郝健亨，陳 浩，高 艷，徐慧超，高玉亭，苗宇船，郝慧琴，劉 楊

山西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 晉中 030619

自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）是由自身免疫反應(yīng)介導(dǎo)的慢性進(jìn)行性肝臟實(shí)質(zhì)炎癥，以不同程度的血清轉(zhuǎn)氨酶升高、自身抗體陽(yáng)性以及高γ-球蛋白血癥為主要臨床特征，組織學(xué)檢查可見界面性肝炎，伴有大量漿細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)[1]。該病多發(fā)于女性，且患病率存在顯著的地域差異，在歐美發(fā)達(dá)國(guó)家發(fā)病率較高。當(dāng)前中國(guó)仍缺乏確切的AIH流行病學(xué)數(shù)據(jù)，但國(guó)內(nèi)與AIH相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)量有明顯升高趨勢(shì)[2]。目前，已知環(huán)境因素、遺傳因素和飲食習(xí)慣與AIH的發(fā)病密切相關(guān)，但其確切的觸發(fā)因素與發(fā)展的潛在機(jī)制尚未完全闡明[3]。當(dāng)前，對(duì)AIH的治療主要是依靠免疫抑制藥物和皮質(zhì)類固醇藥，但這些方法有諸多不良反應(yīng)，抗原特異性的免疫調(diào)控細(xì)胞回輸將可能發(fā)展成為治療AIH 最有價(jià)值的方法之一。柴胡皂苷d（Saikosaponin d，SS-d）是從柴胡干燥根部提取分離出來(lái)的五環(huán)三萜類齊果烷型衍生物，具有多種藥理學(xué)作用，例如抗炎、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)和抗肝損害等[4-5]。本研究擬采用靜脈注射刀豆蛋白A（concanavalin A，ConA）的方法建立AIH小鼠模型，并采用 Agilent-085631芯片對(duì)AIH相關(guān)的差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選，同時(shí)觀察SS-d對(duì)部分差異表達(dá)基因的影響，進(jìn)而對(duì)AIH的發(fā)病機(jī)制以及SS-d對(duì)AIH的治療機(jī)制進(jìn)行探討，為臨床上應(yīng)用SS-d治療AIH提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。瑞公司合成，引物序列見表1。

表1 PCR引物序列Tab 1 Primer sequences for PCR

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康、SPF級(jí)的C57BL/6小鼠40只，鼠齡 9～10周，體質(zhì)量（20±2） g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（京）2016-0006。將小鼠隨機(jī)分為芯片組（n=8）和SS-d治療機(jī)制組（n=32）。將芯片組隨機(jī)分為正常組和模型組（每組n=4）；SS-d治療機(jī)制組隨機(jī)分為正常組、模型組、SS-d低劑量組和SS-d高劑量組（每組n=8）。小鼠常規(guī)飼養(yǎng)，自由攝食，飼養(yǎng)溫度為22～25 ℃，濕度為58%左右，通風(fēng)良好。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑 Agilent-085631芯片（歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司，中國(guó)上海），SS-d、ConA（索萊寶科技有限公司，中國(guó)北京），兔抗CTLA-4多克隆抗體（愛博泰克生物科技有限公司，中國(guó)武漢），兔抗GAPDH多克隆抗體、羊抗兔IgG-HRP （博士德生物工程有限公司，中國(guó)武漢），RT Master Mix （寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，中國(guó)北京），ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（諾唯贊生物科技有限公司，中國(guó)南京）。CTLA-4mRNA、IL-10mRNA、IL-17mRNA以及mGAPDHmRNA由武漢金開

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 AIH小鼠的模型建立及分組處理 ①基因芯片組：正常組常規(guī)飼養(yǎng)，模型組小鼠按15 mg/kg的劑量給予尾靜脈注射Con A；12 h后處死并提取肝組織，按Agilent-085631芯片說(shuō)明書進(jìn)行差異表達(dá)基因的篩選。②SS-d治療機(jī)制組：正常組常規(guī)飼養(yǎng)；模型組按15 mg/kg劑量給予尾靜脈注射Con A；SS-d低劑量組和SS-d高劑量組根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[6-7]和前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別按2.5和5.0 mg/kg劑量腹腔注射SS-d，8 h后按15 mg/kg劑量給予尾靜脈注射Con A。各組小鼠于造模12 h后，先通過(guò)眶內(nèi)取血法收集小鼠血液并制備血清，后采用頸椎脫臼法處死全部小鼠，取出肝臟后經(jīng)液氮速凍，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 篩選基因芯片組小鼠差異表達(dá)基因 提取小鼠肝組織總RNA，按照芯片標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行樣本總RNA的定量、完整性檢測(cè)、標(biāo)記，芯片的雜交、洗脫，數(shù)據(jù)的掃描、收集、整理等步驟。采用Feature Extraction軟件處理原始圖像，提取原始數(shù)據(jù)，利用GeneSpring GX軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行“Quantile”標(biāo)準(zhǔn)化。過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)，且用于比較的每組樣本中至少有1組75%的樣本標(biāo)記為“Detected”的探針留存，進(jìn)行后續(xù)分析。利用T檢驗(yàn)的倍數(shù)變化值與P值對(duì)差異基因進(jìn)行篩選，篩選的標(biāo)準(zhǔn)為上調(diào)或者下調(diào)倍數(shù)變化值≥2.0且P值≤0.05。對(duì)差異基因進(jìn)行KEGG富集分析，并以此判定差異基因主要影響的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。最后，用qRT-PCR技術(shù)對(duì)部分差異表達(dá)基因CTLA-4、IL-10、IL-17進(jìn)行驗(yàn)證。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書要求，將相關(guān)試劑與10 μL總RNA均勻混合（總體積為20 μL），進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)條件：37 ℃×15 min，1次循環(huán)；85 ℃×5 s，1次循環(huán)（4 ℃冰箱保存反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物）。用real-time PCR 試劑盒相關(guān)試劑與2 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物混合均勻（總體積為20 μL），進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95 ℃ ×30 s，1次循環(huán)；95 ℃ ×5 s，60 ℃ ×34 s，40個(gè)循環(huán)。根據(jù)real-time PCR原始檢測(cè)結(jié)果，采用2-△△CT相對(duì)定量計(jì)算公式計(jì)算出各樣品目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 蘇木精 - 伊紅（H-E）染色觀察SS-d治療機(jī)制組小鼠肝臟炎癥反應(yīng)程度 將SS-d治療組一部分小鼠肝組織經(jīng)4%多聚甲醛固定24 h后，常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，RM2235型石蠟切片機(jī)切片（片厚5 μm），常規(guī)H-E染色；用中性樹膠固封，并在光學(xué)顯微鏡下觀察各實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟炎癥反應(yīng)程度。

1.2.4 微板法檢測(cè)SS-d治療機(jī)制組小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic pyruvic transaminase，GPT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamic oxaloacetic transaminase，GOT）含量 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書要求，采用微板法，通過(guò)SpectraMax Plus384酶標(biāo)儀測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組小鼠血清GPT和GOT含量（U/L）。

1.2.5 熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)SS-d治療機(jī)制組小鼠肝 組 織CTLA-4mRNA、IL-10mRNA、IL-17mRNA表達(dá) 取各實(shí)驗(yàn)組小鼠肝組織50 mg，通過(guò)酚 - 氯仿法提取總RNA。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書要求，將相關(guān)試劑與10 μL總RNA均勻混合（總體積為20 μL），進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)條件：37 ℃×15 min，1個(gè)循環(huán)；85 ℃×5 s，1個(gè)循環(huán)（4 ℃冰箱保存反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物）。用real-time PCR 試劑盒相關(guān)試劑與2 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物混合均勻（總體積為20 μL），進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95 ℃×30 s，1次循環(huán)；95 ℃×5 s，60 ℃×34 s，40個(gè)循環(huán)。根據(jù)real-time PCR原始檢測(cè)結(jié)果，采用2-△△CT相對(duì)定量計(jì)算公式計(jì)算出各樣品目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 ELISA技術(shù)檢測(cè)SS-d治療機(jī)制組小鼠血清IL-10、IL-17含量變化 根據(jù)各ELISA試劑盒說(shuō)明書要求，通過(guò)SpectraMax Plus384酶標(biāo)儀檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組小鼠血清IL-10和IL-17吸光度值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算上述指標(biāo)的含量（pg/L）。

1.2.7 Western blotting檢測(cè)SS-d治療機(jī)制組小鼠肝組織細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原（cytotoxic T lymphocyteassociated antigen，CTLA） -4蛋白的表達(dá)變化 常規(guī)提取肝組織總蛋白，BCA法測(cè)定總蛋白濃度。配10%膠后放入電泳槽中，分別加入蛋白樣品15 μL，接通電源先以80 V、40 min進(jìn)行電泳，后改為120 V跑至膠底部停止，用濕法轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)長(zhǎng)2 h。取出膜放入脫脂奶粉（濃度5%）封閉2 h，把兩張膜分別放入CTLA-4一抗（濃度1:400）與GAPDH一抗（濃度1:500）4 ℃孵育過(guò)夜；TBST洗膜5×5 min后，羊抗兔IgG-HRP二抗（濃度1:500）室溫?fù)u床孵育1 h；TBST洗膜5×5 min后滴加顯影劑，通過(guò)c300化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)掃描顯影，并利用ImageJ軟件分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用 SPSS 25. 0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析，所得數(shù)據(jù)以x—±s表示，采用單因素方差分析法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 芯片組小鼠差異表達(dá)基因的篩選

芯片組小鼠共篩查差異表達(dá)基因11 512個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)5 189個(gè)，下調(diào)6 323個(gè)。注釋到KEGG pathway基因共計(jì)1 567個(gè)，P≤0.05的信號(hào)通路共計(jì)138條（P值最小的前30條信號(hào)通路的氣泡圖見圖1）；表達(dá)上調(diào)基因5 189個(gè)，注釋到KEGG pathway基因共計(jì)781個(gè)，P≤0.05的信號(hào)通路共計(jì)102條（P值最小的前30條信號(hào)通路的氣泡圖見圖1）；表達(dá)下調(diào)基因6 323個(gè)，注釋到KEGG pathway基因共計(jì)789個(gè)，P≤0.05的信號(hào)通路共計(jì)77條。qRT-PCR對(duì)部分差異表達(dá)基因的驗(yàn)證結(jié)果顯示，CTLA-4mRNA、IL-10mRNA、IL-17mRNA的含量變化趨勢(shì)與芯片篩選結(jié)果一致（圖2）。

圖1 芯片組小鼠差異表達(dá)基因的KEGG富集分析結(jié)果Fig 1 KEGG enrichment analysis results of differentially expressed genes in chip group

圖2 差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果Fig 2 Results of qRT-PCR verification of differentially expressed genes

圖3 SS-d治療機(jī)制組小鼠肝臟H-E染色結(jié)果Fig 3 Results of H-E staining of liver in SS-d treatment group

2.2 SS-d治療機(jī)制組小鼠肝臟炎癥反應(yīng)程度

正常組小鼠肝細(xì)胞正常，肝小葉結(jié)構(gòu)完整清晰，肝索排列有序整齊；模型組可見肝細(xì)胞腫脹、變性、壞死，并伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；與模型組比較，SS-d低劑量組小鼠肝組織內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，肝細(xì)胞壞死程度降低；SS-d高劑量組病理變化改善更為明顯（圖3）。

2.3 SS-d治療機(jī)制組小鼠血清GPT和GOT的含量變化

與正常組比較，模型組血清中 GPT和GOT顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，SS-d高劑量組GPT、GOT顯著降低（P＜0.05）；SS-d高劑量組與正常組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；SS-d低劑量組與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖4）。

圖4 SS-d治療機(jī)制組小鼠血清GPT和GOT含量變化Fig 4 Serum GPT and GOT levels in SS-d treatment group

2.4 SS-d治療機(jī)制組小鼠肝組織 CTLA-4、IL-10和IL-17 mRNA表達(dá)變化

正常組小鼠肝組織中CTLA-4mRNA和IL-10mRNA表達(dá)量最高，IL-17mRNA表達(dá)量最低；模型組與正常組比較，CTLA-4mRNA和IL-10mRNA表達(dá)量顯著降低，IL-17mRNA表達(dá)量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；但SS-d高劑量組與正常組比較，表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；相比于模型組，2個(gè)治療組CTLA-4mRNA和IL-10mRNA表達(dá)量均有不同程度的升高，而IL-17mRNA表達(dá)量均有不同程度的降低，其中SS-d高劑量組與模型組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖5）。

圖5 SS-d治療機(jī)制組小鼠肝組織 CTLA-4、IL-10和IL-17 mRNA表達(dá)量的變化Fig 5 Changes of CTLA-4, IL-10 and IL-17 mRNA in liver tissues of mice in SS-d treatment group

2.5 SS-d治療機(jī)制組小鼠血清IL-10和IL-17含量的變化

與正常組比較，AIH模型組血清中 IL-17含量顯著升高（P＜0.05），IL-10含量顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，SS-d高劑量組IL-17含量顯著降低（P＜0.05），而IL-10含量顯著升高（P＜0.05）；SS-d高劑量組與正常組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；SS-d低劑量組與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖6）。

圖6 SS-d治療機(jī)制組小鼠血清IL-10和IL-17含量的變化Fig 6 Changes of serum IL-10 and IL-17 levels in SS-d treatment group

2.6 SS-d治療機(jī)制組小鼠肝組織CTLA-4蛋白的表達(dá)變化

與正常組小鼠比較，模型組小鼠肝組織CTLA-4蛋白表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，各治療組肝組織中CTLA-4蛋白表達(dá)量均有所增高（P＜0.05），SS-d高劑量組增高更為明顯；但SS-d高劑量組與正常組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；SS-d低劑量組與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖 7）。

圖7 SS-d治療機(jī)制組小鼠肝組織CTLA-4蛋白的表達(dá)變化Fig 7 Changes of CTLA-4 protein expression in liver tissues of mice in SS-d treatment group

3 討論

AIH是一種免疫介導(dǎo)的進(jìn)行性肝損傷，臨床表現(xiàn)可以從輕度或重度癥狀發(fā)展成為肝衰竭。患者血清轉(zhuǎn)氨酶水平升高，組織學(xué)上表現(xiàn)為界面肝炎和漿細(xì)胞的存在，血清學(xué)上表現(xiàn)為免疫球蛋白G水平升高。AIH可以影響任何年齡段人群，主要以中年女性居多，其發(fā)病率也因地域而異。當(dāng)前AIH的發(fā)病機(jī)制尚不明確，有證據(jù)表明遺傳和環(huán)境因素都與其有緊密關(guān)聯(lián)；同時(shí)，外周自我耐受性破壞，F(xiàn)OXP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能受損，以及效應(yīng)細(xì)胞對(duì)組織水平抑制的抵抗在AIH免疫病理發(fā)生中起重要作用[3]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AIH的發(fā)病過(guò)程非常復(fù)雜，系多條信號(hào)通路的活性發(fā)生改變的共同作用結(jié)果。本次實(shí)驗(yàn)選用的是ConA誘導(dǎo)的小鼠肝損害模型，ConA作為一種植物血凝素，能有效刺激T細(xì)胞并迅速誘導(dǎo)T細(xì)胞的活化和浸潤(rùn)[8-11]。H-E染色結(jié)果顯示，經(jīng)尾靜脈注射ConA后，AIH小鼠肝臟內(nèi)門管區(qū)及肝小葉中央靜脈可見大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，肝小葉內(nèi)部分肝細(xì)胞變性、腫脹、壞死，同時(shí)伴有血清GPT和GOT的顯著升高，均提示ConA可通過(guò)誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞活化攻擊自身肝組織，進(jìn)而促進(jìn)AIH的發(fā)生和發(fā)展。因此，本次實(shí)驗(yàn)選擇T細(xì)胞受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及Th17細(xì)胞分化信號(hào)通路的部分差異表達(dá)基因（CTLA-4、IL-10和IL-17）作為后續(xù)驗(yàn)證AIH發(fā)病機(jī)制以及SS-d治療機(jī)制的靶點(diǎn)。

Th17細(xì)胞是代表T輔助淋巴細(xì)胞的特殊子集，不僅參與黏膜和上皮屏障的抗微生物免疫，而且還是腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵細(xì)胞成分，參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[12-13]。同時(shí)，Th17細(xì)胞是免疫應(yīng)答的正調(diào)節(jié)因子。一方面，它能產(chǎn)生包括IL-17A、IL-17F和IL-22在內(nèi)的多種促炎細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子的產(chǎn)生不僅促進(jìn)免疫細(xì)胞（如中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞）在炎癥部位的積累，而且還可以引起組織病理學(xué)改變[14]。另一方面，Th17細(xì)胞可有效促進(jìn)Treg的擴(kuò)增和表型穩(wěn)定[15]。Th17細(xì)胞與AIH發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。有研究[16]證實(shí)：AIH患者的血清IL-17水平和肝內(nèi)Th17細(xì)胞的頻率顯著高于健康對(duì)照者，并且AIH患者肝臟中IL-17+淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)（主要表現(xiàn)為CD4+表型）明顯增加，肝臟IL-17+細(xì)胞浸潤(rùn)程度與AIH患者的肝臟纖維化和炎癥程度呈正相關(guān)；同時(shí)，IL-17也被證明通過(guò)肝細(xì)胞中的絲裂原活化蛋白激酶途徑誘導(dǎo)IL-6表達(dá)。多種證據(jù)[17]表明，Th17細(xì)胞增殖是AIH發(fā)病的關(guān)鍵觸發(fā)因素，Th17細(xì)胞與肝細(xì)胞之間的正反饋回路加劇炎癥過(guò)程。Th17細(xì)胞特征在于IL-17大量產(chǎn)生，IL-17通過(guò)介導(dǎo)T細(xì)胞和炎癥細(xì)胞在組織中的浸潤(rùn)，與干擾素γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等細(xì)胞因子協(xié)同發(fā)揮作用，促進(jìn)T細(xì)胞的活化，進(jìn)而產(chǎn)生炎癥性破壞并放大靶器官的免疫反應(yīng)，參與AIH等多種免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展[18]。Th17細(xì)胞和IL-17信號(hào)通路在AIH的發(fā)病機(jī)制中有重要作用。Treg是免疫耐受和炎癥反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子，主要通過(guò)下調(diào)機(jī)體的免疫應(yīng)答維持自身耐受。一方面，它產(chǎn)生抗炎細(xì)胞因子如IL-10來(lái)抑制免疫反應(yīng)；另一方面，它可以通過(guò)表達(dá)CTLA-4（在小鼠中具有從APC反式內(nèi)吞CD80/CD86的能力），從而防止APC 激活和效應(yīng)T細(xì)胞擴(kuò)增[15]。同時(shí)，Treg還可以在體外和體內(nèi)促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化，從而增強(qiáng)Th17細(xì)胞的功能性后果（對(duì)宿主防御的保護(hù)作用，以及對(duì)炎癥和腫瘤生長(zhǎng)的不利作用）。Treg細(xì)胞組成性地表達(dá)CTLA-4。CTLA-4是T細(xì)胞應(yīng)答的重要負(fù)調(diào)節(jié)因子，主要通過(guò)下調(diào)T細(xì)胞活化維持機(jī)體組織器官的免疫耐受。CTLA-4的表達(dá)或功能異常參與AIH的發(fā)病過(guò)程。IL-10是一種具有強(qiáng)抗炎作用的細(xì)胞因子，在限制宿主對(duì)病原體的免疫反應(yīng)，從而防止對(duì)宿主的損害和維持正常組織穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著核心作用。IL-10的失調(diào)與AIH發(fā)展風(fēng)險(xiǎn)的增加有關(guān)[19]。CTLA-4和IL-10作用機(jī)制類似[20]。研究[21]證實(shí)，IL-10的抑制作用與CTLA-4和B7分子結(jié)合發(fā)揮負(fù)向免疫調(diào)節(jié)作用有密切關(guān)系。

總之，IL-17、CTLA-4和IL-10三者都是調(diào)節(jié)免疫功能活性所必需的，與AIH的發(fā)病機(jī)制有緊密關(guān)聯(lián)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相較于正常組，AIH模型組小鼠肝組織中CTLA-4蛋白表達(dá)水平顯著降低，CTLA-4 mRNA和IL-10 mRNA表達(dá)量明顯下降，模型組血清中IL-10含量降低，表明CTLA-4和IL-10共同參與AIH在小鼠體內(nèi)發(fā)病過(guò)程，即通過(guò)參與免疫反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)來(lái)維持機(jī)體的免疫自穩(wěn)。對(duì)比正常組，模型組血清中IL-17含量明顯升高，IL-17 mRNA表達(dá)量增高。由此可推測(cè)，Th17和Treg的平衡可能與AIH發(fā)病有關(guān)，其中CTLA-4、IL-10和IL-17表達(dá)的變化在AIH發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵的作用。

中藥柴胡始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，主要入藥部位在根部，有解郁疏肝、解表泄熱、升陽(yáng)氣的作用，目前已廣泛用于治療亞洲國(guó)家的幾種肝病。SS-d是從柴胡中提取的三萜皂苷，并被認(rèn)為是從柴胡中分離出的各類柴胡皂苷中最活躍的一種，具有抗腫瘤、抗過(guò)敏、抗凋亡和免疫調(diào)節(jié)活性等多種藥理學(xué)作用；此外，SS-d還具有明顯的抗炎活性。在細(xì)胞因子水平上，SS-d能抑制促炎細(xì)胞因子，包括TNF-α和IL-6等；同時(shí)，可以提高抗炎細(xì)胞因子的表達(dá)，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1和IL-10等[22]。既往研究[23]表明，SS-d對(duì)T細(xì)胞有絲分裂原具有調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能和抑制淋巴細(xì)胞增殖的作用。之后，有研究[24]表明，SS-d不僅能抑制OKT3/CD28共刺激的人T細(xì)胞增殖，而且在體外抑制PMA、PMA/Ionomycin和Con A誘導(dǎo)的小鼠T細(xì)胞活化，SS-d對(duì)PMA誘導(dǎo)的T細(xì)胞活化的抑制作用與通過(guò)抑制IKK和Akt活性而下調(diào)NF-κB信號(hào)有關(guān)。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示AIH模型組CTLA-4 mRNA和IL-10 mRNA表達(dá)量最低，IL-17 mRNA表達(dá)量最高。相較于AIH模型組，SS-d低劑量組和SS-d高劑量組CTLA-4 mRNA和IL-10 mRNA表達(dá)量隨劑量加大有上升趨勢(shì)，而IL-17 mRNA表達(dá)量則逐步下降；并且，H-E染色結(jié)果顯示，2個(gè)治療組小鼠肝組織炎癥反應(yīng)不同程度減輕，肝細(xì)胞壞死情況得到不同程度改善。相較于模型組，SS-d低劑量組和SS-d高劑量組CTLA-4蛋白表達(dá)水平隨劑量加大逐步升高；并且對(duì)比模型組，治療組中血清GPT、GOT和IL-17水平有不同程度降低，IL-10呈逐步升高趨勢(shì)。以上結(jié)果說(shuō)明SS-d治療AIH的作用機(jī)制與CTLA-4、IL-10和IL-17的表達(dá)變化有關(guān)，它通過(guò)刺激肝細(xì)胞內(nèi)CTLA-4和抑炎因子IL-10的表達(dá)，降低T細(xì)胞的活化程度，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，并通過(guò)抑制促炎因子IL-17的表達(dá)降低炎癥反應(yīng)對(duì)肝臟的損害作用。

綜上所述，在AIH早期，各種致病因素可以導(dǎo)致T細(xì)胞受體信號(hào)通路活性發(fā)生變化，引起T細(xì)胞的異常激活，從而誘發(fā)肝臟損害；而SS-d可通過(guò)調(diào)節(jié)T細(xì)胞受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及Th17細(xì)胞分化信號(hào)通路中部分基因如IL-10、CTLA-4、IL-17的表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)對(duì)肝臟的損害，改善AIH小鼠肝功能。