姚嶺柏，徐松鶴，郭美蘭，王 菁，任 琴

(1.集寧師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 烏蘭察布 012000；2.集寧師范學(xué)院 烏蘭察布經(jīng)濟(jì)作物逆境生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 烏蘭察布 012000；3.鄂爾多斯市伊金霍洛旗第九幼兒園，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 017200)

鉀是植物必需的大量營(yíng)養(yǎng)元素，在植物體內(nèi)具有相對(duì)穩(wěn)定的高濃度和強(qiáng)移動(dòng)性，與馬鈴薯塊莖形成及其抗逆反應(yīng)密切相關(guān)。研究表明，鉀所介導(dǎo)的植物防御反應(yīng)與茉莉酸信號(hào)有關(guān)[1-2]，外源鉀濃度的改變，通過植物體內(nèi)鈣等信號(hào)激活茉莉酸代謝途徑加速茉莉酸類物質(zhì)合成，提高植物的抗蟲性，表明鉀在茉莉酸信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中起重要作用[3]。

茉莉酸介導(dǎo)的十八烷酸途徑在植物誘導(dǎo)防御反應(yīng)中具有重要作用[4]。茉莉酸過量表達(dá)的擬南芥突變株中桃蚜種群存活率明顯降低。用外源茉莉酸處理番茄植株，能誘導(dǎo)其系統(tǒng)防御能力增加，使蚜蟲的生存受到抑制，并且導(dǎo)致茉莉酸誘導(dǎo)的基因如PIN2mRNA在番茄葉中表達(dá)量增加[5]。野生型番茄植株被蜘蛛螨取食2 d后，茉莉酸含量增加3倍[6]。白粉虱取食擬南芥后，擬南芥體內(nèi)茉莉酸途徑上游應(yīng)答基因LOX2和OPR3也被誘導(dǎo)[7]。麥雙尾蚜(Diuraphisnoxia)和二叉蚜(Schizaphisgraminum)取食小麥后，小麥植株中參與茉莉酸合成和其介導(dǎo)的防御酶如10,11-還原酶、脂氧合酶(LOX)和細(xì)胞色素P450等都被大量誘導(dǎo)[8-9]。當(dāng)受到植食性昆蟲危害后，植物組織通過啟動(dòng)茉莉酸等信號(hào)物質(zhì)調(diào)節(jié)下游合成大量揮發(fā)性化學(xué)物質(zhì)。如棉花受到害蟲取食后，受傷部位能夠釋放出大量揮發(fā)性萜烯類和綠葉揮發(fā)物，進(jìn)行防御反應(yīng)[10-11]。茉莉酸信號(hào)調(diào)節(jié)對(duì)植物誘導(dǎo)抗性方面的報(bào)道較多，但施用鉀肥與馬鈴薯誘導(dǎo)抗蟲防御之間的關(guān)系未見報(bào)道。

馬鈴薯(Solanumtuberosum)是烏蘭察布市主要經(jīng)濟(jì)作物之一，在其生長(zhǎng)過程中，常受到桃蚜(Myzuspersicae)的危害，導(dǎo)致植株生長(zhǎng)發(fā)育不良，產(chǎn)量和質(zhì)量受到嚴(yán)重影響。筆者在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，施鉀馬鈴薯葉片上桃蚜數(shù)量顯著降低。鑒于此，探討不同施鉀量對(duì)馬鈴薯葉片中茉莉酸信號(hào)及其揮發(fā)性化學(xué)物質(zhì)含量的影響，為揭示鉀肥增強(qiáng)馬鈴薯抗蟲機(jī)制、有效開展蚜蟲的生態(tài)調(diào)控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

馬鈴薯品種選用克新1號(hào)(Kexin No.1)和費(fèi)烏瑞它(Feiwuruita)?？诵?號(hào)由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所育成，屬中晚熟高產(chǎn)品種。費(fèi)烏瑞它原產(chǎn)于荷蘭，屬早熟高產(chǎn)馬鈴薯品種。種子均購自內(nèi)蒙古烏蘭察布市種子公司。

將上述種子播種于塑料盆(內(nèi)徑∶高=33 cm∶27 cm)中，砂∶土為1∶2 (體積比)。每盆施農(nóng)家肥500 g，施前用CuSO4對(duì)農(nóng)家肥消毒。每盆種植馬鈴薯1株，自然條件下生長(zhǎng)。

選取長(zhǎng)勢(shì)一致、具有4片葉子的克新1號(hào)和費(fèi)烏瑞它各40盆，將其分為4組，每組10盆，分別施硫酸鉀0、4、6、8 g/株。其中，0 g/株為對(duì)照(CK)。自然條件下生長(zhǎng)2個(gè)月后，隨機(jī)摘取各處理葉片放入液氮罐中，置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 桃蚜行為選擇試驗(yàn) 根據(jù)程麗坤等[12]方法略加修改。所用儀器為“Y”型嗅覺儀，內(nèi)徑3 cm，底部長(zhǎng)臂22 cm，上部?jī)啥瘫?7 cm，兩臂夾角75°?！癥”形管內(nèi)置1根“Y”形鐵絲，鐵絲端部穿過紗網(wǎng)，每個(gè)管臂均用Teflon管與流量計(jì)連接后，其中一短臂與馬鈴薯植株連接，另一臂與裝有蒸餾水和活性碳的玻璃瓶相連。調(diào)節(jié)兩臂氣流均為200 mL/min后，將準(zhǔn)備好的蚜蟲由基部釋放口單頭放入。每個(gè)處理觀察20 min，試蟲20頭。重復(fù)10次。

對(duì)4、6、8 g/株處理均進(jìn)行了測(cè)試，依據(jù)本研究中所測(cè)揮發(fā)物、脂氧合酶活性及茉莉酸含量的測(cè)定結(jié)果，6 g/株試驗(yàn)效果最佳，故選擇6 g/株施鉀植株數(shù)據(jù)作為最終數(shù)據(jù)界定行為選擇。當(dāng)蚜蟲爬至超過某臂的10 cm處并持續(xù)5 min以上，記錄為其對(duì)該臂的味源做出了選擇。若蚜蟲引入20 min后沒有做出選擇，則記錄為無反應(yīng)。每測(cè)5頭后調(diào)換“Y”型管方向1次，每測(cè)完20頭用75%乙醇擦洗管的內(nèi)、外壁，烘干后再用。

1.2.2 馬鈴薯揮發(fā)物收集與測(cè)定 采用動(dòng)態(tài)頂空采集法收集不同處理馬鈴薯揮發(fā)物。收集揮發(fā)物所用吸附管(Chrompack公司)長(zhǎng)16 cm、內(nèi)徑3 mm，內(nèi)裝吸附劑為Tenax-GR(Sigma公司)。

采用熱脫附-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(TCT-GC-MS)測(cè)定馬鈴薯揮發(fā)物。儀器型號(hào)分別為CP-4010 PTI/TCT(CHROMPACK公司)、TRACE TM GC 2000(CE INSTRUMENT公司)、VOYAGER MASS(FINNIGAN公司)。

TCT主要條件為，System Pressure：20 kPa；Rod temperature：250 ℃(10 min)；Trap inject：260 ℃。

GC的工作條件為，色譜柱DB-5 Low Bleed/MS柱(60 m×0.32 mm×0.5 m)，通過液氮脫附進(jìn)樣，He載氣。GC程序升溫：初始溫度為40 ℃，保持3 min；以 6 ℃/min升至270 ℃，保持5 min；Post run 280 ℃，保持5 min。

MS工作條件為，Ionization Mode：EI；E-energy：70 eV；Mass range：29～350 amu；I/F：250 ℃；Src：200 ℃；Emission Current：150 μA；全掃描，每次掃描所用時(shí)間0.4 s，質(zhì)譜掃描范圍(m/z)19～435。

揮發(fā)性物質(zhì)鑒定：采用NIST 02譜圖庫兼顧色譜保留時(shí)間進(jìn)行馬鈴薯揮發(fā)物成分鑒定，并通過面積歸一化法以各類揮發(fā)物的相對(duì)含量進(jìn)行定量。

1.2.3 馬鈴薯葉片中茉莉酸提取與含量測(cè)定 樣品提?。悍謩e取不同處理的馬鈴薯新鮮葉片約0.5 g，加入少量抗氧化劑，用異丙醇、水、鹽酸組成的提取液(2.000∶1.000∶0.002,體積比)低溫研磨后轉(zhuǎn)入離心管內(nèi)。分別加入內(nèi)標(biāo)9,10-二氫茉莉酸(2 ng/μL)于上述管內(nèi)，置于搖床30 min(4 ℃、100 r/min)。取出后再加二氯乙烷1 mL，再搖30 min。之后于低溫離心機(jī)中離心(12 000 r/min、5 min)，得到上清液，用氮?dú)獯蹈蓛x吹干。加50%甲醇100 μL，12 000 r/min離心10 min，取上清液，放入帶插管的取樣瓶后開始進(jìn)樣，用于高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(HPLC/MS)測(cè)定。

測(cè)定條件：采用超高效液相色譜(Agilent 1260)-質(zhì)譜(ABQtrap 5500)聯(lián)用儀進(jìn)行茉莉酸測(cè)定。色譜柱：C18(1.8 μm，4.6 mm×50 mm)；流動(dòng)相為乙腈和0.1%乙酸水，流速為0.8 mL/min。流動(dòng)相初始為90%的0.1%乙酸水、10%的乙腈；5 min時(shí)為90%的乙腈和10%的0.1%乙酸水。

定性與定量分析：分析茉莉酸標(biāo)準(zhǔn)樣品峰度，通過保留時(shí)間對(duì)樣品進(jìn)行定性。根據(jù)面積比等于濃度比的關(guān)系，求出該物質(zhì)含量。

1.2.4 馬鈴薯葉片LOX活性及蛋白質(zhì)表達(dá)量測(cè)定 粗酶液制備：分別取不同處理馬鈴薯葉片0.1～0.2 g，加入預(yù)冷的0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液(含7%聚乙烯吡咯烷酮)冰浴研磨，加入3～5粒銅試劑，定容至4 mL。勻漿液于4 ℃、5 000 r/min離心20 min，上清液即為酶液。

LOX活性測(cè)定：采用比色法進(jìn)行測(cè)定。所用儀器為UNIC紫外可見分光光度計(jì)(UV-2800)。取上述不同粗酶液60 μL(對(duì)照管加60 μL磷酸鉀緩沖液)，加入2 940 μL底物(0.126 mL的亞油酸用3 mL乙醇溶解，再溶于0.2 mol/L Tris緩沖液中，搖勻即可)，234 nm條件下比色，記錄OD值。

LOX蛋白表達(dá)量：參考馬曉林等[13]的方法，通過iTRAQ技術(shù)研究不同鉀肥處理對(duì)LOX蛋白表達(dá)量的影響。(1)蛋白質(zhì)的提取與消化：取植物葉片，加入TCA-冰丙酮冰浴研磨，-20 ℃沉淀2 h，4 ℃、30 000×g離心30 min。取沉淀，再加入預(yù)冷的純丙酮清洗沉淀，-20 ℃沉淀30 min，4 ℃、20 000 g離心30 min。取部分沉淀加入1.5 mL離心管中(加0.1～0.5 mL即可)，加入配制好的SDS復(fù)溶Buffer，超聲5 min助溶，離心25 min，取上清100 μL，加入DTT至終濃度10 mmol/L。56 ℃水浴1 h。迅速加入IAM至終濃度55 mmol/L，暗室靜置1 h。加入4倍于樣品溶液體積的預(yù)冷丙酮，-20 ℃沉淀3 h。4 ℃、20 000×g離心20 min，取沉淀。加入50 μL的1% SDS復(fù)溶沉淀，用水稀釋至250 μL，超聲3 min助溶。使用2D-Quant Kit定量，SDS-PAGE檢測(cè)蛋白質(zhì)質(zhì)量與定量準(zhǔn)確性。每個(gè)樣品取100 μg，加入與100 μg樣品等體積的純TEAB，用含0.1% SDS的TEAB補(bǔ)齊所有樣品體積。加入1 μg/μL的Trypsin，每100 μg蛋白質(zhì)底物加入3.3 μg的酶，37 ℃水浴24 h，補(bǔ)加Trypsin 1 μg。37 ℃水浴12 h。凍干消化液，然后每管使用50 μL TEAB(水∶TEAB=1∶1，體積比，含0.1% SDS)復(fù)溶肽段。取1 μL消化后肽段，使用MALDI Tof/Tof檢測(cè)消化效率。(2)iTRAQ試劑標(biāo)記肽段：將標(biāo)記試劑平衡至室溫。每管標(biāo)記試劑中加入70 μL異丙醇，混勻，離心甩至管底。將混好的標(biāo)記試劑加入到肽段中，混勻后甩至管底，室溫靜置2 h。MALDI檢測(cè)標(biāo)記效率(用MS/MS檢測(cè)是否有標(biāo)記基團(tuán)脫落)。(3)micro-Tof-Q檢測(cè)肽段信號(hào)：將標(biāo)記樣品稀釋后調(diào)pH值至3.0，用0.22 μm有機(jī)膜過濾。經(jīng)排氣、清洗、平衡至壓力后，即可在HPLC(強(qiáng)陽離子交換色譜)中上樣。收集樣品，通過C18反相色譜除鹽。合并MALDI圖譜類似的肽段，低溫離心抽干。20 μL 0.1%甲酸復(fù)溶。取0.8 μL樣品點(diǎn)靶，LC-MS/MS分析。(4)Western blotting：蛋白質(zhì)樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后，室溫轉(zhuǎn)膜(100 V，90 min)。10%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜，加一抗(北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司制備)，37 ℃ 1 h，TBST漂洗3次，每次10 min；加二抗(HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，購于Jackson公司)，37 ℃ 40 min，TBST漂洗3次，每次10 min。AB(發(fā)光液)液混合后，滴入膜上顯影，BIORAD凝膠成像儀拍照、保存。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 18.0進(jìn)行分析。各處理中的重復(fù)數(shù)據(jù)通過單因素方差進(jìn)行分析，并用LSD法進(jìn)行處理間差異顯著性檢驗(yàn)(α=0.05)。選擇性試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用多配對(duì)樣本的Cochran’sQ檢驗(yàn)法進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 桃蚜對(duì)馬鈴薯植株揮發(fā)物的行為反應(yīng)

桃蚜對(duì)馬鈴薯2個(gè)品種選擇行為反應(yīng)不同，其中對(duì)費(fèi)烏瑞它施鉀植株的趨向率為 26%，對(duì)其對(duì)照植株的趨向率為71%；對(duì)克新1號(hào)施鉀植株的趨向率為30%，對(duì)其對(duì)照植株的趨向率為64%。方差分析結(jié)果顯示，與各自的對(duì)照相比，桃蚜對(duì)施鉀馬鈴薯2個(gè)品種的趨向反應(yīng)均有顯著差異，表明施鉀馬鈴薯植株對(duì)桃蚜具有明顯的趨避性。

2.2 不同處理馬鈴薯揮發(fā)物含量變化

桃蚜對(duì)馬鈴薯植株的趨性行為反應(yīng)與植株中揮發(fā)物種類和含量密切相關(guān)。施鉀后，克新1號(hào)馬鈴薯植株揮發(fā)物含量變化最明顯的有4種：3-蒈烯、苯甲醛、檸檬烯和1，3-環(huán)己二烯。由圖1A可知，分別與各自的對(duì)照相比，3-蒈烯含量在施鉀6 g/株時(shí)顯著升高。施鉀8 g/株時(shí)，雖然3-蒈烯含量也升高，但方差分析結(jié)果顯示，與對(duì)照差異不顯著。不同施鉀量均使馬鈴薯植株中苯甲醛含量升高，但只有6 g/株施鉀量時(shí)苯甲醛含量顯著高于對(duì)照。施鉀處理時(shí)檸檬烯含量均顯著高于對(duì)照，其中6 g/株施鉀量時(shí)檸檬烯含量達(dá)到最高，是對(duì)照的2.5倍。費(fèi)烏瑞它植株施鉀后揮發(fā)物的變化與克新1號(hào)不同，3種揮發(fā)物中，只有苯甲醛含量在施鉀6 g/株和8 g/株時(shí)顯著高于對(duì)照，其余2種揮發(fā)物與對(duì)照差異不顯著(圖1B)。就1,3-環(huán)己二烯含量變化來說，施鉀量分別為6、8 g/株時(shí)，該揮發(fā)物含量在克新1號(hào)植株中顯著增加，而費(fèi)烏瑞它在施鉀4 g/株時(shí)，1,3-環(huán)己二烯含量顯著升高。綜上，克新1號(hào)植株在施鉀量為6 g/株時(shí)，4種揮發(fā)物的含量均顯著增加。

A：克新1號(hào)；B：費(fèi)烏瑞它；C：1,3-環(huán)己二烯；不同小寫字母表示差異顯著(PA:Kexin No.1;B:Feiwuruita;C:1,3-cyclohexadiene;Different small letters show significant difference(P圖1 不同施鉀量對(duì)馬鈴薯植株中揮發(fā)物含量的影響Fig.1 Effect of different potassium supply on the content of potato plant volatiles

2.3 不同處理克新1號(hào)葉片茉莉酸含量及關(guān)鍵酶活性變化

施鉀處理馬鈴薯克新1號(hào)揮發(fā)物變化較為規(guī)律(圖1)，故選用克新1號(hào)進(jìn)行信號(hào)物質(zhì)茉莉酸含量及關(guān)鍵酶活性研究，結(jié)果如圖2所示。與對(duì)照相比，4 g/株施鉀量均不能提高馬鈴薯葉片中茉莉酸含量和LOX活性(P>0.05)。6 g/株施鉀量卻顯著提高了馬鈴薯葉片中茉莉酸含量和LOX活性，兩者分別比對(duì)照提高了0.93、0.40倍。8 g/株施鉀量盡管也使茉莉酸含量和LOX活性有所升高，但與對(duì)照無顯著差異。LOX活性的變化規(guī)律與茉莉酸含量變化規(guī)律一致，說明不同處理中6 g/株施鉀量對(duì)馬鈴薯克新1號(hào)葉片茉莉酸含量和LOX活性影響最大。

圖2 不同施鉀量對(duì)克新1號(hào)葉片中茉莉酸含量及LOX活性的影響Fig.2 Effect of different potassium supply on jasmonic acid content and LOX activity of Kexin No.1 leaves

2.4 不同處理對(duì)克新1號(hào)葉片LOX蛋白表達(dá)量的影響

不同處理對(duì)LOX蛋白表達(dá)量的影響見圖3，Western雜交進(jìn)一步確定了LOX蛋白變化的有效性。與對(duì)照相比，4 g/株施鉀量并未使馬鈴薯葉片LOX蛋白表達(dá)量增加，但6、8 g/株施鉀量均上調(diào)了其LOX蛋白的表達(dá)量，從而使茉莉酸生成量增多，馬鈴薯抗性提高。

圖3 不同施鉀量對(duì)克新1號(hào)葉片中LOX蛋白表達(dá)影響的Western雜交分析Fig.3 Western blotting analysis of LOX protein of Kexin No.1 leaves after different potassium supply

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)條件下6 g/株施鉀量為馬鈴薯抗桃蚜的最佳施鉀量，此時(shí)桃蚜對(duì)施鉀馬鈴薯趨性行為顯著低于對(duì)照，馬鈴薯克新1號(hào)葉片中3-蒈烯、苯甲醛、檸檬烯和1,3-環(huán)己二烯 4種揮發(fā)物含量、茉莉酸含量及LOX活性均顯著提高。表明鉀肥能夠促進(jìn)茉莉酸合成，由此調(diào)節(jié)其下游揮發(fā)物含量，提高馬鈴薯的抗蟲性。

近年來的研究表明，植物的抗蟲能力與其營(yíng)養(yǎng)密切相關(guān)[14]。適量供鉀提高了小麥植株對(duì)鉀的吸收，促進(jìn)了植株生長(zhǎng)和總酚、酚酸、木質(zhì)素的合成及與代謝相關(guān)酶的活性，增強(qiáng)了小麥對(duì)蚜蟲的抗性[15]。鉀元素可通過提高苜蓿碳氮比，降低游離氨基酸含量，提高苜蓿對(duì)薊馬的耐害性[16]。當(dāng)小麥?zhǔn)艿窖料x危害后，充足供鉀激活了小麥體內(nèi)茉莉酸信號(hào)傳導(dǎo)途徑，顯著提高了茉莉酸含量，由此提高了防御酶活性，增強(qiáng)了小麥對(duì)蚜蟲的抵御能力[17]。用磷酸鉀處理小麥植株，可誘導(dǎo)其對(duì)俄羅斯小麥蚜蟲(Diuraphisnoxia)的耐受力[18]。上述研究結(jié)果與本研究結(jié)果一致，說明外源鉀的供應(yīng)可能影響了植物體內(nèi)茉莉酸相關(guān)基因的表達(dá)[1]。

植物的新陳代謝、生長(zhǎng)和抗逆反應(yīng)與細(xì)胞內(nèi)鉀含量有關(guān)。研究表明，鉀介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄和茉莉酸相關(guān)，其也是茉莉酸合成途徑中必需酶的組分[2]。本研究中，外源鉀濃度的增加，能夠激活植物體內(nèi)茉莉酸代謝途徑，使茉莉酸類物質(zhì)合成加速，從而調(diào)節(jié)揮發(fā)物的生成量，對(duì)植食性昆蟲起到防御作用。

養(yǎng)分的缺乏和過量脅迫均會(huì)影響植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育，引起一些生理生化過程的改變，這些改變可以引起大量蛋白質(zhì)種類和表達(dá)量發(fā)生變化。ZHANG等[7]研究了玉米對(duì)亞洲玉米螟的茉莉酸甲酯誘導(dǎo)防御反應(yīng)，確定了62種與茉莉酸甲酯誘導(dǎo)相關(guān)的蛋白質(zhì)，其中43種蛋白質(zhì)含量增加，11種蛋白質(zhì)含量降低，表明茉莉酸甲酯不僅能夠誘導(dǎo)植物對(duì)昆蟲的防御機(jī)制，而且也促進(jìn)了植物體內(nèi)有毒蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，以此對(duì)亞洲玉米螟進(jìn)行生物防治。本研究只對(duì)茉莉酸合成中的關(guān)鍵性酶(LOX)進(jìn)行了一些研究，其他相關(guān)蛋白質(zhì)與施鉀的關(guān)系有待于進(jìn)一步探討。