韓劍星 楊麗華 趙 華 安 穎 馬宇鋒

（山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院口腔科 山西太原 030001）

有研究表明，阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征（obstructive sleep apnea syndrome，OSAS）高度流行于各年齡段人群［1］。該疾病會(huì)因睡眠中上氣道阻塞引起呼吸暫停等病征，不僅影響人們的正常睡眠，而且可能因通氣量不足而引起或加重心血管疾病［2］，造成生命危險(xiǎn)。目前OSAS 的具體病因尚不明確，人們普遍認(rèn)為該疾病是由諸如肥胖、炎癥、氣道結(jié)構(gòu)異常、中樞及內(nèi)分泌因素等綜合因素引起的，而肥胖則被認(rèn)為是其中風(fēng)險(xiǎn)最高的因素［3］。FNDC5（fibronectin type Ⅲdomain containing 5）也稱(chēng)鳶尾素（irisin），最早由哺乳動(dòng)物基因收集（Mammalian Gene Collection，MGC）項(xiàng)目組于2002年報(bào)道［4］。2012年，Bostr?m P 等［5］首次 報(bào)道了FNDC5 與肥胖的關(guān)系。他們的研究表明，血清中的鳶尾素可通過(guò)運(yùn)動(dòng)進(jìn)行誘導(dǎo)產(chǎn)生，且血清鳶尾素水平只需輕微地升高便可增加小鼠體內(nèi)能量的消耗，調(diào)節(jié)體內(nèi)葡萄糖穩(wěn)態(tài)的平衡，改善肥胖狀況。該發(fā)現(xiàn)經(jīng)報(bào)道后受到人們的廣泛關(guān)注，許多研究者將其視為肥胖臨床治療領(lǐng)域的重大突破。

2016年，Yanli Li 等［6］報(bào)道了他們對(duì)165 名男性O(shè)SAS 患者和98 名健康男性受試者血清鳶尾素濃度進(jìn)行的橫斷面研究。結(jié)果顯示，OSAS 患者血清鳶尾素濃度明顯低于對(duì)照組，且隨著OSAS患者病情嚴(yán)重程度的增加，血清鳶尾素水平顯著降低。研究者首先認(rèn)為鳶尾素通過(guò)抑制肥胖發(fā)展，可在OSAS 發(fā)病機(jī)制中對(duì)人體產(chǎn)生保護(hù)作用，且該結(jié)論有豐富的文獻(xiàn)資料支持。其次，鳶尾素還被認(rèn)為與炎癥反應(yīng)有關(guān)，可通過(guò)降低炎癥因子，進(jìn)而抑制或恢復(fù)多種疾?。?-8］，而且與其具有高度同源性的FNDC4 同樣具有降低炎癥趨化因子的功能［9］，因此，研究者推測(cè)，鳶尾素也可通過(guò)抗炎作用參與抑制OSAS 的發(fā)生或發(fā)展。雖然該研究具有一定的局限性，但仍有理由相信，血清鳶尾素水平與OSAS的發(fā)生或發(fā)展呈負(fù)相關(guān)。

本文運(yùn)用一系列生物信息學(xué)工具和方法，對(duì)OSAS 相關(guān)因子FNDC5 的結(jié)構(gòu)、功能、蛋白相互作用等作出預(yù)測(cè)和分析，以期得到更為深入的FNDC5 的數(shù)據(jù)和結(jié)論，為將來(lái)OSAS 發(fā)病機(jī)制或治療方法等領(lǐng)域的研究提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料FNDC5基因與蛋白質(zhì)的相關(guān)數(shù)據(jù)由美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI）獲得，網(wǎng)址為https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/252995。為使結(jié)果更加準(zhǔn)確、專(zhuān)一，選取了FNDC5 蛋白的第一亞型進(jìn)行分析，本文統(tǒng)稱(chēng)為FNDC5 蛋白。該亞型在NCBI 的定義為FNDC5 protein ［Homo sapiens］，其GenBank 登錄號(hào)為AAH62297.1，網(wǎng)址為https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/AAH62297.1。

1.2 方法 FNDC5 的基本生物學(xué)信息由以下途徑獲?。篠ignalP 4.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/）分析包括分子量、氨基酸比率、不同電性氨基酸數(shù)、理論等電點(diǎn)、理論半衰期、不穩(wěn)定指數(shù)、脂肪指數(shù)等在內(nèi)的多種理化性質(zhì)；Protscale（http://web.expasy.org/protscale/）對(duì)該蛋白進(jìn)行親疏水性分析；ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）對(duì)該蛋白的信號(hào)肽結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)；TMHMM Server v.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析該蛋白是否具有跨膜結(jié)構(gòu)。

FNDC5 的組織表達(dá)特異性和亞細(xì)胞定位等由以下軟件或數(shù)據(jù)庫(kù)分析得到：NCBI 相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)中查找該蛋白的組織表達(dá)特異性；PSORT Ⅱ（https://psort.hgc.jp/form2.html）分析該蛋白的亞細(xì)胞定位。

FNDC5 的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)由以下軟件預(yù)測(cè)：NCBI 相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)分析FNDC5 的保守結(jié)構(gòu)域；SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html） 分析該蛋白的二級(jí) 結(jié) 構(gòu)；SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）分析該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

FNDC5 的翻譯后修飾情況由以下軟件預(yù)測(cè)：NetNGlyc 1.0 Sever（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/） 預(yù)測(cè)FNDC5 的N-糖基化位點(diǎn)；NetOGlyc 4.0 Server （http://www.cbs.dtu.dk/services/Net OGlyc/） 預(yù)測(cè)O-糖基化位點(diǎn)；Netphos 3.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）預(yù)測(cè)磷酸化位點(diǎn)。

FNDC5 的蛋白互作關(guān)系由STRING（http://string-db.org/）構(gòu)建并分析。設(shè)置“置信度為0.7，預(yù)測(cè)所得蛋白數(shù)不超過(guò)10 個(gè)”為條件，進(jìn)行預(yù)測(cè)，得到與FNDC5 可產(chǎn)生各類(lèi)相互作用的蛋白質(zhì)，并由STRING 對(duì)這些蛋白產(chǎn)生的相互作用進(jìn)行分析，得到KEGG 通路和GO 生物過(guò)程等分析報(bào)告，為FNDC5 的功能預(yù)測(cè)提供佐證。

2 結(jié)果

2.1 FNDC5 的基本性質(zhì) NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中，F(xiàn)NDC5基因ID 為252995，定位為1p35.1，外顯子數(shù)為7。FNDC5 蛋白的GenBank 登錄號(hào)為AAH62297.1，共有153 個(gè)氨基酸，分子式為C762H1225N213O229S9，分子量為17.32294×103。經(jīng)ProtParam 統(tǒng)計(jì)，組成該蛋白的氨基酸中谷氨酸（Glu）占比最高，為9.2%，共14 個(gè)；組氨酸（His）和酪氨酸（Tyr）占比最低，均為1.3%，分別有2 個(gè)。FNDC5 蛋白帶負(fù)電氨基酸殘基（谷氨酸、天冬氨酸）的總數(shù)為19，帶正電氨基酸殘基（賴(lài)氨酸、精氨酸）的總數(shù)同樣為19，理論等電點(diǎn)為6.74，因此該蛋白接近中性。FNDC5 蛋白的N 端氨基酸為甲硫氨酸，因此該蛋白的半衰期較長(zhǎng)，在哺乳動(dòng)物Rtc 中為30 h。FNDC5 蛋白的穩(wěn)定性較差，其不穩(wěn)定指數(shù)為50.58。此外，經(jīng)分析FNDC5蛋白的脂肪族氨基酸指數(shù)為83.46。

Protscale 對(duì)FNDC5 蛋白的親疏水性分析如圖1A 所示（見(jiàn)封四），疏水性得分最高的氨基酸殘基是位于84 位的纈氨酸殘基（Val），得分為4.022；親水性得分最高的是位于109 和111 位的脯氨酸殘基（Pro）和天冬氨酸殘基（Asn），得分均為-3.378。從圖中可觀察到，組成該蛋白的氨基酸大都分布在親水區(qū)（負(fù)值），考慮到ProtParam對(duì)FNDC5 的平均親水性數(shù)值（grand average of hydropathicity，GRAVY） 預(yù)測(cè)結(jié)果為-0.370，認(rèn)為該蛋白應(yīng)為親水性蛋白。

FNDC5 的信號(hào)肽結(jié)構(gòu)由SignalP 4.0 Server 預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖1B 所示，圖中C、S、Y 值分別反映剪切位點(diǎn)、是否為分泌蛋白及前二者的綜合分析。報(bào)告顯示，C 值最大位于17 位，為0.112；Y 值最大位于5 位，為0.120，由圖可知此處討論S 值的平均值已無(wú)意義，且可判斷該蛋白無(wú)信號(hào)肽結(jié)構(gòu)。不僅如此，SecretomeP 2.0a Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SecretomeP/）顯示該蛋白的SecP 得分（NN-得分）僅0.096695，遠(yuǎn)小于判定哺乳動(dòng)物非經(jīng)典分泌蛋白應(yīng)超過(guò)的閾值0.6，因此FNDC5 不屬于非經(jīng)典分泌蛋白。

FNDC5 蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)由TMHMM Server v.2.0 預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖1C 所示，該蛋白存在1 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（圖中紅色粗線），位于第79～97 位，1～74 位位于膜外，98～153 位位于膜內(nèi)，是一個(gè)典型的跨膜蛋白。

2.2 FNDC5 的組織表達(dá)特異性和亞細(xì)胞定位 為了找到FNDC5 的組織表達(dá)特異性相關(guān)信息，筆者查找了NCBI 的2 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)：基因庫(kù)和EST 數(shù)據(jù)庫(kù)。NCBI 基因庫(kù)對(duì)代表27 種不同組織的95 個(gè)人類(lèi)組織樣本進(jìn)行RNA-seq，以確定蛋白質(zhì)編碼基因的組織特異性，以RPKM（reads per kilobase per million mapped reads）為單位表示結(jié)果，F(xiàn)NDC5在心臟中表達(dá)量最高，達(dá)到13.532；在胰腺中表達(dá)量最低，僅為0.068；其余表達(dá)較高的組織有：肝臟（8.587），腎上腺（7.224），唾液腺（6.576），食管（5.168）等。NCBI 的EST 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)FNDC5 基因表達(dá)量以TPM（transcripts per million）表示，表達(dá)量較高的組織有：肌肉131，眼95，肺89，心臟33，腦31，前列腺31，子房19，血管19，胚胎組織18，血液8。

對(duì)FNDC5 蛋白的亞細(xì)胞定位分析結(jié)果顯示，43.5%的FNDC5 蛋白定位于線粒體，52.2%分散于其他細(xì)胞器，另外4.3%位于細(xì)胞核內(nèi)。

2.3 FNDC5 蛋白的二、三級(jí)結(jié)構(gòu) FNDC5 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)由SOPMA 預(yù)測(cè)，如圖1D 所示，二級(jí)結(jié)構(gòu)中無(wú)規(guī)卷曲（黃線）為主要結(jié)構(gòu)，占全長(zhǎng)的54.25%，α-螺旋（藍(lán)線）占24.18%，延長(zhǎng)鏈（紅線）占18.95%，β-轉(zhuǎn)角（綠線）占2.61%，預(yù)測(cè)結(jié)果顯示除此之外可能不存在其他類(lèi)型的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

為確定FNDC5 蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，通過(guò)NCBI相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)其進(jìn)行了同源比對(duì)，結(jié)果如圖2（見(jiàn)封四）所示。FNDC5 蛋白共包含2 個(gè)不同的超家族結(jié)構(gòu)域，分別為位于5～49 位的纖連蛋白3型超家族（FN3 superfamily）結(jié)構(gòu)域，以及位于76～109 位的功能尚未明確的DUF4808 超家族（DUF4808 superfamily）結(jié)構(gòu)域。

FNDC5 的三級(jí)結(jié)構(gòu)由SWISS-MODEL 預(yù)測(cè)，該軟件共匹配到與FNDC5 相關(guān)的8 個(gè)模板進(jìn)行建模，共得到1 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)模型，結(jié)構(gòu)如圖3所示，該模型的GMQE 為0.26，QMEAN 為-1.29，該蛋白不含配體，模型擬合率為100%。因此該模型應(yīng)為FNDC5 的標(biāo)準(zhǔn)三級(jí)結(jié)構(gòu)模型。

圖3 FNDC5 蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.4 FNDC5 蛋白的翻譯后修飾位點(diǎn) 經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯后形成的原始蛋白質(zhì)往往不具有生物學(xué)功能，或處于無(wú)活性狀態(tài)，它們需要經(jīng)過(guò)多種細(xì)胞器的加工和修飾，再經(jīng)生物酶的催化或變構(gòu)，才能最終發(fā)揮其應(yīng)有的生物學(xué)特性。筆者對(duì)FNDC5 的一部分翻譯后修飾位點(diǎn)作了初步的預(yù)測(cè)，包括氧和氮的糖基化位點(diǎn)、蛋白磷酸化位點(diǎn)，這些位點(diǎn)對(duì)于蛋白質(zhì)發(fā)揮自身生物學(xué)活性普遍起著十分重要的作用，預(yù)測(cè)這些位點(diǎn)的存在與否及其具體位置對(duì)于揭示蛋白質(zhì)進(jìn)一步的生物學(xué)現(xiàn)象、研發(fā)相關(guān)藥物、發(fā)掘相關(guān)通路等科研活動(dòng)均具有重要意義。

O-糖基化位點(diǎn)由NetOGlyc 4.0 Server 預(yù)測(cè)，共發(fā)現(xiàn)2 個(gè)O-糖基化位點(diǎn)，分別是位于49 位的蘇氨酸（得分0.568393）和位于58 位的絲氨酸（得分0.720518），其中58 位的絲氨酸更有可能是真正的O-糖基化位點(diǎn)。N-糖基化位點(diǎn)由NetNGlyc 1.0 Server 預(yù)測(cè)，結(jié)果僅發(fā)現(xiàn)1 個(gè)可能的N-糖基化位點(diǎn)，是位于第9 位的天冬氨酸，得分為0.5771。NetPhos 3.1 Server 預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，F(xiàn)NDC5蛋白可能的磷酸化位點(diǎn)較多，選取了可能性較大的7 個(gè)位點(diǎn)，以得分大于0.7 計(jì)，分別為：24 位的蘇 氨酸（0.744）、26 位的 酪氨 酸（0.949）、42 位的絲氨酸（0.847）、49 位的蘇氨酸（0.990）、118位的絲氨酸（0.997）、120 位的絲氨酸（0.994）和123 位的絲氨酸（0.973）。

2.5 FNDC5 蛋白的蛋白互作關(guān)系及分析 TRING對(duì)與FNDC5 可產(chǎn)生相互作用的蛋白進(jìn)行了預(yù)測(cè)，設(shè)置置信度為0.7 后，共得出7 個(gè)與FNDC5產(chǎn)生相互作用的蛋白，分別為：UCP1（得分0.916）、MSTN（得分0.833）、LEP（得分0.789）、PPARGC1A（得分0.785）、BDNF（得分0.776）、FGF21（0.736）和FNDC9（0.726）。

蛋白互作分析結(jié)果中，KEGG 通路的報(bào)告結(jié)果如表1所示，與FNDC 蛋白相關(guān)的蛋白參與的信號(hào)通路共有8 種，其中，PPARGC1A 與LEP 共同參與的信號(hào)通路有hsa04920（脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路）及hsa04152（AMPK 信號(hào)通路），這2 個(gè)信號(hào)通路與肥胖及炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展都具有重要關(guān)系。GO 生物過(guò)程分析表明，F(xiàn)NDC5 蛋白在體內(nèi)參與肌肉活性應(yīng)答及棕色脂肪細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)，與其相關(guān)的蛋白也參與多種脂肪細(xì)胞生長(zhǎng)分化、糖代謝、胰島素信號(hào)通路調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)及體內(nèi)脂質(zhì)代謝等多種生物學(xué)過(guò)程。可觀察到，F(xiàn)NDC5互作蛋白網(wǎng)絡(luò)中涉及的信號(hào)通路及生物過(guò)程，有相當(dāng)一部分均與OSAS 的病理機(jī)制有關(guān)，這為本研究及分析提供了有力的理論支持。

表1 FNDC5 蛋白網(wǎng)絡(luò)中涉及的KEGG 通路分析

3 討論

通過(guò)各種生物信息學(xué)工具的預(yù)測(cè)分析，了解到FNDC5 蛋白是一種親水的近中性不穩(wěn)定蛋白，在肌肉組織中的特異性表達(dá)較高，在細(xì)胞內(nèi)線粒體中的分布最為廣泛。FNDC5 蛋白不屬于非經(jīng)典分泌蛋白，擁有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中無(wú)規(guī)卷曲所占比例過(guò)半，三級(jí)結(jié)構(gòu)現(xiàn)已基本可確定。FNDC5 擁有屬于纖連蛋白3 型超家族和功能尚不明確的DUF4808 超家族的結(jié)構(gòu)域，蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中可看到其與肥胖及炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。經(jīng)預(yù)測(cè)，該蛋白共有2 個(gè)O-糖基化位點(diǎn)和1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，可信度較高的蛋白磷酸化位點(diǎn)在預(yù)測(cè)中共確定7 個(gè)，這些結(jié)果表明FNDC5 具有進(jìn)行進(jìn)一步結(jié)構(gòu)修飾的潛力。這些結(jié)構(gòu)修飾可能增加鳶尾素促進(jìn)脂肪代謝的能力，或降低組織對(duì)鳶尾素的耐受性，或改善血清鳶尾素的抗炎效果。雖然這些預(yù)測(cè)需要更深入的在體及體外實(shí)驗(yàn)才能驗(yàn)證，但本研究結(jié)果將為今后類(lèi)似的研究及討論提供重要的有關(guān)鳶尾素結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、功能方面的理論依據(jù)。

在KEGG 通路分析所提到的信號(hào)通路中，脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路及AMPK 信號(hào)通路被認(rèn)為是與OSAS 密切相關(guān)的。由脂肪組織分泌的例如白介素-6、8、10 及TGF-β 等因子，不僅可通過(guò)誘導(dǎo)增加葡萄糖的攝取而促進(jìn)肥胖的發(fā)生［10］，還與炎癥反應(yīng)有關(guān)［11］，而脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路就是這些生物學(xué)過(guò)程發(fā)生的必要條件。AMPK 在能量代謝中意義重大，研究表明該通路可抑制脂肪組織中線粒體的形成，進(jìn)而控制脂肪組織的生長(zhǎng)［12］。此外，這2 條通路并不是相互獨(dú)立的，研究表明脂肪細(xì)胞因子可介導(dǎo)AMPK 信號(hào)通路［13-14］，因此，這2 條信號(hào)通路參與的生物學(xué)過(guò)程及發(fā)揮的生物學(xué)作用可能是相互交叉的。值得注意的是，在與FNDC5 產(chǎn)生相互作用關(guān)系的7 個(gè)蛋白中，LEP 與PPARGC1A 都同時(shí)參與了上述2 個(gè)信號(hào)通路。LEP 也稱(chēng)瘦素，血清瘦素蛋白可與大腦中的相關(guān)受體結(jié)合并參與相關(guān)信號(hào)通路，抑制攝食并促進(jìn)能量消耗。瘦素還具有內(nèi)分泌功能，參與免疫和炎癥反應(yīng)。PPARGC1A 是一種轉(zhuǎn)錄共激活因子，可調(diào)節(jié)參與能量代謝的基因的表達(dá)，還可參與控制血壓，調(diào)節(jié)細(xì)胞膽固醇穩(wěn)態(tài)和肥胖的發(fā)展。在STRING 的分析報(bào)告中還指出，LEP 與PPARGC1A共同參與了白色脂肪細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)這一反應(yīng)途徑，而FNDC5 則為棕色脂肪生長(zhǎng)的刺激因子，因此可推測(cè)，這3 種蛋白在脂肪組織的生長(zhǎng)與發(fā)展過(guò)程中起到了十分密切的作用。不僅如此，眾多證據(jù)也表明，這3 種蛋白同樣與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。綜合考慮OSAS 的發(fā)病機(jī)制，不難預(yù)測(cè)，F(xiàn)NDC5、LEP 及PPARGC1A 通過(guò)脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路及AMPK 信號(hào)通路，參與脂肪組織的發(fā)育并調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的發(fā)展，以肥胖、炎癥反應(yīng)、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)等多種形式，誘導(dǎo)OSAS 的發(fā)生，并產(chǎn)生包括睡眠呼吸暫停在內(nèi)的多種病理表現(xiàn)，加重OSAS患者的病情。

自FNDC5 與肥胖的關(guān)系被報(bào)道后，越來(lái)越多的研究人員開(kāi)始關(guān)注由此可能引起的其他疾病，OSAS 就是其中之一［15］。雖然筆者的研究尚未進(jìn)入實(shí)驗(yàn)階段，研究結(jié)果仍具有一定的局限性，但通過(guò)可靠的生物信息學(xué)分析工具，對(duì)FNDC5 相關(guān)結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、功能等作出了嚴(yán)謹(jǐn)?shù)念A(yù)測(cè)和分析，使FNDC5與OSAS 發(fā)病機(jī)制的相關(guān)關(guān)系得到了進(jìn)一步揭示。相信在此基礎(chǔ)上進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探索后，人們對(duì)FNDC5 與OSAS 的認(rèn)識(shí)將會(huì)有更大的突破。