黃雅娜，張 鈴，林 煒

（福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州350122）

結(jié)直腸癌是全球排名第三的癌癥且死亡率居第四位［1］，目前臨床上治療結(jié)腸癌主要以手術(shù)切除為主，輔以放療、化療和靶向藥治療等。 近年來(lái)，中醫(yī)藥在治療結(jié)腸癌上取得了一定的進(jìn)展，其著重于減輕化療的毒副作用，改善癌癥患者生存質(zhì)量。 半枝蓮是臨床上常用于治療結(jié)腸癌的中藥，其性味辛、苦、寒，歸肺、肝、腎經(jīng)，具有清熱解毒、化瘀利尿、消腫止痛等功效。 據(jù)《中國(guó)藥典》記載，半枝蓮常單用或聯(lián)合應(yīng)用在肺癌、 乳腺癌和結(jié)直腸癌等腫瘤的治療，并取得了較好療效［2-4］。 本研究通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討半枝蓮對(duì)人結(jié)腸癌SW620 細(xì)胞的增殖和凋亡的影響。

1 材 料

1.1 細(xì)胞株 人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620 購(gòu)自上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.2 藥物提取 取半枝蓮全草，粉碎后用85%乙醇回流提取3 次，合并提取液，壓濃縮至無(wú)醇味，加水混懸后，用氯仿進(jìn)行萃取，即可得到半枝蓮氯仿極性部位提取物（ECSB），后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干待用。

1.3 試劑 RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶（美國(guó)Gibco 公司）；PBS 緩沖液、雙抗（青霉素和鏈霉素）購(gòu)自美國(guó)Hyclone 公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、SDS-PAGE 試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；DAPI 染色液、BCA試劑盒（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；PCNA、Survivin、GAPDH 一抗、HRP 二抗（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；PVDF 膜（美國(guó)GE 公司）。

1.4 儀器 CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；熒光顯微鏡（德國(guó)Leica 公司）；Infinite 200 PRO 多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan 公司）；垂直電泳槽、ChemiDocXRS+化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad 公司）。

2 方 法

2.1 ECSB 制備 稱(chēng)取200 mg ECSB 溶于1 mL DMSO，制備成200 mg／mL 母液，4 ℃保存，干預(yù)細(xì)胞時(shí)用RPMI-1640 完全培養(yǎng)基配置成所需濃度。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù) SW620 細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%雙抗的RPMI-1640 培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)；當(dāng)細(xì)胞匯合到80%左右后，用0.25%胰酶消化并傳代，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 實(shí)驗(yàn)分組：0 μg／mL 組、12.5 μg／mL 組、25 μg／mL 組、50 μg／mL 組、75 μg／mL 組。

2.3 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞按1.0×105個(gè)／mL 的密度接種于96 孔板，每孔100 μL；細(xì)胞貼壁后，加入0、12.5、25、50、75 μg／mL 的ECSB干預(yù)SW620 細(xì)胞24 h；24 h 后去除上清液， 加入100 μL MTT 于37 ℃孵育4 h；4 h 后去除MTT，再加入100 μL DMSO，用Infinite 200 PRO 多功能酶標(biāo)儀在490 nm 處檢測(cè)OD 值。 按照以下公式計(jì)算細(xì)胞活力：（實(shí)驗(yàn)組OD 值／對(duì)照組OD 值）×100%。

2.4 DAPI 染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)細(xì)胞，按照1×105個(gè)／mL 細(xì)胞密度接種于6 孔板中，每孔2 mL；加入0、25、50、75 μg／mL 的ECSB 干預(yù)SW620 細(xì)胞24 h 后，用PBS 洗滌3 次；用4%多聚甲醛固定細(xì)胞5 min，每孔加入2 μg／mL DAPI 500 μL，37 ℃避光15 min，用PBS 清洗3 次。 倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)細(xì)胞， 按照1×105個(gè)／mL 細(xì)胞密度接種于6 孔板中，每孔2 mL；加入0、50 μg／mL 的ECSB 干預(yù)SW620細(xì)胞24 h 和48 h 后， 棄去上清后，PBS 洗滌1 次；分別加入預(yù)冷的75%酒精固定4 h，PBS 洗滌3 次后加入500 μL PI，4 ℃避光染色30 min。 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

2.6 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)細(xì)胞中PCNA、Survivin 蛋白的表達(dá)情況 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)細(xì)胞，按照1×105個(gè)／mL 細(xì)胞密度接種于6 孔板中，每孔2 mL；加入0、25、50、75 μg／mL 的ECSB 干預(yù)SW620 細(xì)胞24 h 后，用PBS 洗滌1 次；收集細(xì)胞后加入蛋白裂解液，渦旋4 次，每次靜置5 min，后12 000 rpm／min 離心20 min，吸取上清液即為所收集的蛋白樣品。 用BCA 法進(jìn)行蛋白定量，后加入5×SDS上樣緩沖液，95 ℃金屬浴變性5～10 min。以50 μg 上樣量進(jìn)行垂直電泳跑膠，電壓條件為：濃縮膠80 V，30 min；分離膠120 V，55 min。 用PVDF 膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件為110 V，60 min。 轉(zhuǎn)膜后，用5%脫脂奶粉封閉液封閉1 h，封閉后用PCNA（1∶1 000）和Survivin（1∶1 000）的一抗4 ℃搖床孵育過(guò)夜，TBST 洗3 次，5 min／次； 用HRP 二抗（Rabbit，1∶10 000）室 溫 孵 育1 h，TBST 洗3 次，5 min／次。 最后用ECL 試劑顯影成像。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 計(jì)量資料屬正態(tài)分布的以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析，非正態(tài)分布的采用秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。

3 結(jié) 果

3.1 4 組抑制SW620 細(xì)胞活力比較 MTT 結(jié)果表明不同濃度（12.5、25、50、75 μg／mL）的ECSB 可顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞SW620 的活力，并呈現(xiàn)明顯的劑量依賴(lài)，見(jiàn)表1。

表1 4 組抑制SW620 細(xì)胞活力比較（±s）

表1 4 組抑制SW620 細(xì)胞活力比較（±s）

注：與0 μg／mL 組比較，1） P＜0.01。

組別0 μg／mL 組12.5 μg／mL 組25 μg／mL 組50 μg／mL 組75 μg／mL 組細(xì)胞活力／%100.0±2.0 89.0±1.01）58.5±1.11）43.4±0.51）38.2±0.31）n 6 6 6 6 6

3.2 4 組對(duì)SW620 細(xì)胞凋亡和增殖影響的比較不同濃度（25、50、75 μg／mL）ECSB 處理SW620 細(xì)胞24 h 后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行DAPI 染色，結(jié)果顯示：在ECSB 干預(yù)后出現(xiàn)了細(xì)胞核固縮，核碎裂，說(shuō)明ECSB能促進(jìn)SW620 細(xì)胞的凋亡，見(jiàn)圖1（箭頭所示）、表2。利用流式技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，結(jié)果顯示：用50 μg／mL ECSB 處理SW620 細(xì)胞24 h 后，其S 期與對(duì)照組無(wú)顯著性差異（P＞0.05），而進(jìn)一步干預(yù)48 h 后，其S 期出現(xiàn)明顯的阻滯，說(shuō)明ECSB 能抑制SW620細(xì)胞的增殖，見(jiàn)表3。

圖1 4 組SW620 細(xì)胞凋亡情況（×40）

表2 4 組促進(jìn)SW620 細(xì)胞凋亡比較（±s）

表2 4 組促進(jìn)SW620 細(xì)胞凋亡比較（±s）

注：與0 μg／mL 組比較，1） P＜0.01。

組別0 μg／mL 組25 μg／mL 組50 μg／mL 組75 μg／mL 組凋亡率／%2.7±0.1 6.5±0.71）9.5±1.21）31.8±1.41）n 3 3 3 3

表3 2 組抑制SW620 細(xì)胞增殖比較（±s）

表3 2 組抑制SW620 細(xì)胞增殖比較（±s）

注：與0 μg／mL 組比較，1） P＜0.05。

組別0 μg／mL 組50 μg／mL 組細(xì)胞S 期／%24 h 23.8±0.8 29.1±1.7 48 h 22.8±1.3 33.2±2.31）

3.3 4 組SW620 細(xì)胞中PCNA 和Survivin 表達(dá)不同濃度（25、50、75 μg／mL）ECSB 處理SW620 細(xì)胞24 h 后，檢測(cè)細(xì)胞中PCNA 和Survivin 的表達(dá)，結(jié)果顯示：與0 μg／mL 組比較，75 μg／mL 的ECSB能明顯降低Survivin 和PCNA 的表達(dá)（P 均＜0.05），見(jiàn)圖2、圖3、圖4。

4 討 論

結(jié)直腸癌屬中醫(yī)“鎖肛痔”“積聚”“腸覃”“腸癖”等范疇。 中醫(yī)認(rèn)為結(jié)直腸癌病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，治療上以清熱解毒，活血化瘀為治療原則［5］。 中醫(yī)治療腫瘤的臨床用藥和實(shí)驗(yàn)研究中，有60%以上的中藥為清熱解毒類(lèi)藥物［6］。半枝蓮屬唇形科多年生草本，歸屬清熱解毒類(lèi)中藥，現(xiàn)代研究表明：半枝蓮中多種有效活性化學(xué)成分具有良好的抗腫瘤活性，對(duì)治療肺癌、乳癌、肝癌、胃癌、結(jié)直腸癌等惡性腫瘤療效顯著［7］。

圖2 4 組SW620 細(xì)胞PCNA 和Survivin 蛋白表達(dá)電泳圖

圖3 4 組對(duì)SW620 細(xì)胞PCNA 蛋白表達(dá)比較

圖4 4 組SW620 細(xì)胞Survivin 蛋白表達(dá)比較

中藥治療腫瘤有兩個(gè)方面藥理機(jī)制：一是抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖，從而阻止腫瘤的增大和擴(kuò)散；二是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡壞死，進(jìn)而使腫瘤組織縮小、消退。 本研究通過(guò)DAPI 染色和流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)證明：25、50、75 μg／mL 的ECSB 干預(yù)結(jié)腸癌細(xì)胞SW620 后呈現(xiàn)出較高的凋亡率，提示ECSB 抑制細(xì)胞增殖可能通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡導(dǎo)致，從而達(dá)到抗腫瘤效果［8-9］。

細(xì)胞周期調(diào)控異常引起腫瘤細(xì)胞增殖失控是惡性腫瘤基本的生物學(xué)特征［10］。 PCNA 為增殖細(xì)胞核抗原， 其表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞增殖呈正相關(guān)，已成為反映細(xì)胞增殖的標(biāo)記物之一。 Lin Wei 等［11］通過(guò)建立小鼠結(jié)腸癌皮下移植瘤模型，發(fā)現(xiàn)夏枯草可以通過(guò)顯著抑制PCNA 的表達(dá)，從而起到促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖。 細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞自主的程序性死亡，可以維持機(jī)體的正常運(yùn)轉(zhuǎn)，而在腫瘤細(xì)胞中，其細(xì)胞凋亡調(diào)控機(jī)制失常［12］。Survivin 是凋亡抑制基因家族的成員之一，具有抑制細(xì)胞死亡和控制有絲分裂的功能。 Survivin在大多數(shù)健康成人組織中檢測(cè)不到，而幾乎在所有人類(lèi)腫瘤中均顯著表達(dá)。 在結(jié)腸直腸癌患者中，Survivin 的高表達(dá)與不良預(yù)后、生存期縮短以及體內(nèi)腫瘤細(xì)胞凋亡減少有關(guān)［13］。 Yujiro Fujie 等 認(rèn)為Survivin 是細(xì)胞凋亡和有絲分裂突變的關(guān)鍵分子，奧沙利鉑能有效抑制Survivin，與某些化學(xué)試劑聯(lián)合使用時(shí)，可通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡和有絲分裂突變而發(fā)揮明顯的作用［14］。本研究發(fā)現(xiàn)：ECSB 可能是通過(guò)下調(diào)SW620 細(xì)胞的Survivin 促進(jìn)SW620 細(xì)胞的凋亡，通過(guò)下調(diào)PCNA 來(lái)抑制細(xì)胞的增殖，從而最終顯著抑制SW620 細(xì)胞的活力。

本研究探討半枝蓮對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡方面的影響，為其臨床治療結(jié)直腸癌提供科學(xué)依據(jù)。 但腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡受到眾多機(jī)制的復(fù)雜調(diào)控，半枝蓮對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖及凋亡是否涉及其他信號(hào)通路，有待進(jìn)一步研究探討。