施文榮，涂春香，陳 玲，余文珍，劉 艷

（福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州350122）

藥理研究發(fā)現(xiàn)：鴉膽子油口服乳液（brucea java oil emulsion，BJOE）有抗腫瘤作用，目前臨床已應(yīng)用于食管癌、胃癌、肝癌、肺癌等多種惡性腫瘤的治療［1-5］，但是BJOE 應(yīng)用于腫瘤治療中通常是與化療劑連用，起到輔助作用，單獨(dú)應(yīng)用BJOE 治療腫瘤的報道不多。 另外，關(guān)于鴉膽子作用機(jī)理方面研究發(fā)現(xiàn)，鴉膽子可通過抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和血管生成等機(jī)制抗腫瘤［6］。 抗氧化應(yīng)激也是腫瘤治療的常見機(jī)制，已知鴉膽子油具有一定的抗氧化作用［7］，但是也有報道指出，鴉膽子油能通過增強(qiáng)腫瘤組織的氧化損傷起到抗腫瘤作用［8］，存在矛盾。 所以有必要弄清氧化應(yīng)激在鴉膽子油抗癌效應(yīng)中的作用。

已知氧化應(yīng)激是食管癌的形成過程的重要因素［9-10］，亞硝胺類化合物是環(huán)境中普遍存在的強(qiáng)致癌污染物，是食管癌的常見誘因。 甲基芐基亞硝胺（MBNA）誘發(fā)的大鼠食管癌模型是目前公認(rèn)的食管癌化學(xué)預(yù)防模型，該模型病理形態(tài)改變與人食管鱗癌的發(fā)生順序平行［11］。本研究利用MBNA 誘發(fā)的大鼠食管癌模型探討B(tài)JOE 的抗腫瘤作用及與氧化應(yīng)激的關(guān)系，為BJOE 的藥理研究提供參數(shù)，也為BJOE的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 清潔級Wistar 雄性大鼠（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司），體質(zhì)量180～200 g，生產(chǎn)許可證：SCXK（滬）2012-0002。

1.1.2 藥物與試劑 MBNA 由本實(shí)驗(yàn)室有機(jī)合成；BJOE（沈陽藥大雷允上藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號：271601051）；RNA 組織保存液（上海華舜生物工程公司）；Trizol 試劑、SuperScript Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、定量PCR 檢測試劑盒［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；總抗氧化能力檢測試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；谷胱甘肽過氧化酶（GSH-Px）測試盒（南京建成生物工程研究所）；丙二醛（MDA）檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；所用引物由上海生工生物工程公司根據(jù)設(shè)計合成。

1.1.3 主要儀器 SDS-PAGE 電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad 公司）；熒光定量PCR 儀（德國Eppendorf 公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組與給藥 參考文獻(xiàn)［12］制備Wistar 大鼠食管癌模型，32 只大鼠隨機(jī)分成正常組8 只和造模組24 只，造模組以MBNA 3.5 mg／kg 每周2 次頸背部皮下注射，正常組頸背部皮下注射等體積氯化鈉注射液連續(xù)注射15 周。 成模大鼠按體重分層隨機(jī)分為模型組、BJOE 高劑量組（高劑量組）、BJOE低劑量組（低劑量組），每組8 只。 于第16 周開始，高、低劑量組分別以BJOE 12、6 mL／kg 灌胃給藥，模型組和正常組以6 mL／kg 蒸餾水灌胃，每日1 次，共10 周。 根據(jù)實(shí)驗(yàn)動物等效臨床劑量換算，高、低劑量組中藥給藥劑量相當(dāng)于成人日劑量（1 mL／kg）的2 倍和1 倍。

1.2.2 食管黏膜病理觀察 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時處死4 組大鼠，沿食管縱行剖開，于解剖鏡下觀察食管黏膜病變情況，拍照記錄。 取典型病變組織用10%中性福爾馬林固定液固定，常規(guī)制片，HE 染色，光鏡觀察病理組織學(xué)變化。 余下食管保存于RNA 保存液中，用于提取食管組織總RNA。

1.2.3 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測 各組大鼠食管癌造模15 周末，尾靜脈采血，分離各組血清；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死大鼠，分離各組血清待測。 取大鼠肝組織約200 mg液氮反復(fù)凍融3 次，加入0.1 moL／mL PBS（pH 7.2）1 mL，低溫研磨制備20%肝組織勻漿，4 ℃3 000 r／min 離心15 min，取上清于-80 ℃凍存?zhèn)溆?。血清及肝組織SOD、GSH-Px、總抗氧化能力、MDA 測定按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.4 基因轉(zhuǎn)錄水平檢測 抗氧化通路相關(guān)基因細(xì)胞色素P450 酶1A1（CYP1A1）、細(xì)胞色素P450 酶2E1（CYP2E1）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)硫酶M1（GSTM1）、醌氧化還原酶1（NQO1）、甲基轉(zhuǎn)移酶（MT）、乙?；D(zhuǎn)移酶（NAT）、亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）、轉(zhuǎn)錄因子NF-E2 相關(guān)因子2（Nrf2）、Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1（Keap1）轉(zhuǎn)錄水平檢測采用Real-time RT-PCR 法。 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用Trizol 法提取4 組大鼠食管組織總RNA，核酸蛋白分析儀檢測A260 nm／A280 nm 比值，計算RNA 濃度；瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 完整性。使用SuperScript Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA 中的mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA 為模板進(jìn)行熒光實(shí)時定量PCR 檢測（SYBR 染料法），擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃20 s，60 ℃20 s，72 ℃30 s，40 個循環(huán)。 反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)擴(kuò)增曲線和熔解曲線，以β-actin 為內(nèi)參基因， 用2-△△Ct值表示目的基因轉(zhuǎn)錄水平。 各基因引物及擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度見表1。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料屬正態(tài)分布的以（±s）表示，采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況觀察 實(shí)驗(yàn)過程中，正常組大鼠皮毛柔順，有光澤，對外界刺激反應(yīng)較靈敏；其余各組大鼠逐漸出現(xiàn)活動減少，食量下降，聳毛，毛色無光澤、易脫落，對外界刺激反應(yīng)較遲鈍等現(xiàn)象。

2.2 MBNA 誘變15 周及BJOE 作用10 周后造模組與正常組體質(zhì)量比較 見表2、表3。

表2 MBNA 誘變15 周造模組與正常組體質(zhì)量比較（±s）g

表2 MBNA 誘變15 周造模組與正常組體質(zhì)量比較（±s）g

注：與正常組比較，1） P＜0.01。

組別正常組造模組n 8 24造模前212.143±6.769 214.286±7.488造模后390.357±15.250 332.180±44.8751）

2.3 食管大體形態(tài)學(xué)及病理組織學(xué)變化 正常組大鼠食管黏膜光滑平整，未見明顯異常；模型組，高、低劑量組大鼠食管黏膜均出現(xiàn)全段病變，食管黏膜粗糙，黏膜表面有細(xì)小顆粒樣突起，出現(xiàn)乳突瘤樣改變，成瘤率為100%。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，高、低劑量組食管黏膜的病變程度與模型組比較未見明顯差異，結(jié)果見圖1。 病理組織學(xué)顯示：正常組大鼠食管黏膜上皮細(xì)胞1～3 層，細(xì)胞排列均勻，基底細(xì)胞層規(guī)整，未見異常改變；高、低劑量組病理組織學(xué)檢查結(jié)果與模型組無明顯差異，均表現(xiàn)為上皮細(xì)胞明顯增生，層次增多，細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞向管腔方向增生。 結(jié)果見圖2。

表3 BJOE 作用10 周造模組與正常組體質(zhì)量比較（±s）g

表3 BJOE 作用10 周造模組與正常組體質(zhì)量比較（±s）g

注：與正常組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.01。

組別正常組n 8造模組24治療前390.357±15.250 330.385±45.892 342.692±44.563 323.462±44.845治療后424.714±11.789 329.167±46.6101）338.100±41.9691）283.556±42.8961）2）

圖1 4 組大鼠食管黏膜大體形態(tài)觀察圖

圖2 4 組大鼠食管黏膜病理組織學(xué)光鏡圖（HE 染色，×200）

2.4 MBNA 誘變15 周2 組大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)及BJOE 作用10 周4 組大鼠血清及肝組織氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 見表4～表6。

2.5 4 組大鼠食管組織抗氧化相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平比較 見表7。

表4 MBNA 誘變15 周2 組大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)比較（±s）

表4 MBNA 誘變15 周2 組大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)比較（±s）

注：與正常組比較，1） P＜0.05，2） P＜0.01。

組別正常組造模組n 8 24 SOD／U 5.254±2.668 5.021±0.901 MDA／（mmol／L）87.767±5.899 156.306±42.2812）GSH-Px／U 1287.342±147.439 1443.987±147.2401）總抗氧化能力／（mmol／L）1.595±0.154 1.569±0.174

表5 BJOE 作用10 周4 組大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)比較（±s）

表5 BJOE 作用10 周4 組大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)比較（±s）

組別正 常 組模 型 組低劑量組高劑量組n 8 8 8 8 SOD／U 2.309±0.293 2.188±0.409 1.924±0.288 2.359±0.125 MDA／（mmol／L）236.561±21.980 253.166±30.055 250.236±68.908 255.119±19.946 GSH-Px／U 1246.078±80.947 1272.549±113.495 1223.529±119.399 1345.098±55.598總抗氧化能力／（mmol／L）1.057±0.176 0.952±0.071 0.808±0.152 0.944±0.212

表6 BJOE 作用10 周4 組大鼠肝組織氧化應(yīng)激指標(biāo)比較（±s）

表6 BJOE 作用10 周4 組大鼠肝組織氧化應(yīng)激指標(biāo)比較（±s）

注：與正常組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.05。

組別正 常 組模 型 組低劑量組高劑量組n 8 8 8 8 SOD／U 35.270±7.421 28.634±3.451 32.126±5.918 31.752±5.908 MDA／（mmol／L）18.446±2.657 22.263±5.515 18.421±3.930 30.422±10.3401）2）GSH-Px／U 243.345±33.750 223.441±56.195 179.836±57.228 232.266±46.722總抗氧化能力／（mmol／L）30.706±1.133 31.590±3.240 28.764±0.863 31.992±0.872

3 討 論

鴉膽子為苦木科植物，產(chǎn)于我國廣東、廣西、海南等地。BJOE 是以鴉膽子石油醚提取物為原料，以大豆磷脂為乳化劑制成的水包油型乳劑，主要成分為鴉膽子油和豆磷脂。 現(xiàn)代藥理研究表明：鴉膽子油具有一定的抗腫瘤作用，BJOE 可顯著抑制肝癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞等腫瘤細(xì)胞的生長［13］，可抑制S180 小鼠移植瘤的生長，對Lewis 肺癌、Heps肝癌裸鼠移植瘤模型也有明顯的抑制作用［14］。但是，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高、低劑量組與模型組比較，病理形態(tài)學(xué)與組織學(xué)均未有明顯改變：表明BJOE不能阻斷MBNA 誘導(dǎo)的大鼠食管癌變?？梢?，BJOE 雖然具有一定的抑癌作用，但是具有一定的選擇性，對MBNA 誘發(fā)的大鼠食管癌模型無效。考慮到目前單獨(dú)應(yīng)用BJOE 抗癌作用的研究對象多是體外細(xì)胞模型和小鼠移植瘤模型， 對化學(xué)預(yù)防模型無阻斷作用，所以BJOE 的抗癌作用尚存在疑義，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。

表7 4 組大鼠食管組織抗氧化相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平（±s）

表7 4 組大鼠食管組織抗氧化相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平（±s）

注：與正常組比較，1） P＜0.05，2） P＜0.01；與模型組比較，3） P＜0.05，4） P＜0.01。

組別正 常 組模 型 組低劑量組高劑量組組別正 常 組模 型 組低劑量組高劑量組n 8 8 8 8 n 8 8 8 8 CYP1A1 1.000±1.305 0.499±0.632 0.810±1.017 1.488±1.816 MT 1.000±1.300 0.453±0.284 1.999±2.917 1.593±2.167 CYP2E1 1.000±1.325 0.565±0.891 1.384±1.510 1.347±2.042 NAT 1.000±0.617 6.712±9.197 0.395±0.439 0.488±0.444 CAT 1.000±0.819 9.028±3.4601）7.627±8.056 2.034±0.7384）MTHFR 1.000±0.774 11.242±13.945 32.775±23.9041）46.954±6.0662）3）GSTM1 1.000±0.680 0.852±0.584 1.142±0.911 0.906±0.405 Nrf2 1.000±0.796 3.551±3.270 3.543±0.672 3.577±1.945 NQO1 1.000±0.733 0.188±0.167 0.614±0.714 0.740±0.885 Keap1 1.000±0.656 1.235±1.557 2.264±2.274 1.513±1.947

藥理研究表明：鴉膽子油具有一定的抗氧化作用。 然而我們前期研究發(fā)現(xiàn)：鴉膽子油提取物是通過增強(qiáng)腫瘤組織的氧化損傷起到抗腫瘤作用的，存在矛盾。 本研究探討商品化生產(chǎn)的BJOE 是否具有抗氧化作用，發(fā)現(xiàn)BJOE 作用10 周后，高劑量組肝勻漿MDA 含量顯著高于模型組，食管組織CAT 基因轉(zhuǎn)錄水平顯著低于模型組。 MDA 作為脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其含量增加表明體內(nèi)過氧化程度加?。?5-16］，CAT 基因轉(zhuǎn)錄水平降低說明體內(nèi)抗氧化的保護(hù)系統(tǒng)遭到一定的破壞，說明BJOE 對MBNA 誘發(fā)的模型大鼠食管癌變無抗氧化損傷作用，甚至加重了氧化應(yīng)激程度。

在食管癌誘變過程中，氧化應(yīng)激具有重要作用。誘變劑MBNA 在誘發(fā)食管癌模型過程中產(chǎn)生大量的自由基，引發(fā)的氧化應(yīng)激對食管癌病變具有重要的促進(jìn)作用。 另外，BJOE 在治療過程中也體現(xiàn)了加重氧化應(yīng)激的作用，已知抗癌藥抗腫瘤機(jī)制之一就是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生活性氧，損傷線粒體導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡［17］，可見氧化應(yīng)激對食管癌的發(fā)展進(jìn)程是把雙刃劍。

另外，我們研究發(fā)現(xiàn)，商品化生產(chǎn)的BJOE 與實(shí)驗(yàn)室經(jīng)乙醚浸提的鴉膽子油對MBNA 誘發(fā)的食管癌模型大鼠抗腫瘤作用有一定的差異：乙醚浸提的鴉膽子油顯示出更強(qiáng)的毒性作用，對模型大鼠有微弱的抗腫瘤作用［8］；而商品化生產(chǎn)的BJOE 對該模型未顯示出可見的抗腫瘤效應(yīng)。 出現(xiàn)這種結(jié)果，筆者認(rèn)為主要是因?yàn)閮煞N藥物提取方法不同引起成分不同導(dǎo)致，乙醚浸提的鴉膽子油含有更多毒性物質(zhì)。

最后，BJOE 在臨床多與化療聯(lián)用，以后相關(guān)抗癌藥理研究也應(yīng)當(dāng)結(jié)合化療劑綜合判定。