陳小玲，付肖巖，林建龍，林巧云，伍登煇，林芳峰

（福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州350003）

大腸管狀腺瘤是腺瘤中最主要的一種，也是公認(rèn)的癌前病變，相關(guān)數(shù)據(jù)顯示其癌變的轉(zhuǎn)化率高達(dá)4%～4.8%［1］。 管狀腺瘤的發(fā)生、發(fā)展過程伴隨著一系列基因蛋白表達(dá)的變化，其中突變型P53 蛋白（P53）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）、抑癌基因（PTEN）均參與了細(xì)胞增殖、凋亡及血管生成，被證實(shí)與多種包括腸癌在內(nèi)的惡性腫瘤發(fā)病相關(guān)。 本課題旨在通過檢測濕熱型大腸管狀腺瘤患者以及腸鏡檢查未見異常的健康者中P53、bFGF、PTEN 表達(dá)強(qiáng)度的差異，并探討三者在不同上皮內(nèi)瘤變（IN）程度中表達(dá)強(qiáng)度的不同。

1 臨床資料

1.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 管狀腺瘤、IN 程度的判定標(biāo)準(zhǔn)參照《消化系統(tǒng)腫瘤WHO 分類》（2012 年）中的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)［2］，其中IN 程度分為低級別上皮內(nèi)瘤變（LGIN）和高級別上皮內(nèi)瘤變（HGIN）。

1.2 中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn) 參照國家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)?？茀f(xié)作組制定的“大腸息肉診療方案”［3］辨為濕熱證。主證：①腹痛拒按，脹滿不適；②大便溏泄或黏液便；③泄下不爽而臭穢；④大便秘結(jié)；⑤便血；⑥舌質(zhì)偏紅，舌苔黃膩，脈弦滑或滑數(shù)。 次證：①口干喜飲；②口苦；③肛門灼熱墜脹；④里急后重；⑤小便短赤或黃；⑥頭身困重。 診斷需具備主證至少2 項(xiàng)＋次證至少2 項(xiàng)。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) ①年齡30～70 歲；②自愿加入研究并簽署知情同意書者。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) ①病理確診管狀腺瘤伴癌變或患有其他系統(tǒng)腫瘤者；②伴有明顯其他腸道疾病者；③妊娠、哺乳期婦女，或有心、肺、腎等重要臟器疾病者；④兼雜證型或無證可辨者。

1.5 一般資料 隨機(jī)選取2018 年2 月—2019 年10 月于我院消化內(nèi)鏡室行電子結(jié)腸鏡檢查確診為濕熱型大腸管狀腺瘤患者50 例為試驗(yàn)組，另隨機(jī)選取20 例腸鏡檢查未見異常的健康者為正常組。試驗(yàn)組男33 例，女17 例，年齡（55.82±6.76）歲，其中HGIN 者（HGIN 組）22 例，LGIN 者（LGIN 組） 28例。 正常組男9 例，女11 例，年齡（53.30±4.97）歲。

2 方 法

2.1 主要儀器及試劑 電子腸鏡（日本Olympus 公司，型 號：CF-H260AI）；高 頻 電 刀（德 國ERBE 公司，型號：ICC200）；染色機(jī)（美國Leica 公司，型號：ST5020）；Olympus 顯微鏡（日本OLYMPUYS 公司，型號：BX43）；濕盒、鼠抗人P53 單克隆抗體、兔抗人bFGF 多克隆抗體、兔抗人PTEN 多克隆抗體、DAB 顯色試劑（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）。

2.2 標(biāo)本采集 試驗(yàn)組采集濕熱型大腸管狀腺瘤患者電切術(shù)后瘤體為標(biāo)本，正常組以活檢鉗鉗取距肛約10～15 cm 處的腸黏膜組織為標(biāo)本。

2.3 免疫組織化學(xué)檢測步驟 先將組織包埋、切片（2～3 μm）、制片，放60 ℃烤箱中烘烤1 h 后浸泡在松節(jié)油中脫蠟；然后逐次放入無水乙醇、90%酒精、85%酒精、蒸餾水中各10 min；約2 L 枸緣酸緩沖液加入高壓鍋中，加熱沸騰后放入切片，然后加閥加熱1～2 min，流水冷卻壓力鍋后再用蒸餾水沖洗切片；滴加過氧化物酶阻斷劑，室溫下孵育10 min，PBS 緩沖液沖洗3 次；除去PBS 緩沖液后，于兩張玻片上分別滴加適當(dāng)量的P53、bFGF、PTEN 抗體，置于室溫下孵育60 min；后同樣用PBS 緩沖液反復(fù)沖洗3 次，取出玻片，保存于濕盒中；滴加二抗，室溫下孵育15～30 min 后，用PBS 緩沖液反復(fù)沖洗3次；滴加適度DAB 工作液后，室溫中孵育3～5 min，顯色完全后蒸餾水沖洗終止顯色；用蘇木精復(fù)染30 s～2 min，后將組織玻片浸入梯度酒精（75%～100%）中脫水，每級時間控制2 min；最后行透明、封片、攝片。

2.4 P53、bFGF、PTEN 表達(dá)強(qiáng)度判定 P53、PTEN定位于細(xì)胞核，bFGF 主要定位于細(xì)胞核，部分定位于細(xì)胞漿，均以清晰棕黃顯色為陽性。 采用半定量積分法［4］判定表達(dá)強(qiáng)度：每個切片隨機(jī)選不重復(fù)的5 個視野計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)，每個視野計(jì)數(shù)100 個腺瘤細(xì)胞，分別對每張切片的陽性細(xì)胞數(shù)及顯色程度進(jìn)行分級記分，最終由兩類積分乘值判定表達(dá)強(qiáng)度。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS20.0 軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用單因素方差分析，等級資料采用獨(dú)立樣本秩和檢驗(yàn)。

4 結(jié) 果

4.1 P53、bFGF、PTEN 在試驗(yàn)組和正常組表達(dá)強(qiáng)度比較 試驗(yàn)組中P53、bFGF 表達(dá)強(qiáng)度均明顯高于正常組（P＜0.05），PTEN 表達(dá)強(qiáng)度則低于正常組（P＜0.05），見表1。

表1 P53、bFGF、PTEN 在試驗(yàn)組和正常組表達(dá)強(qiáng)度比較

4.2 P53、bFGF、PTEN 在不同IN 程度組表達(dá)強(qiáng)度比較 P53、bFGF 在HGIN 組中表達(dá)強(qiáng)度明顯高于LGIN 組（P＜0.05），PTEN 在HGIN 組中表達(dá)強(qiáng)度明顯低于LGIN 組（P＜0.05），見表2。

表2 P53、bFGF、PTEN 在不同IN 程度組表達(dá)強(qiáng)度比較

5 討 論

腺瘤是結(jié)直腸癌癌前病變，通過對腺瘤早發(fā)現(xiàn)、早治療來防治腸癌已成為業(yè)內(nèi)共識［5］。 癌變過程并非一蹴而成，如何能提前發(fā)現(xiàn)，及時阻斷或延緩腺瘤癌變的發(fā)生發(fā)展，這對腸癌的防治具有重要意義。 目前，雖無統(tǒng)一的腺瘤辨證分型，但大多醫(yī)家認(rèn)為其病因是在先天不足的基礎(chǔ)上伴隨后天的脾胃損傷，脾虛不運(yùn)，痰濕內(nèi)蘊(yùn)大腸，日久化熱，發(fā)為腸瘤［6-7］。 可見，濕熱證是腺瘤臨床較為常見的證候類型［8-10］。

P53 是一種抑癌基因，但突變形成的突變型P53會誘發(fā)腫瘤的生成［11-12］。 bFGF 能通過促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂加速腫瘤生長，且通過誘導(dǎo)血管增殖來加速腫瘤轉(zhuǎn)移［13］。 PTEN 則是一種通過調(diào)控細(xì)胞周期來影響癌細(xì)胞增殖、凋亡的抑癌基因［14］。

本研究結(jié)果顯示：P53、bFGF 在試驗(yàn)組中的表達(dá)強(qiáng)度明顯高于正常組，而PTEN 的表達(dá)強(qiáng)度則明顯低于正常組；且試驗(yàn)組中P53、bFGF 在HGIN 組中表達(dá)較LGIN 組升高，PTEN 在HGIN 組中表達(dá)較LGIN 組下降。 可見，從正常黏膜到管狀腺瘤，從LGIN到HGIN 的瘤變過程中，存在著P53、bFGF 表達(dá)上調(diào)及PTEN 表達(dá)下調(diào)的現(xiàn)象，進(jìn)一步證實(shí)三者表達(dá)失衡對管狀腺瘤的瘤變進(jìn)展起到一定作用。 結(jié)合課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在大腸管狀腺瘤中P53 的高表達(dá)可能與濕熱證有關(guān)，濕熱證是一個應(yīng)引起重視的證型［15］。 本研究同樣顯示，濕熱證管狀腺瘤中P53 呈現(xiàn)高表達(dá)，提示其機(jī)體抑癌保護(hù)機(jī)制受損可能更為明顯。 因本試驗(yàn)的局限性，未能對各中醫(yī)證型與各蛋白表達(dá)強(qiáng)度的關(guān)聯(lián)進(jìn)行深入分析，有待未來進(jìn)一步完善相關(guān)研究。