蘇鋒鋒 趙曉霞 張雪瑩 耿 暉 周滿宏 閻少琴 牛世全**

（1 西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 甘肅蘭州 730070 2 蘭州現(xiàn)代職業(yè)學(xué)院 甘肅蘭州 730300）

黃芪（Astragalus），多年生草本植物，是一種有滋補功效的傳統(tǒng)中藥；已有藥理臨床實驗報道表明，黃芪在免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗腫瘤、糖尿病等方面具有重要作用［1］。作為重要的經(jīng)濟中藥材在甘肅等省被大量種植。近年來，由于栽培、連作面積擴大，黃芪病害逐年加重，其中根腐病是影響黃芪產(chǎn)量和品質(zhì)的病害之一。目前，已有研究表明，黃芪根腐致病菌主要是鐮刀菌（Fusarium），鐮刀菌屬是半知菌類瘤座孢目最大的屬，屬于寄生或腐生生活，分布廣泛，可侵染多種植物，引起植物的根腐、莖腐等多種病害。陳垣等［2］鑒定黃芪根腐病的致病菌主要是茄腐鐮刀菌（F.solaniun）和尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）等；高芬等［3］研究表明黃芪根腐病的致病菌包括銳頂鐮刀菌（F.acuminatum）、腐皮鐮刀菌（F.solani）、尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）等。

黃芪根腐病發(fā)病過程是由根莖向下，由主根向側(cè)根蔓延。地上部分染病初期植株長勢弱，植株小，葉色轉(zhuǎn)為枯黃，嚴重時會脫落；地下部分根表面出現(xiàn)病斑且表皮粗糙，病斑發(fā)褐色且由大量的細紋組成，發(fā)病嚴重時表皮易被剝落，根系后期發(fā)黑潰爛，植株易被拔起。對病株的根部進行裝片制作觀察病根結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)病株維管束組織變褐色，有明顯被溶解的現(xiàn)象［4］。目前，對于黃芪根腐病的防治主要采用化學(xué)農(nóng)藥防治措施，隨著生態(tài)環(huán)保的發(fā)展，取而代之的是生物防治技術(shù)［5］。分離黃芪根腐病的致病菌對該病的防治具有重要意義，本研究室對此持續(xù)開展了數(shù)年的研究工作。

1 學(xué)情分析

中職教育以學(xué)生綜合能力為導(dǎo)向，采用理論與實踐相結(jié)合的教學(xué)方法，培養(yǎng)技能型人才，這種教育理念為專業(yè)實驗課的開展提供了明確的方向，同時實驗教學(xué)對學(xué)生技能的培養(yǎng)有重要意義［6］。中職院校學(xué)生基礎(chǔ)知識總體欠佳，缺乏扎實的生物學(xué)知識，但動手能力比較強，對未知的知識充滿好奇心，通過教師正確的引導(dǎo)，可使學(xué)生的學(xué)習(xí)事半功倍。學(xué)生通過微生物學(xué)實驗1 的學(xué)習(xí)，基本了解了微生物的分離與純化實驗的操作，為學(xué)習(xí)本實驗做好鋪墊。在實驗過程中，各小組成員積極參與合作，教師激發(fā)學(xué)生發(fā)散思維，引導(dǎo)學(xué)生分析實驗現(xiàn)象和結(jié)果，幫助學(xué)生形成科學(xué)思維的習(xí)慣。

2 教學(xué)目標

1）知識目標：①學(xué)生通過查閱資料，了解植物病害病原微生物的種類、特點等知識。②熟練掌握病原菌分離純化的操作步驟、關(guān)鍵環(huán)節(jié)和注意事項。③能解釋分離培養(yǎng)實驗過程中各種現(xiàn)象產(chǎn)生的原因。

2）技術(shù)和能力目標：①學(xué)會組織分離法和平板劃線法等操作。②掌握病原菌分離的原理，并能規(guī)范操作。

3）情感態(tài)度與價值觀目標：①學(xué)生通過每一步嚴格的無菌操作，形成嚴謹、科學(xué)、務(wù)實的態(tài)度和精神。②通過小組合作完成，提高與他人溝通能力、口頭表達能力及團隊協(xié)作能力。③通過討論植物病原菌分離的意義，提高生態(tài)意識，形成可持續(xù)發(fā)展觀念。

3 實驗組織安排

為保證本實驗的順利進行，在課前充分研討的基礎(chǔ)上，作出以下安排。本次實驗教學(xué)將班級學(xué)生隨機分為5 組，每組5～7 人，選出1 位組長負責(zé)小組的實驗操作、組織討論與交流；其中2 位學(xué)生準備實驗材料和儀器，2 位學(xué)生負責(zé)查閱文獻資料，1 位學(xué)生做好實驗的記錄工作；實驗操作過程需每位成員合作完成。實驗全程在教師的指導(dǎo)下，學(xué)生積極參與其中，動手操作完成實驗。

4 實驗準備

1）材料與培養(yǎng)基：染病的黃芪病株，采自當(dāng)?shù)攸S芪種植區(qū)；黃芪苗盆栽，由實驗室基地種植；馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）。

2）儀器與設(shè)備：電子天平、超凈工作臺、光學(xué)顯微鏡、全自動高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱等。

3）實驗方法：采用組織分離法、平板分離法［7］。

4）工作環(huán)境的清潔和消毒：分離培養(yǎng)在超凈工作臺中進行。先用紫外線燈照射20～30 min，之后將所需物品按次序置于工作臺上，避免工作時走動，工作人員穿滅菌后的工作服，戴口罩，并用70%酒精擦手。所有與分離材料接觸的器皿都要保持無菌，使用接種環(huán)時在酒精燈火焰上灼燒滅菌，培養(yǎng)皿、稀釋用蒸餾水需要提前進行高壓蒸汽滅菌。

5 實驗教學(xué)進程

5.1 組織分離 將染病的黃芪病株用無菌水沖洗、晾干，在病株根部的病健交界處（病原菌的生活力強、比較活躍，容易分離成功），用滅菌的小刀劃下面積為4～5 mm2的組織，用鑷子取下后先在70%的酒精中消毒5 s，后用5%的NaClO 溶液浸泡2 min，并用無菌水沖洗3 次，接種至PDA 培養(yǎng)基上，在27℃恒溫條件下持續(xù)培養(yǎng)5～7 d。

以上操作過程中，制作PDA 培養(yǎng)基、接種及從第3 天開始觀察和記錄菌落生長狀況，分別由一位學(xué)生負責(zé)。

5.2 菌種分離、純化 待菌絲長至成熟后，在超凈工作臺中酒精燈火焰旁，根據(jù)培養(yǎng)基內(nèi)菌落的顏色差異及形態(tài)特征，用接種環(huán)以無菌操作挑取不同的菌落接于PDA 培養(yǎng)基上并編號，27℃恒溫條件下培養(yǎng)5～7 d。多次重復(fù)挑取不同的菌落接種于PDA 培養(yǎng)基上，重復(fù)劃線操作。在無菌條件下鏡檢，若僅能觀察到一種分生孢子，則說明已獲得了純培養(yǎng)，否則需繼續(xù)轉(zhuǎn)至PDA 培養(yǎng)基上進行純化，直至獲得純培養(yǎng)［8］。

以上操作過程，需要每位學(xué)生參與，依次輪流接種純化，直至純化為單菌落，并從第5 天開始各自觀察和記錄培養(yǎng)基內(nèi)菌落生長狀況。

5.3 致病性檢測 根據(jù)病原菌分離、純化結(jié)果，采用黃芪苗盆栽回接實驗進行致病性檢測。選取長勢一致的健康黃芪苗，將幼苗移栽至裝有混合營養(yǎng)土的塑料小花盆中，每盆3 株，14 d 后采用離體根部接種法［7］，將分離、純化的供試菌株制成直徑4 mm 的菌餅接種于刺傷的健康黃芪根段，菌絲面貼于刺傷根部，每株分離菌株做3 次重復(fù)實驗，以僅刺傷的健康黃芪根段的幼苗為對照。光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)14 d 后，觀察病斑產(chǎn)生情況并記錄，依據(jù)柯赫法則［7］，對回接發(fā)病病斑部位重新分離、純化培養(yǎng)，觀察分離到的菌種與初接菌種是否一致，重新分離比率大于50%認為屬于致病菌［9］。

以上操作過程需要每位學(xué)生負責(zé)1～2 株菌，觀察并記錄根部產(chǎn)生病斑的情況。

5.4 病原菌初步鑒定 將分離純化的單菌落接種于PDA 培養(yǎng)基上，27℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d后，通過培養(yǎng)基內(nèi)菌落的形狀、大小、顏色、隆起及質(zhì)地等指標觀察每種真菌的形態(tài)特性，依據(jù)顯微鏡鏡檢觀察真菌菌絲、分生孢子等形態(tài)特征，并結(jié)合真菌鑒定手冊［10］等相關(guān)資料對病原菌的分離地位進行初步鑒定。

以上操作過程需要小組內(nèi)每位學(xué)生參與鑒定本組所分離出的病原菌，并且小組之間相互觀察所分離出的病原菌形態(tài)，并記錄。

5.5 組織進行實驗結(jié)果分析與討論 實驗結(jié)束后，由教師組織學(xué)生按小組進行討論。討論主要集中在2 個方面：1）黃芪根腐病病原菌的分離的意義；2）實驗中存在的問題。實驗結(jié)果不佳的小組，由小組成員共同分析討論實驗進程存在的問題，再由其他小組提出意見和建議，最終由教師總結(jié)評價實驗進行過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和注意事項。

6 實驗結(jié)果與分析討論

6.1 實驗結(jié)果 本次實驗中，有4 個組實驗結(jié)果良好，分離得到了單一的致病菌，通過回接致病性檢測，致病菌在接種14 d 后，實驗組黃芪幼苗的株高和主根長明顯小于對照組的株高和主根長，在實驗組黃芪幼苗主根上有明顯銹斑、變軟癥狀（圖1，本文附圖見封四）。對回接發(fā)病病斑部位重新分離、純化培養(yǎng)，觀察分離得到的菌種與初接菌種一致，重新分離比率為100%，初步認為該4 株菌為黃芪根腐病的致病菌，分別編號為G2、G5、G6、G9。根據(jù)菌落大小、顏色、形態(tài)，菌絲體及孢子形態(tài)等特征，可初步鑒定G2、G5、G6、G9均為鐮刀菌屬（圖2、圖3和表1），本研究結(jié)果與已報道的黃芪根腐病的病菌一致。

表1 病原菌形態(tài)特征

6.2 實驗分析與討論 對于微生物病原菌分離實驗，無菌操作是影響實驗結(jié)果的關(guān)鍵因素，一些學(xué)生對無菌操作認識不足，操作不熟練，導(dǎo)致培養(yǎng)基被雜菌污染。無菌操作是本實驗的核心，主要包括3 個方面：①無菌環(huán)境，包括無菌室和無菌柜、超凈工作臺等。②無菌器材，包括實驗過程中使用的玻璃器皿、金屬器材等的滅菌和消毒。③無菌操作技術(shù)，微生物學(xué)實驗過程中熟練地掌握各種無菌操作最為關(guān)鍵，例如實驗操作均應(yīng)在火焰旁進行，充分利用火焰周圍的高溫區(qū)（無菌區(qū)）；挑取和移接微生物純培養(yǎng)物用的接種環(huán)及接種針，使用時用火焰充分灼燒滅菌；轉(zhuǎn)移液體純培養(yǎng)物時，應(yīng)采用無菌吸管或無菌移液器等。實際上，人工創(chuàng)造的無菌環(huán)境條件只是相對而言，不可能保證環(huán)境的絕對無菌，因此，在實驗過程中為保證不被其他微生物污染，關(guān)鍵是要嚴格進行正確的無菌操作，熟練掌握各種無菌操作技術(shù)。

7 實驗教學(xué)活動總結(jié)與反思

7.1 學(xué)生收獲

1）知識方面：通過實驗，掌握了病原菌分離純化的操作步驟、關(guān)鍵環(huán)節(jié)和注意事項，并能對實驗過程中產(chǎn)生的各種現(xiàn)象作出解釋。

2）技術(shù)和能力目標方面：通過該實驗，學(xué)會了高壓蒸汽滅菌鍋、超凈工作臺等實驗儀器設(shè)備的使用，掌握了組織分離法和平板劃線法等實驗方法，并能規(guī)范地進行無菌操作。

3）情感態(tài)度價值觀方面：通過實驗操作，形成了嚴謹、科學(xué)的態(tài)度，具有了團隊協(xié)作的精神，提高了生態(tài)意識，形成可持續(xù)發(fā)展觀念。

7.2 實驗教學(xué)反思

1）明確實驗?zāi)康?，?guī)范實驗操作。明確實驗的重要意義和作用，將其與應(yīng)試教學(xué)相區(qū)別。讓學(xué)生親自動手操作，避免出現(xiàn)越俎代庖“講實驗”的現(xiàn)象，實驗課重在對實驗過程的分析與總結(jié)。教師在實驗過程中，需時刻關(guān)注學(xué)生的行為，及時點撥指導(dǎo)，規(guī)范學(xué)生實驗操作，有效管理學(xué)生，既調(diào)動學(xué)生的主動性、積極性，又能達到預(yù)期的目標，使實驗課變得更加高效，為今后的實驗操作和學(xué)習(xí)奠定良好的基礎(chǔ)。

2）激發(fā)學(xué)習(xí)興趣，培養(yǎng)學(xué)習(xí)能力。實驗過程中根據(jù)實驗?zāi)康膭?chuàng)設(shè)相關(guān)疑問，讓學(xué)生帶著疑問進行實驗，不僅增強了學(xué)生學(xué)習(xí)興趣，還使其在實驗過程中更加積極主動；學(xué)生之間進行自主交流，思維碰撞，引導(dǎo)學(xué)生深入思考，例如，“進行組織分離為什么要選擇新鮮病材并且在病健交界處取樣？”。實驗教學(xué)不能拘泥于教材內(nèi)容，要激發(fā)學(xué)生的多向思維，培養(yǎng)學(xué)生發(fā)現(xiàn)問題并解決問題的能力。

3）重視因材施教，加強小組合作。學(xué)生的學(xué)習(xí)基礎(chǔ)、學(xué)習(xí)能力、心里素質(zhì)都不同，而對于中職院校學(xué)生更是如此，為了更好地達到實驗教學(xué)目標，教師應(yīng)因材施教，明確分工，對于較為陌生的知識，應(yīng)采用更加通俗，易于理解掌握的教學(xué)實驗方式。而實驗更離不開各小組成員的協(xié)助配合，例如，“病原菌純化培養(yǎng)的實驗過程”，需要小組成員全部參與到實驗中，共同完成實驗內(nèi)容，體驗參與實驗的樂趣。