趙晉鋒 杜艷偉 王高鴻 李顏方 趙根有 王振華 王玉文 余愛麗

谷子PEPC基因的鑒定及其對非生物逆境的響應特性

趙晉鋒**杜艷偉**王高鴻 李顏方 趙根有 王振華 王玉文 余愛麗*

山西省農(nóng)業(yè)科學院谷子研究所/ 特色雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與育種山西省重點實驗室, 山西長治 046011

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC)是C4植物光合作用關鍵酶, 并在植物多種代謝途徑及逆境信號應答過程中起重要作用。本研究通過序列比對, 從谷子基因組中篩選出6個候選基因。SiPEPC蛋白特征參數(shù)相似度很高, 序列非常保守, 都含有PEPC基因特征功能域PEPcase Motif。SiPEPC成員主要被定位在細胞質(zhì)、細胞核和線粒體。在SiPEPC成員啟動子序列中含大量有光、激素、逆境以及其他生長調(diào)控相關的順式應答元件。苗期逆境qRT-PCR表達譜分析表明, 5個基因()不同程度受ABA、PEG、高鹽和低溫誘導表達, 表明其參與了苗期對非生物逆境的響應。5個基因表達量在正常生長條件下隨著谷子的生長呈增強趨勢, 且在不同生育時期干旱脅迫下明顯增加, 表明其參與了拔節(jié)、抽穗、灌漿期的干旱脅迫應答。拔節(jié)期弱光可誘導5個基因的表達, 而在拔節(jié)期中等強度光照以及抽穗期和灌漿期的中等光照和弱光照下表達量均急劇降低, 揭示光照強度嚴重影響基因的表達。

谷子; 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶; 非生物逆境; 表達分析

谷子[(L.) P. Beauv.]是C4禾本科重要糧食作物和飼草作物, 起源于我國, 在全球一些溫帶、亞熱帶和熱帶的干旱和半干旱地區(qū)廣泛種植, 具有抗旱、耐瘠、適應性廣等特點[22-24]。谷子在生長過程中會經(jīng)常遇到干旱、鹽漬、低溫、高溫、洪澇以及病蟲害侵染等, 這些逆境嚴重影響了谷子的生長發(fā)育和產(chǎn)量品質(zhì)[25]。2012年谷子基因組測序已完成并公布, 為開展谷子抗逆分子生物學研究提供了極為便利的條件[26-27]。迄今為止PEPC研究主要聚焦在C4型PEPC基因在提高C3植物光合作用和耐脅迫應答領域, 在C4作物玉米、高粱中研究較多, 但是在C4作物谷子中PEPC基因非生物逆境相關研究鮮有報道。本研究檢索了谷子中的PEPC基因家族成員, 并對其氨基酸序列、蛋白特征、功能、亞細胞定位、啟動子區(qū)域順式應答元件等參數(shù)特征分析和預測, 隨后檢測了家族基因在幼苗期逆境脅迫下的動態(tài)表達模式及在拔節(jié)、抽穗、灌漿3個生育時期干旱脅迫和不同光照處理下的表達情況, 旨在為進一步分析PEPC基因在谷子逆境應答信號途徑中的功能和機制以及為利用基因工程方法改善作物光合速率和提高產(chǎn)量提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用谷子品種‘豫谷1號’, 種子保存于山西省農(nóng)業(yè)科學院谷子研究所生物技術課題。在組培室中培養(yǎng)谷子幼苗, 溫度為(22±2)℃, 濕度為60%, 光照周期為16 h光照/8 h黑暗。

1.2 試驗設計

待組培室幼苗長至三葉一心期時, 分別對其進行20% PEG-6000模擬干旱、鹽(250 mmol L–1NaCl)、ABA (100 μmol L–1)和低溫(4℃)脅迫處理, 苗期逆境表達譜分析取樣時間點為處理后0、1、3、6、12和24 h, 整株取樣[28]。旱棚種植‘豫谷1號’, 對照處理生育期內(nèi)正常澆水; 干旱處理只澆3次關鍵水, 分別為拔節(jié)(6月20日)、抽穗(8月5日)和灌漿期(8月30日)澆透水, 其他時間采用自然控水方式控水。光照處理為當植株出苗后用黑色遮陽網(wǎng)分別遮擋1層(中等光照, 拔節(jié)期、抽穗期、灌漿期測量光照強度分別為221.8、411.6、164.6 μmol m-2s-1), 2層(弱光照, 拔節(jié)期、抽穗期、灌漿期測量光照強度分別為52.1、95.8、58.8 μmol m-2s-1)至成熟收獲。光照強度用標智光強測定儀(GM1040)于晴天上午9:00—10:00測量10次數(shù)值, 取平均值。干旱處理試驗與光照處理試驗為同一對照。對照、中等光照處理和弱光照處理生育期內(nèi)正常澆水, 其他農(nóng)田管理措施相同。分別在拔節(jié)、抽穗、灌漿期時取旱棚干旱處理與光照強度處理材料和對照旗葉葉片, 立即在-80℃冰箱中速凍備用。

1.3 谷子PEPC基因的鑒定及基因結構、蛋白序列分析

在Phytozome數(shù)據(jù)庫中以擬南芥和玉米的已知PEPC氨基酸序列為遞交序列, 進行BlastP比對, 搜索具有完整閱讀框的谷子同源序列, 獲得谷子候選PEPC基因?；騾?shù)和蛋白序列來源于Phytozome數(shù)據(jù)庫。利用ExPASy網(wǎng)站在線工具預測蛋白分子量和等電點。利用PLACE在線軟件對基因啟動子區(qū)域順式元件進行分析, 采用GSDS軟件繪制基因結構圖, 用在線工具CELLO v.2.5進行亞細胞定位預測, 預測置信度計算參考Yu等[29]描述方法。使用Blast工具在NCBI上查找不同物種氨基酸同源性序列, 用ClustalX1.83軟件分析比對基因序列[30], 用Mega6.0軟件鄰接法構建不同物種N-J系統(tǒng)進化樹[31]。

1.4 總RNA提取、cDNA合成及引物設計

按照說明書, 使用生工TRIzol試劑盒提取植物總RNA; 使用生工第1鏈cDNA合成試劑盒合成cDNA。所用引物由Primer Primer 5.0設計, 引物信息見表1。

1.5 Real-time PCR分析

樣品cDNA均一化后作為實時定量PCR模板, 以谷子基因(Seita.7G294000)作為內(nèi)參基因。反應體系為20 μL, 包含10 μL 2′熒光染料混合液、0.4 μL正向引物(10 μmol L–1)、0.4 μL反向引物(10 μmol L–1)、2 μL cDNA模板、7.2 μL無菌水。經(jīng)預試驗優(yōu)化后PCR程序為95℃ 3 min; 95℃ 7 s, 57℃ 10 s, 72℃ 15 s, 45個循環(huán)。試驗設計3次重復, 采用相對定量2–ΔΔCt方法計算基因在某種逆境處理下某個時間點相對于對照的轉(zhuǎn)錄水平變化[32]。SiPEPC成員在苗期不同逆境、不同生育期干旱和不同光照下Real-time PCR 表達分析結果利用百邁克云平臺在線工具聚類熱圖繪制(Pretty Heatmaps)熱圖, 參數(shù)默認。

表1 本試驗所用引物

2 結果與分析

2.1 谷子PEPC基因成員鑒定與參數(shù)分析

通過序列比對和分析, 從谷子中篩選出6個候選基因成員(表2)。根據(jù)基因定位在染色體1~9號上的先后位置順序分別命名為。6個基因不均分布在1號、2號、4號、5號染色體上, 其中分別分布于1號、2號、4號染色體上, 而全部位于5號染色體上?；蛴?種轉(zhuǎn)錄方式, 其他5個基因只有1種轉(zhuǎn)錄方式。功能域分析發(fā)現(xiàn), 所有基因都含有PEPC基因特征功能域PEPcase, 功能域在基因中的詳細位置見表2。候選SiPEPC蛋白參數(shù)分析表明, SiPEPC成員之間基因組長度變化明顯, 在4676~8603 bp之間, 編碼氨基酸數(shù)目在964~1032之間。成員間分子量范圍在109.82~114.89 kD之間, 蛋白等電點范圍在5.70~7.14之間, 不穩(wěn)定指數(shù)范圍在44.10~52.09之間, 脂肪系數(shù)范圍在85.81~93.87之間, 平均疏水指數(shù)范圍在-0.418~-0.277之間。GSDS在線軟件分析SiPEPC成員基因結構發(fā)現(xiàn),分別含9、9、8、6、9個內(nèi)含子, 而含20個內(nèi)含子(圖1)。

圖1 SiPEPC成員的基因結構

Fig. 1 Gene structure of SiPEPC genes

2.2 SiPEPC蛋白亞細胞定位預測和啟動子區(qū)域順式元件分析

采用Psort在線工具對谷子SiPEPC家族成員的亞細胞定位預測表明, SiPEPC成員主要被定位在細胞質(zhì)、細胞核和線粒體(表3)。利用PLACE在線軟件對SiPEPC成員啟動子順式元件分析(表4), SiPEPC成員啟動子區(qū)域主要包括大量的光應答元件、激素類應答元件(脫落酸、赤霉素、水楊酸、乙烯、茉莉酸甲酯、生長素)、逆境應答元件(逆境防御、低溫、干旱、傷害)以及其他生長調(diào)控相關順式元件, 包括缺氧特異性誘導、厭氧誘導必需、分生組織特異性表達、玉米蛋白代謝調(diào)控、種子特異性調(diào)控、晝夜節(jié)律元件等。

表3 SiPEPC蛋白亞細胞定位預測

表4 SiPEPC基因啟動子區(qū)域順式元件預測

(續(xù)表4)

2.3 PEPC序列比對及進化分析

谷子PEPC成員氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)成員之間序列非常保守, 相似性較高, 其序列一致性為67.71%。所有成員都含有PEPC蛋白特征功能域PEPcase, 其中SiPEPC1、SiPEPC2、SiPEPC3、SiPEPC5、SiPEPC6序列相似性較高, 整體序列一致性為74.03%, 而SiPEPC4在特征功能域內(nèi)由于有幾個片段的插入和缺失, 因此與其他幾個SiPEPC序列一致性較低, 在32.92%~ 34.06%之間。為進一步了解谷子SiPEPC進化關系, 推測其生物功能, 在NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索了不同物種已知PEPC基因。序列比對發(fā)現(xiàn)所有物種PEPC整體一致性非常高, 為72.88%, 說明PEPC基因在進化過程中非常保守。利用 MEGA6.0 軟件構建了谷子和不同物種PEPC蛋白成員的Neighbor-Joining進化樹(圖3)。

從圖3可以看出, 谷子的基因與高粱、玉米基因聚合在一起, 揭示谷子與高粱、玉米親緣關系較近(同屬禾本科C4作物), 另一方面也暗示它們在某些功能上可能具有相似性。玉米、高粱、谷子的PEPC成員與擬南芥、馬鈴薯、花生、蓖麻、煙草PEPC成員相互嵌合在一起, 表明PEPC基因在單、雙子葉植物分化以前就已經(jīng)存在。另外發(fā)現(xiàn)一些同源基因?qū)? 例如和、和、和、和和和, 這些相同或不同物種的PEPC基因聚在一起表明, 它們可能由共同祖先進化而來, 而且具有類似的生物功能。

2.4 SiPEPC家族基因苗期非生物逆境脅迫下表達分析

由圖4可知, 谷子三葉一心期幼苗在4種脅迫處理下, 除由于表達量低未檢測到信號外, 其他5個基因在不同時間點表達水平變化趨勢不完全相同。在ABA脅迫處理下所有時間點表達量均下調(diào), 其他基因表達量在4種脅迫處理過程中至少1個時間點有所上調(diào)。在ABA-12 h、Cold-24 h、PEG-12 h、NaCl-12 h時其相對表達量達最高, 分別為對照的8.20、9.70、4.85、9.93倍;在ABA-12 h、Cold-24 h、PEG-6 h、NaCl-6 h時其相對表達量達最高, 分別為對照的4.81、8.77、5.69、21.38倍;在ABA-6 h、Cold-24 h、PEG-24 h、NaCl-6 h時其相對表達量達最高, 分別為對照的13.91、1.34、3.55、3.22倍;在ABA-6 h、Cold-24 h、PEG-24 h、NaCl-12 h時其相對表達量達最高, 分別為對照的16.00、31.70、4.31、9.24倍; 而在ABA-12 h、Cold-24 h、PEG-12 h、NaCl-12 h時其相對表達量達最高, 分別為對照的0.93、5.19、3.53、15.68倍。試驗表明5個基因都參與了苗期谷子對逆境脅迫的響應。

2.5 不同生育期干旱脅迫及不同光照強度下表達分析

為進一步了解PEPC基因在谷子不同生育期干旱脅迫下的表達情況, 本研究檢測了它們在3個關鍵生育時期(拔節(jié)期、抽穗期和灌漿期)干旱脅迫及不同光照強度下的表達情況。由圖5可知,在正常抽穗期、灌漿期表達量與拔節(jié)期相比均有明顯提升, 而在抽穗期表達量下降, 在灌漿期表達量較拔節(jié)期有明顯提升。干旱脅迫下,在抽穗期、灌漿期表達量與拔節(jié)期相比均也有明顯提升,在灌漿期、抽穗期表達量與拔節(jié)期相比呈現(xiàn)先升后降趨勢, 而呈現(xiàn)先降后升趨勢。表明大部分SiPEPC基因在正常生長條件下其表達隨谷子生長發(fā)育進程呈現(xiàn)增強趨勢, 在不同生育期干旱脅迫下其表達量趨勢都有明顯增加, 揭示這5個基因在關鍵生育時期都參與了對干旱脅迫的響應。

圖2 PEPC家族蛋白序列的氨基酸序列多重比對

AtPEPC1、AtPEPC2、AtPEPC3: 擬南芥AtPEPC1、AtPEPC2、AtPEPC3; SbPEPC1、SbPEPC2、SbPEPC3: 高粱SbPEPC1、SbPEPC2、SbPEPC3; GmPEPC: 大豆GmPEPC; ZmPEPC1、ZmPEPC2: 玉米ZmPEPC1、ZmPEPC2; StPEPC: 馬鈴薯StPEPC; AhPEPC: 花生AhPEPC; RcPEPC: 蓖麻RcPEPC; NtPEPC: 煙草 NtPEPC。對應GenBank蛋白序列號分別為Q9MAH0.1、Q5GM68.2、Q84VW9.2、P29195.1、P29194.1、P15804.2、P51061.1、P04711.2、P51059.1、P29196.2、ABY87944.1、ABR29878.1、P27154.1。相同氨基酸殘基用黑色表示, 相似氨基酸殘基用灰色表示(相似性≥ 60%)。

AtPEPC1, AtPEPC2, AtPEPC3:AtPEPC1, AtPEPC2, AtPEPC3; SbPEPC1, SbPEPC2, SbPEPC3:SbPEPC1, SbPEPC2, SbPEPC3; GmPEPC:GmPEPC; ZmPEPC1, ZmPEPC2:ZmPEPC1, 2; StPEPC:StPEPC; AhPEPC:AhPEPC; RcPEPC:RcPEPC; NtPEPC:NtPEPC. The corresponding GenBank protein numbers are Q9MAH0.1, Q5GM68.2, Q84VW9.2, P29195.1, P29194.1, P15804.2, P51061.1, P04711.2, P51059.1, P29196.2, ABY87944.1, ABR29878.1, and P27154.1, respectively. The amino acids with an entire homology are shown by a black background, and those shared non-identical conserved identity by a graybackground (≥ 60% similarity).

由圖6可知, 所有基因熱圖顏色從J-1期(拔節(jié)期對照)偏黑紅色向在J-2期(拔節(jié)期干旱)的鮮紅色轉(zhuǎn)變, 即所有基因在J-2期表達量與J-1期相比均有所提高, 也就是說拔節(jié)期干旱誘導了所有基因的表達。但在J-3期(拔節(jié)期中等光照)條件下所有基因表達量全部下降, 而在J-4期(拔節(jié)期弱光照)所有基因表達量又全部上升。試驗結果說明拔節(jié)期光照強度影響基因表達, 弱光條件能誘導基因在拔節(jié)期的表達。與拔節(jié)期相似, 在H-2期(抽穗期干旱)所有基因表達量較對照H-1期(抽穗期對照)均有明顯提高, 但在H-3 (抽穗期中等光照)和H-4 (抽穗期弱光照)條件下所有基因表達量都是下降的。說明抽穗期干旱誘導了所有基因的表達, 抽穗期中等、弱光照抑制基因的表達。在灌漿期的各個處理下(F-1、F-2、F-3、F-4), 除了在F-2期(灌漿期)干旱表達量提升外, 其他所有基因在各處理下表達量均呈下降趨勢。說明灌漿期大部分基因在干旱、中等和弱光照處理下表達量下降, 揭示基因在灌漿期可能對干旱、中等光照以及弱光照響應較弱。

圖3 不同物種PEPC蛋白的進化關系

圖4 SiPEPC基因苗期逆境表達譜

圖中淺綠、深綠、黑色、淺紅、深紅5種顏色代表基因表達水平。綠色表示基因表達弱, 紅色表示基因表達強。

Light green, dark green, black, light red and dark red are used to represent gene expression levels. Green indicates weak gene expression; red indicates strong gene expression.

(圖5)

圖5 正常和干旱條件下SiPEPC基因在不同發(fā)育階段的相對表達量

*表示在0.05水平上顯著; **表示在0.01水平上顯著。

* Significantly different at＜0.05; ** Significantly different at＜0.01.

圖6 光照和干旱條件下SiPEPC的相對表達量

圖中淺綠、深綠、黑色、淺紅、深紅五色代表基因表達水平。綠色表示基因表達弱, 紅色表示基因表達強。J-1: 拔節(jié)期對照; J-2: 拔節(jié)期干旱; J-3: 拔節(jié)期中等光照; J-4: 拔節(jié)期弱光照; H-1: 抽穗期對照; H-2: 抽穗期干旱; H-3: 抽穗期中等光照; H-4: 抽穗期弱光照; F-1: 灌漿期對照; F-2: 灌漿期干旱; F-3: 灌漿期中等光照; F-4: 灌漿期弱光照。

Light green, dark green, black, light red, and dark red are used to represent gene expression levels. Green indicates weak gene expression; red indicates strong gene expression. J-1: control at jointing stage; J-2: drought at jointing stage; J-3: medium light intensity at jointing stage; J-4: weak light intensity at jointing stage; H-1: control at heading stage; H-2: drought at heading stage; H-3: medium light intensity at heading stage; H-4: weak light intensity at heading stage; F-1: drought at filling stage; F-2: drought at filling stage; F-3: medium light intensity at filling stage; F-4: weak light intensity at filling stage.

3 討論

本研究在谷子基因組中檢索得到6個基因, 序列比對顯示, 谷子PEPC基因序列相似性很高, 揭示它們在進化上非常保守。系統(tǒng)進化樹(圖3)表明, 在單、雙子葉植物分離以前PEPC基因就已經(jīng)存在。進化樹中谷子成員多與高粱、玉米成員緊密嵌合在一起, 而與擬南芥、馬鈴薯、花生、蓖麻、煙草成員相對較遠, 揭示了谷子與高粱、玉米親緣關系相對較近, 而與而與擬南芥、馬鈴薯、花生、蓖麻、煙草親緣關系相對較遠。值得一提的是,基因由于在進化過程中存在一些片段的插入和缺失, 而且在基因組成上含有20個內(nèi)含子, 遠比其他基因內(nèi)含子數(shù)目多, 因此推測在功能上可能與其他基因有所不同。隨后的表達分析也證明了這一點, 在所有表達譜分析中都檢測不到基因的表達, 說明與其他基因在功能上有明顯不同, 可能參與了谷子生長與發(fā)育中的其他信號途徑。另外在進化樹中發(fā)現(xiàn)一些同源基因?qū)? 揭示這些同源基因?qū)赡苡晒餐嫦冗M化而來, 另一方面也暗示它們在某些信號通路中可能具有相似的功能。

隨后本研究對谷子6個基因生物信息學特征進行了系統(tǒng)的預測和分析, 期望能夠發(fā)現(xiàn)對于功能研究有幫助信息。預測結果顯示,成員很多性狀和參數(shù)非常接近類似, 比如亞細胞定位分析成員都主要被定位在細胞質(zhì)、細胞核和線粒體, 這些位置都是植物光合作用的關鍵位置, 揭示了基因可能在植物光合作用信號途徑中起比較重要作用。這些結論不僅驗證了它們同屬PEPC基因家族, 而且預示不同基因可能共同參與或調(diào)控某些信號途徑。順式元件分析表明, 在啟動子區(qū)域含有ABA、低溫、干旱和防御應激反應等順式元件。一般來講如果基因啟動子區(qū)域存在某種順式元件則暗示該基因很可能參與相應的信號途徑[33]。研究表明在非生物逆境, 比如干旱、鹽、低溫、高溫以及傷害等脅迫下會導致植物細胞內(nèi)的ABA水平升高, 而且眾所周知, ABA是在非生物逆境應答中起重要作用的激素[34-36]。因此我們推測谷子家族基因很可能參與植物對非生物逆境脅迫的響應。

Real-time PCR檢測結果表明, 5個谷子基因在4種處理下其表達量有顯著變化, 除了幾乎所有基因表達量在4種脅迫處理過程中至少1個時間點均有所上調(diào)。試驗結果表明, 谷子家族基因廣泛參與了植物苗期非生物逆境脅迫應答。本研究結果同已有關于PEPC在逆境應答方面研究結果是相一致的[19-21]。為了進一步了解在不同關鍵生育期干旱脅迫下的表達情況, 本研究檢測了成員在關鍵生育期(拔節(jié)期、抽穗期和灌漿期)干旱脅迫及不同光照強度(中等光照強度Ⅰ和弱光照強度Ⅱ)下的表達情況。如圖5所示, 試驗結果表明基因成員不同處理下表達情況各有特點。例如在正常條件下在抽穗期、灌漿期表達量較拔節(jié)期均有明顯提升, 而在抽穗期表達下降, 在灌漿期表達明顯提升。在干旱脅迫下抽穗期、灌漿期表達較拔節(jié)期也有明顯提升,在灌漿期、抽穗期表達量呈現(xiàn)先升后降趨勢, 而呈現(xiàn)先降后升趨勢。結果揭示基因在正常生長條件下隨著谷子生長發(fā)育進程其表達趨勢增強, 在不同生育期干旱脅迫下其表達量趨勢都明顯增加, 表明5個基因在不同生育期都參與了對干旱脅迫下的響應。不同生育期干旱、不同光照處理下表達分析(圖6)表明, 所有基因在J-2期(拔節(jié)期干旱)表達量提高, 但在J-3期(拔節(jié)期中等光照)全部下降, 而在J-4期(拔節(jié)期弱光照)又全部上升。在H-2期(抽穗期干旱)所有基因表達量均有明顯提高, 但在H-3 (抽穗期中等光照) H-4 (抽穗期弱光照)條件下都是下降的。在灌漿期的各個處理下(F-1、F-2、F-3、F-4), 只有在F-2期(灌漿期)干旱表達量提升, 其他所有基因在各處理下表達量均呈下降趨勢。試驗結果說明拔節(jié)期干旱和弱光條件能誘導基因的表達, 抽穗期干旱誘導了所有基因的表達, 灌漿期大部分基因在干旱、中等和弱光照處理下表達量下降,基因參與了拔節(jié)期和抽穗期的干旱脅迫響應, 不同光照強度影響基因在不同生育期的表達, 弱光可誘導基因在拔節(jié)期的表達。光強對PEPC有調(diào)節(jié)作用, 穗期玉米遮陰后其葉片的PEPC活性顯著降低, 且隨光照強度的減弱而加劇, 穗期遮陰結束后PEPC活性能恢復到對照水平[37]。本研究結果只表明弱光可誘導基因在拔節(jié)期的表達, 未出現(xiàn)隨光照強度的減弱而誘導加劇情況, 而在谷子抽穗期和灌漿期大部分基因沒有檢測到弱光能誘導PEPC表達的現(xiàn)象。這可能是谷子與玉米物種差別或是PEPC基因在不同生育期功能差別造成, 需要我們下一步詳盡的試驗驗證, 但是這些結果進一步驗證了順式元件分析結果, 證明了基因在植物逆境應答中起一定作用。順式元件分析還顯示在基因啟動子區(qū)域存在茉莉酸甲酯、水楊酸、赤霉素順式原件。研究表明病原體感染通常導致細胞中茉莉酸甲酯、水楊酸、乙烯等激素水平的增加[38], 因此推斷基因可能在生物應激反應中起一些作用。此外還發(fā)現(xiàn)了缺氧特異性誘導(GC-motif)、分生組織表達(CAT-box)、厭氧誘導必需(ARE)、玉米醇溶蛋白代謝調(diào)控(O2-site)、種子特異性調(diào)控(RY-element)、晝夜節(jié)律(circadian)等核心元件, 這些順式元件的存在暗示PEPC可能參與相應的生理生化過程。需要注意的是在啟動子區(qū)域還發(fā)現(xiàn)了大量的光應答元件, 眾所周知谷子是光溫敏感性作物, 而且PEPC是光合作用中的關鍵酶, 預示可能參與調(diào)控谷子的光溫應答調(diào)控并在其中起重要作用。

本文報道的谷子基因也為進一步闡明在谷子逆境應答中的功能、機制提供了試驗依據(jù)。盡管這些這些結論與推測需進一步嚴謹詳盡的試驗證明, 但是仍然為我們理解C4植物的關鍵酶PEPC在非生物逆境下的表達特征及光強對植物PEPC基因表達特性影響提供有益線索, 對深入了解C4植物光合特點對提高C3植物的光合效率和對C3植物的改造將具有一定意義。

4 結論

從谷子全基因組中鑒定出6個PEPC基因成員, 集中分布在谷子的1號、2號、4號、5號染色體上。所有蛋白序列高度保守, 都具有PEPC基因特征保守功能域PEPcase。谷子PEPC家族基因成員主要存在于細胞質(zhì)、細胞核和線粒體。家族基因廣泛參與了谷子苗期非生物逆境脅迫應答。成員參與了谷子在拔節(jié)、抽穗、灌漿期的干旱應答, 而光照強度會嚴重影響基因在不同生育期的表達。

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Identification of PEPC genes from foxtail millet and its response to abiotic stress

ZHAO Jin-Feng**, DU Yan-Wei**, WANG Gao-Hong, LI Yan-Fang, ZHAO Gen-You, WANG Zhen-Hua, WANG Yu-Wen, and YU Ai-Li*

Millet Research Institute, Shanxi Academy of Agricultural Sciences / Shanxi Key Laboratory of Genetic Resources and Breeding in Minor Crops, Changzhi 046011, Shanxi, China

Phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC) is a key enzyme in photosynthesis of C4plants and plays an important role in a variety of metabolic and stress pathways. In this study, we identified six candidate PEPC genes from foxtail millet genome via sequence alignment. The characteristic parameters of allprotein were very similar and the sequences were very conservative. Allgenes contained the PEPcase motif, which is the characteristic domain ofgene.were localized in cytoplasm, nucleus and mitochondrion. Promoter analysis identified a variety of light, hormonal, stress, and other growth-related cis-elements in the promoter sequences ofmembers. The qRT-PCR expression profiles showed that the fivegenes (,,,,) were induced by ABA, PEG, high salt and low temperature at seedling stage, indicating that fivegenes ate involved in abiotic signaling pathway at the seedling stage. The expression of fivegenes increased with the growth of foxtail millet under normal growth conditions, and increased significantly under drought stress at different growth stages, indicating that fiveare involved in drought stress response at jointing, heading and filling stages. The weak light at jointing stage could induce the expression of fivegenes, while the expression level decreased sharply under moderate light intensity at jointing stage, moderate and weak light intensity at heading and filling stages, showing that light intensity seriously affects the expression ofgenes.

foxtail millet; phosphoenolpyruvate carboxylase; abiotic stress; expression analysis

10.3724/SP.J.1006.2020.94107

本研究由山西省農(nóng)業(yè)科學院項目(YGJPY2009, YGG17021, YCX2019T05), 國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項(CARS-06-13.5-A23)和國家農(nóng)業(yè)環(huán)境數(shù)據(jù)中心觀測檢測任務(ZX03S0410)項目資助。

This study was supported by the Project Plan of Shanxi Academy of Agricultural Sciences (YGJPY2009, YGG17021, YCX2019T05), the China Agricultural Research System (CARS-06-13.5-A23), and the National Agricultural Environmental Data Center Observation and Detection Mission (ZX03S0410).

余愛麗, E-mail: yuailimail@163.com, Tel: 0355-2204195

同等貢獻(Contributed equally to this work)

趙晉鋒, E-mail: zhaojfmail@126.com, Tel: 0355-2204195

2019-07-24;

2020-01-15;

2020-02-14.

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20200214.1339.002.html