāo)記LM4和RM5之間約290 kb的物理區(qū)間內(nèi)(圖3-B)。

圖1 ts12表型觀察

A和B: 野生型和成熟雄穗; C:雄穗上能正常發(fā)育產(chǎn)生花粉的小穗; D和E: 未成熟野生型雄穗(12 mm)和雄穗(13 mm)掃描電鏡觀察。WT: 野生型; G: 雌蕊; ST: 雄蕊; C: 心皮。

A and B: mature tassel of the wild type and; C: the normal spikelets that could produce pollens ontassels. D and E: immature tassel of the wild type (12 mm) and(13 mm) under scanning electron microscope. WT: wild type; G: gynoecium; ST: stamen; C: carpel.

表1 ts12顯隱性的分離比檢驗(yàn)

#3:1分離比適合性檢驗(yàn)。#Chi-square test for 3:1 segregation ratio.

圖2 ts12連鎖標(biāo)記umc1169的篩選及驗(yàn)證

MT:DNA混合池; WT: 野生型DNA混合池。

MT: DNA pool of; WT: DNA pool of wild-type plants.

2.3 ts12候選基因及突變位點(diǎn)分析

定位區(qū)間290 kb內(nèi)共含有9個(gè)注釋基因(表2), 其中包括已經(jīng)克隆的玉米性別決定基因(Zm00001d028806), 推測突變表型可能是基因突變?cè)斐傻摹Ｌ崛〖兒贤蛔凅w雄穗總RNA, 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。設(shè)計(jì)-JD引物(附表1)擴(kuò)增基因序列, 擴(kuò)增片段序列與B73CDS比對(duì)發(fā)現(xiàn)第196個(gè)堿基鳥嘌呤G被替換為腺嘌呤A (圖4), 導(dǎo)致該位點(diǎn)編碼氨基酸甘氨酸被替換為精氨酸; 該突變位點(diǎn)位于Ts2蛋白乙醇脫氫酶保守結(jié)構(gòu)域A中。截取突變位點(diǎn)附近DNA序列與B104、EP1、F7、Mo17、PH207和W22 自交系中基因相應(yīng)位置序列比對(duì)發(fā)現(xiàn), 該位點(diǎn)在其他自交系中非常保守, 沒有SNP變異(圖5)。由此推測基因中單核苷酸的轉(zhuǎn)換可能是導(dǎo)致tasselseed表型的原因。

2.4 ts12和ts2突變體等位性測驗(yàn)

突變體雌性化雄穗主穗及側(cè)枝頂部個(gè)別小穗可正常發(fā)育產(chǎn)生有功能的花粉, 而突變體雄穗小穗完全雌性化, 不能產(chǎn)生有功能的花粉(圖6-A), 因此取植株花粉對(duì)雌性化雄穗花絲授粉, 3 d后重復(fù)授粉一次。將獲得的F1代植株播于大田, 待抽雄后觀察雄穗表型。通過對(duì)56個(gè)F1植株表型的觀察, 發(fā)現(xiàn)F1植株雄穗均發(fā)生雌性化(圖6-B), 可產(chǎn)一樣能正常發(fā)育產(chǎn)生少量有功能的花粉, 可產(chǎn)生自交后代F2; 進(jìn)一步觀察113株F2雄穗表型, 發(fā)現(xiàn)所有植株均產(chǎn)生與F1植株一樣的雌性化雄穗。由此推斷是的等位突變體, 即突變表型是由編碼乙醇脫氫酶基因的突變引起的。

圖3 ts12精細(xì)定位

黑色實(shí)線上方相鄰標(biāo)記之間的數(shù)字代表物理距離, 括號(hào)內(nèi)數(shù)字代表標(biāo)記在染色體上的確切位置, 標(biāo)記下方的紅色數(shù)字代表交換單株數(shù)目。

The numbers above the solid back line between SSR markers represent physical distance. The numbers in parenthesis represent the exact position of the marker on chromosome. The red numbers under SSR markers represent recombination events.

表2 ts12定位區(qū)間內(nèi)基因功能注釋

圖4 B73和ts12中Ts2基因CDS序列比對(duì)

紅色下畫線部分代表保守結(jié)構(gòu)域A, 綠色方框代表中氨基酸發(fā)生替換的位點(diǎn)。

The parts underlined in red color represent the conserved domain A of. The green rectangle indicates the mutation site of the amino acid substitution in.

圖5 ts12突變體和6個(gè)自交系中的Ts2基因突變位點(diǎn)序列比對(duì)

藍(lán)色方框代表基因的單核苷酸突變位點(diǎn)。

The blue rectangle indicates the single nucleotide mutation site of the

圖6 ts12和ts2突變體等位測驗(yàn)

A:植株雌性化雄穗; B:和等位測驗(yàn)后代表型。

A: the feminized tassel ofmutant; B: the mutant phenotype in the offspring of allelism test ofand.

2.5 外源植物激素JA處理

JA在玉米性別決定調(diào)控中發(fā)揮重要作用, 已知在外源JA處理后雌性化雄穗可恢復(fù)正常[4]。用1 mmol L–1JA溶液、0.05%乙醇分別處理23株和16株生長35 d的突變體, 雄穗發(fā)育成熟后, 分別觀察小穗性別恢復(fù)情況, 并統(tǒng)計(jì)雄穗結(jié)實(shí)數(shù)(圖7)。未實(shí)施任何處理的15株和用0.05%乙醇處理的16株突變體平均結(jié)實(shí)數(shù)分別為133粒和144粒, 雄穗結(jié)實(shí)數(shù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上并無明顯差異(圖7-A, B, D); 相反用JA處理的植株雄穗性別得到了恢復(fù)(圖7-C), 花絲數(shù)量明顯減少, 平均雄穗結(jié)實(shí)29粒, 與未實(shí)施任何處理和用0.05%乙醇處理植株的雄穗結(jié)實(shí)數(shù)有極顯著差異。同時(shí)在田間發(fā)現(xiàn)JA處理植株性別恢復(fù)程度并不完全一致, 部分植株雌性化小穗恢復(fù)程度較低, 但也有部分植株99%雌性化小穗得到恢復(fù)。該結(jié)果證實(shí)基因參與JA合成途徑, 從而影響了玉米性別決定過程。

A: 未處理的雄穗表型; B: 0.05%乙醇處理的雄穗表型; C: JA處理的雄穗表型; D: 雄穗結(jié)實(shí)數(shù)統(tǒng)計(jì); 柱形圖上方數(shù)字代表標(biāo)準(zhǔn)差; **代表JA處理植株雄穗結(jié)實(shí)數(shù)量與未處理植株和0.05%乙醇處理植株雄穗結(jié)實(shí)數(shù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有極顯著差異(< 0.01)。

A: untreatedtassel phenotype; B: 0.05% ethanol-treatedtassel phenotype; C: JA-treatedtassel phenotype; D: number of tassel seeds permutant. The numbers on top of the column represent the standard deviation. ** indicates extremely significant difference of tassel seeds number between JA-treatedand untreated and 0.05% ethanol-treatedplants (< 0.01).

2.6 ts2基因表達(dá)分析

基因表達(dá)水平是一個(gè)基因在特定組織中功能重要與否的重要評(píng)判依據(jù)。提取F2群體中突變體和野生型植株各組織總RNA, 對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行定量分析(圖8)。發(fā)現(xiàn)基因在玉米雄穗中表達(dá)量最高, 雌穗和葉片中次之, 而在根、莖、花絲中的表達(dá)水平較低, 在授粉后20 d的胚乳和胚中沒有檢測到表達(dá), 由此可知基因主要在玉米雄穗中發(fā)揮重要作用。同時(shí)在突變體中,基因突變后, 其表達(dá)在未成熟雄穗和雌穗中極顯著降低, 從而可能導(dǎo)致雄穗中的雌蕊不能正常敗育, 最終產(chǎn)生tasselseed的表型。

3 討論

玉米雄穗和雌穗發(fā)育與玉米產(chǎn)量密切相關(guān)。玉米雄穗小花中的雌蕊、雌穗小花中的雄蕊的選擇性敗育產(chǎn)生了單性花, 這一過程是多個(gè)基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及遺傳位點(diǎn)控制的。目前, 已有多個(gè)控制玉米性別的遺傳位點(diǎn)被鑒定[25-26]。我們通過化學(xué)誘變獲得了一個(gè)tasselseed表型突變體, 利用圖位克隆的方法分離目標(biāo)基因, 發(fā)現(xiàn)已知基因可能就是導(dǎo)致突變表型的原因?？寺》治龌虬l(fā)現(xiàn), 其編碼蛋白保守結(jié)構(gòu)域中發(fā)生了氨基酸的替換。等位性測驗(yàn)結(jié)果表明突變表型是已報(bào)道的性別決定基因的突變引起的(圖7-A)。外源施加茉莉酸處理后, 性別明顯得到恢復(fù); 楊松青等[27]研究也揭示了表達(dá)受到JA的誘導(dǎo), 進(jìn)一步證實(shí)了是一個(gè)典型的依賴于JA的性別決定基因。

圖8 Ts2基因表達(dá)分析

Root: 根; Stem: 莖; Leaf: 葉; Silk: 花絲; Immature ear: 雌穗; Immature tassel: 雄穗; Embryo: 授粉后20 d胚; Endosperm: 授粉后20 d胚乳。

**代表在特定組織中基因表達(dá)與野生型相比在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有極顯著差異(< 0.01)。

** indicates extremely significant difference of expression in specific tissues betweenand WT (< 0.01).

基因編碼一個(gè)短鏈乙醇脫氫酶。短鏈乙醇脫氫酶超家族蛋白是一類與系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)的酶, 催化作用于多種底物, 如糖、類固醇、前列腺素、芳香烴、抗生素和參與氮代謝的化合物[28]。短鏈乙醇脫氫酶超家族蛋白具有一個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域A, 它可以與NAD(P)輔助因子結(jié)合[29]。通過比較高粱、小米、水稻、二穗短柄草、擬南芥的Ts2直系同源蛋白及小鼠[30]、人類[31]、黃桿菌[32]、假單胞菌[33]和大腸肝菌[34]短鏈乙醇脫氫酶發(fā)現(xiàn), 在其保守結(jié)構(gòu)域A中具有典型的短鏈脫氫酶基序特征“TGxxxGhG”(附圖1), 該基序在與輔酶結(jié)合過程中具有重要作用[35-36]。在突變體中, Ts2蛋白的第66個(gè)氨基酸, 也即基序TGxxxGhG中的第2個(gè)G (甘氨酸)被替換為R (精氨酸), 可能導(dǎo)致Ts2無法與輔酶穩(wěn)定結(jié)合, Ts2蛋白復(fù)合體催化效率降低。突變體雄穗主穗及側(cè)枝頂端部分雄蕊可正常發(fā)育, 產(chǎn)生有功能的花粉, 可自交獲得純合的突變體后代。然而突變表型為雄穗小穗完全雌性化, 僅能產(chǎn)生雌性的單性花, 而且雌性化的小穗均能產(chǎn)生正常功能的雌配子[5]。由于突變體是由Ac轉(zhuǎn)座子插入引起的, 導(dǎo)致基因功能完全喪失; 而突變體則是EMS誘變導(dǎo)致基因CDS序列發(fā)生單核苷酸突變, 除了該基因編碼蛋白第66個(gè)氨基酸發(fā)生了替換外, 其他氨基酸序列與野生型一致。因此, 我們推測突變體中, 單個(gè)氨基酸的替換雖然導(dǎo)致Ts2蛋白不能與輔酶穩(wěn)定結(jié)合, 催化效率降低, 但仍能發(fā)揮部分功能, 致使部分小穗可正常散粉。與突變體測驗(yàn)后代與一樣可產(chǎn)生有功能的花粉, 進(jìn)一步印證了這一論斷。但同時(shí)我們也注意到在突變體中,基因在雄穗和雌穗中的表達(dá)水平與正常植株相比, 顯著降低(圖8), 這一因素可能也是造成性別決定發(fā)生反轉(zhuǎn)的原因之一。通過對(duì)基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游包括啟動(dòng)子區(qū)域的3 kb序列進(jìn)行測序分析, 沒有發(fā)現(xiàn)堿基的突變, 因此推測表達(dá)水平的改變可能是因單位點(diǎn)突變后造成mRNA不穩(wěn)定, 也可能是基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)反饋抑制的結(jié)果。

玉米性別決定過程中, 雌蕊的敗育依賴于植物激素茉莉酸調(diào)節(jié)的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。外源施加茉莉酸可恢復(fù)、和突變體表型[4,8], 因此這3個(gè)基因均參與了茉莉酸的合成和代謝。、雙突變體和、雙突變體表型分析表明和與均呈上位性效應(yīng)[37], 而mRNA在雌蕊中的積累依賴于的生物學(xué)功能[6], 因此位于茉莉酸代謝合成基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的下游節(jié)點(diǎn)。Wu等[7]在大腸桿菌中制備了TS2重組蛋白, 發(fā)現(xiàn)TS2以四聚體形式發(fā)揮功能, 起3β-或17β-羥基類固醇脫氫酶或羰基/醌還原酶的作用。然而其在玉米性別決定過程中發(fā)揮重要功能的具體作用機(jī)制依然不是十分清楚。我們新發(fā)現(xiàn)的等位突變體豐富了與玉米性別決定研究材料, 為進(jìn)一步解析基因在玉米性別決定過程中的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

通過EMS誘變, 新發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與玉米性別決定相關(guān)的突變體。被定位于玉米1號(hào)染色體1.04 bin 290 kb的物理區(qū)間。基因CDS中的第196個(gè)堿基鳥嘌呤被替換為腺嘌呤, 導(dǎo)致該位點(diǎn)編碼的氨基酸甘氨酸被替換為精氨酸。是的等位突變體。突變體為深入探究基因的功能提供了新的研究材料。

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Genetic analysis and molecular characterization of tasselseed mutantin maize

QIN Li-Ping**, DONG Er-Fei**, BAI Yang, ZHOU Lian, REN Lan-Yang, ZHANG Ren-Feng, LIU Chao-Xian*, and CAI Yi-Lin*

Maize Research Institute, Southwest University / Engineering Research Center of South Upland Agriculture, Ministry of Education, Chongqing 400715, China

Sex determination is closely associated with development of maize tassel and ear. Function study of the genes underlying maize sex determination is critical for elucidating its regulation network. One sex determination mutant with feminized tassel, named(), was created through B73 pollen treatment with chemical agent ethyl methyl sulfonate (EMS). The feminized tassel spikelets were observed under scanning electron microscope when the immature tassels were 13 mm long. Using map-based cloning strategy, thewas mapped to an interval about 290 kb, flanked by markers LM4 and RM5, which harbored nine annotated genes including the reported sex determination gene(). Thecoding sequence frommutant revealed the 196th base guanine was substituted by adenine, leading to the substitution of amino acids from glycine to arginine, which probably resulted in the tasselseed phenotype. An allelic test crossingwithshowed that all the F1, F2plants could produce feminized tassels with lots of silks, which indicatedwas a new allelic mutant of. The exogenous jasmonic acid (JA, 1 mmol L–1) could recover the normal phenotype of most of spikelets. The expression analysis ofin wild-type plants showed a high expression level in immature tassels, and moderate one in immature ears and leaves. However, its expression was dramatically decreased in immature tassels and ears of. The mutation in conserved region and the reduced expression ofprobably are the causes of tasselseed phenotype.

;; tasselseed; fine mapping; allelism test

附表1基因定位、候選基因克隆及表達(dá)分析引物序列

Supplementary table 1 Primer sequences formapping, candidate gene cloning and expression analysis

引物名稱Primer name正向引物序列Forward primer sequence (5′–3′)反向引物序列Reverse primer sequence (5′–3′)標(biāo)記類型Genetic marker types LM1CACAGCAAGAGTACAGCATCAGTGATCCCAGTTCTCGATGTAGCSSR LM2GGAAATGTTTGACGTGACCTGCCACTTGGCAAACCAATCCAACGSSR LM3AATAGCGTGCTCCCGTGTTATCCTGTCGTTGCTTGCTTCTTCCASSR LM4AATGGGATAAAGACCGGATTCTATAAGCGTTGTAGGACAGGAGCInDel RM1TCGGAGAGGACACGGTTTAGTACATGAACATTGGCGAAGCTACCSSR RM2GCTCCTGTGTGCAACTTGTTAGGCATATGAATCGGTGTTCGGTGSSR RM3CTGTTCCTTCGCTTTCACAGAAAGTAGCTCTCTAGTTGTGTCCCSSR RM4GCTGATTTAAGATATAAAGTGCCTCCCCCTGCTGGACCGGAGTAAAGInDel RM5AGAACGGTGATTTTTGTCTGGTGTTTTGCATGCTCATGTAGACGInDel Ts2-JDACAGCAGAGTAGAGTAGCACACGCCATGGGAATGGGATATTTGG Ts2-qPCRGTGGAGAAGATGGAGGAGGTGGTATTGATTCACAAGCCGATGAGGTT ActinTCACCCTGTGCTGCTGACCGGAACCGTGTGGCTCACACCA

附圖1 短鏈乙醇脫氫酶同源蛋白保守結(jié)構(gòu)域A序列分析

Supplementary fig. 1 Sequence analysis of conservative domain A of short-chain alcohol dehydrogenases

SbTs2: 高粱Ts2; SiTs2: 小米Ts2; OsTs2: 水稻Ts2; BdTs2: 二穗短柄草Ts2; ATSDR2: 擬南芥Ts2直系同源蛋白; BHD: 來自小鼠的短鏈乙醇脫氫酶; 17βHSD1: 來自人的短鏈乙醇脫氫酶; NACMAN: 來自黃桿菌的短鏈乙醇脫氫酶; 3βHSD: 來自假單胞菌的短鏈乙醇脫氫酶; FABG: 來自大腸桿菌的短鏈乙醇脫氫酶。

SbTs2: Ts2 ortholog from sorghum; SiTs2: Ts2 ortholog from; OsTs2: Ts2 ortholog from rice; BdTs2: Ts2 ortholog from; ATSDR2: Ts2 ortholog from; BHD: a short-chain alcohol dehydrogenase from rat; 17βHSD1: a short-chain alcohol dehydrogenase from human; NACMAN: a short-chain alcohol dehydrogenase from; 3βHSD: a short-chain alcohol dehydrogenase from; FABG: a short-chain alcohol dehydrogenase from.

10.3724/SP.J.1006.2020.93051

本研究由國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31601312)和重慶市重大科技攻關(guān)項(xiàng)目(cstc2016shms-ztzx80013, cstc2016shms-ztzx80016, cstc2016shms- ztzx80017)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31601312) and the Major Project of Chongqing for Science and Technology (cstc2016shms-ztzx80013, cstc2016shms-ztzx80016, cstc2016shms-ztzx80017).

蔡一林, E-mail: caiyilin1789@163.com; 劉朝顯, E-mail: cauxian@163.com

秦利萍, E-mail: 919494709@qq.com

2019-09-16;

2020-01-15;

2020-01-23.

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20200123.1244.004.html