李強勇 李旻 曾地剛 朱威霖 彭敏 楊春玲 劉青云 趙永貞 陳秀荔 陳曉漢

摘要：【目的】基于第三代高通量測序技術(shù)——單分子實時（SMRT）測序開發(fā)凡納濱對蝦微衛(wèi)星分子標(biāo)記，為凡納濱對蝦的遺傳育種研究提供基礎(chǔ)資料?！痉椒ā坎捎肧MRT測序?qū)Ψ布{濱對蝦轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序，經(jīng)Illumina測序糾錯后利用MISA對獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析;以Primer 3.0設(shè)計微衛(wèi)星引物，隨機(jī)挑選40對微衛(wèi)星引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗證，并選用擴(kuò)增成功且具有多態(tài)性的微衛(wèi)星引物用于不同養(yǎng)殖家系凡納濱對蝦遺傳多態(tài)性分析?！窘Y(jié)果】凡納濱對蝦轉(zhuǎn)錄組SMRT測序共獲得51367條非冗余全長轉(zhuǎn)錄本序列，鑒定出39674條微衛(wèi)星序列;微衛(wèi)星的分布密度為0.232 SSR/kb;以二核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星序列分布最多，共有22223條（占56.01%）。隨機(jī)選取的40對微衛(wèi)星引物中有26對微衛(wèi)星引物能成功擴(kuò)增出特異性條帶;微衛(wèi)星熒光分型結(jié)果顯示，有16個微衛(wèi)星位點具有多態(tài)性，共獲得67個等位基因，平均等位基因數(shù)（Na）為4.2個，計算獲得的平均觀測雜合度（Ho）為0.511，平均期望雜合度（He）為0.451，平均多態(tài)性信息含量（PIC）為0.489。在16個微衛(wèi)星位點中，有2個微衛(wèi)星位點為低度多態(tài)性（PIC<0.25），6個微衛(wèi)星位點為中度多態(tài)性（0.250.50）;有4個微衛(wèi)星位點偏移Hardy-Weinberg平衡（P<0.05），其余12個微衛(wèi)星位點均未偏離Hardy-Weinberg平衡（P>0.05）。【結(jié)論】采用SMRT測序開發(fā)凡納濱對蝦微衛(wèi)星分子標(biāo)記是一種簡單而高效的途徑，有助于開展凡納濱對蝦的遺傳育種研究工作。

關(guān)鍵詞： 凡納濱對蝦;單分子實時（SMRT）測序;微衛(wèi)星分子標(biāo)記;多態(tài)性分析

中圖分類號： S917.4? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）02-0429-08

Development of microsatellite markers of Litopenaeus vannamei and genetic polymorphism analysis of different cultured families

LI Qiang-yong， LI Min， ZENG Di-gang， ZHU Wei-lin， PENG Min， YANG Chun-ling， LIU Qing-yun， ZHAO Yong-zhen， CHEN Xiu-li， CHEN Xiao-han*

（Guangxi Academy of Fishery Sciences/Guangxi Key Laboratory of Aquatic Genetic Breeding and Healthy

Aquaculture， Nanning? 530021， China）

Abstract：【Objective】Microsatellite markers of Litopenaeus vannamei based on the third-generation high-throughput sequencing technology， single-molecule real-time （SMRT） sequencing were developed in order to provide basic data for genetic and breeding research of L. vannamei. 【Method】The transcriptome of L. vannamei was sequenced using SMRT. The obtained transcriptome data were corrected by Illumina sequencing， then analyzed by MISA software. The microsatellite primers were designed with Primer 3.0 software， and 40 pairs of microsatellite primers were randomly selected for PCR amplification.? Microsatellite primers with successful amplification and polymorphism were selected for genetic polymorphism analysis of L. vannamei in different breeding families. 【Result】In total， 51367 non-redundant full length transcript sequences and 39674 SSR loci were obtained? by SMRT sequencing of the L. vannamei transcriptome. The distribution density of microsatellites was 0.232 SSR/kb; the dinucleotide repeat microsatellite sequences were the most distribu-ted， with a total of 22223（56.01%）. Of the 40 randomly selected microsatellite primers， 26 pairs of microsatellite primers successfully amplified specific bands. The microsatellite fluorescence phenotyping showed that 16 microsatellite loci were polymorphic. A total of 67 alleles were obtained， and the average number of alleles（Na） was 4.2. The calculated average observed heterozygosity（Ho） was 0.511， the average expected heterozygosity（He） was 0.451，and the average polymorphism information content（PIC） was 0.489. Among the 16 microsatellite loci， 2 loci were low polymorphisms （PIC<0.25）， 6 loci were moderate polymorphisms（0.25 0.50）;4 microsatellite loci deviated from Hardy-Weinberg equilibrium（P<0.05）， and the remaining 12 loci did not deviate from Hardy-Weinberg equilibrium（P>0.05）. 【Conclusion】Using SMRT sequencing to develop microsatellite markers of L. vannamei is a simple and efficient way， which is helpful for the genetic and breeding research of L. vannamei.

Key words： Litopenaeus vannamei; single molecule real-time sequencing; microsatellite markers; polymorphism analysis

Foundation item： Guangxi Innovation Driven Development Project（Guike AA17204088-1）; National Fishery Science Data Center Observation and Detection Project of Agricultural Basic Long-term Scientific and Technological Work（ZX08S211664）; Science and Technology Plan Project of Guangxi Aquatic Animal Husbandry and Veterinary Bureau （Guiyumuke 201633015）; Guangxi Key Laboratory of Genetic Breeding and Healthy Breeding Opening Project （17-A-04-04）

0 引言

【研究意義】凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）又稱為南美白對蝦，是世界上養(yǎng)殖最廣泛的甲殼類動物（陳錨等，2008）。凡納濱對蝦具有耐高溫、抗病力強、出肉率高、營養(yǎng)豐富、生長速度快及鹽度適應(yīng)范圍廣等特點，現(xiàn)已發(fā)展成為對蝦養(yǎng)殖的重要對象（王興強等，2004;黃薇等，2014）。1988年，中國科學(xué)院海洋研究所首次引進(jìn)凡納濱對蝦，并于1992年突破人工繁殖難關(guān)，之后凡納濱對蝦在全國范圍內(nèi)廣泛養(yǎng)殖，且各地不斷從國外引進(jìn)親蝦用于蝦苗生產(chǎn)（王興強等，2004），如今凡納濱對蝦已成為我國對蝦養(yǎng)殖的主導(dǎo)品種。但近年來凡納濱對蝦病害發(fā)生頻繁，包括白斑綜合征、桃拉綜合征、傳染性皮下及造血組織壞死病和弧菌病等，給其養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失（Lightner，2011）。我國養(yǎng)殖的凡納濱對蝦主要是從國外引進(jìn)的品種或品系，且多為雜交后代，遺傳背景較復(fù)雜，繁育多代后其性狀出現(xiàn)分離，表現(xiàn)為群體生長速度減慢、抗病和抗逆能力減弱等（熊建華等，2011）。因此，急需研發(fā)出有效的分子標(biāo)記技術(shù)用于凡納濱對蝦種質(zhì)資源鑒定及分子標(biāo)記選育等研究工作。【前人研究進(jìn)展】微衛(wèi)星（Microsatellite）又稱簡單重復(fù)序列（Simple sequence repeats，SSR），由2～6個核苷酸的串聯(lián)重復(fù)片段構(gòu)成，是目前應(yīng)用較廣泛的分子標(biāo)記之一（盛巖等，2002;周大顏等，2019）。因其穩(wěn)定性和可重復(fù)性高，且具有特異性和共顯性的特點，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于動植物的生物遺傳多樣性分析、種質(zhì)資源鑒定及分子標(biāo)記等研究領(lǐng)域（孫效文等，2008;張麗穎等，2009;凌士鵬等，2018）。凡納濱對蝦微衛(wèi)星分子標(biāo)記在1996年已有報道（Garcia et al.，1996）;而Meehan等（2003）最早實現(xiàn)批量開發(fā)微衛(wèi)星分子標(biāo)記，通過構(gòu)建基因組DNA文庫和使用探針篩選的方法共得包含573個微衛(wèi)星的173條序列。隨著第二代高通量測序技術(shù)的發(fā)展，已有學(xué)者采用高通量測序技術(shù)開發(fā)凡納濱對蝦微衛(wèi)星分子標(biāo)記的研究報道。馬寧和曾地剛（2013）運用454高通量測序技術(shù)篩選出588條凡納濱對蝦微衛(wèi)星序列;Yu等（2014）利用Illumina HiSeq 2000測序技術(shù)查找凡納濱對蝦SNP位點;楊銘等（2017）采用Illumina測序技術(shù)進(jìn)行凡納濱對蝦轉(zhuǎn)錄組測序，結(jié)果鑒定獲得14767條微衛(wèi)星序列;Lu等（2018）通過對凡納濱對蝦進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，篩選出49個與氨相關(guān)的SNPs位點，且進(jìn)一步鑒定發(fā)現(xiàn)有12個SNPs位點與氨耐受性相關(guān);Santos等（2018）通過RNA測序技術(shù)（RNA-seq）分析鑒定了與凡納濱對蝦免疫應(yīng)答及生長性能相關(guān)的SNP位點?！颈狙芯壳腥朦c】單分子實時（Single-molecule real-time，SMRT）測序是近年來由Pacific Biosciences公司開發(fā)的第三代高通量測序技術(shù)，為實現(xiàn)全長單分子DNA序列的直接測序提供了平臺（Eid et al.，2009）。SMRT測序長度可達(dá)20 kb，能對完整的cDNA分子進(jìn)行測序，而無需片段化或測序后組裝（Roberts et al.，2013），但至今未見將SMRT測序應(yīng)用于凡納濱對蝦微衛(wèi)星分子標(biāo)記開發(fā)的研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】利用SMRT測序?qū)Ψ布{濱對蝦全長轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序分析，從獲得的全長RNA序列中篩選微衛(wèi)星序列并設(shè)計微衛(wèi)星引物，隨機(jī)挑選微衛(wèi)星引物對不同養(yǎng)殖家系凡納濱對蝦進(jìn)行遺傳多態(tài)性分析，為凡納濱對蝦的遺傳育種研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試桂海1號凡納濱對蝦由廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院南美白對蝦遺傳育種中心提供。取6尾凡納濱對蝦的肌肉、心臟和肝胰腺組織，混合后置于液氮中保存?zhèn)溆谩臒o特定病原的桂海1號凡納濱對蝦種質(zhì)庫中隨機(jī)取16個不同養(yǎng)殖家系，對蝦平均體長16.0 cm，平均體質(zhì)量26.8 g/尾，取肌肉組織置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2 總RNA提取

按TRIzol LS Reagent試劑盒（Invitrogen，美國）說明從混合的凡納濱對蝦組織中提取總RNA，使用DNase I（Invitrogen，美國）除去基因組DNA。采用NanoDrop 2000（Thermo Scientific，美國）測量總RNA的純度（OD260/280）、濃度和吸收峰，并以Agilent 2100 Bioanalyser（美國）測定總RNA質(zhì)量，RIN（RNA integrity number）>7的總RNA用于構(gòu)建SMRT測序的cDNA文庫。

1. 3 SMART測序

使用SMARTer PCR cDNA Synthesis Kit（TaKaRa，日本）將10 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以BluePippinTM系統(tǒng)（Sage Science，美國）構(gòu)建5個大小分別為<1 kb、1～2 kb、2～3 kb、3～6 kb和>6 kb的cDNA文庫。按照PacBio的步驟每個cDNA文庫在PacBio RSII平臺上使用C4試劑進(jìn)行SMART測序;同時使用TruSeq RNA試劑盒（Illumina，美國）構(gòu)建Illumina凡納濱對蝦cDNA文庫，在HiSeq2500高通量測序儀上進(jìn)行測序，測序結(jié)果用于SMART測序數(shù)據(jù)的錯誤糾正。

1. 4 微衛(wèi)星序列鑒定及引物設(shè)計

對SMRT測序的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控及Illumina測序糾錯后獲得高質(zhì)量的全長轉(zhuǎn)錄本序列，利用MISA（http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/）搜尋SSR重復(fù)基元的區(qū)間。MISA參數(shù)設(shè)置如下：2-6、3-5、4-5、5-5、6-5，復(fù)合微衛(wèi)星分子標(biāo)記的最大長度100 bp;然后采用Primer 3.0設(shè)計微衛(wèi)星序列的引物。

1. 5 微衛(wèi)星引物驗證

從批量設(shè)計的微衛(wèi)星引物中隨機(jī)挑選40對（表1），委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。不同養(yǎng)殖家系對蝦肌肉組織分別采用動物基因組提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取DNA，DNA經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢查無降解后使用紫外分光光度計測其濃度，以TE（pH 8.0）稀釋至50 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR反應(yīng)體系50.0 μL：基因組DNA模板20 ng，2×Taq MasterMix 25.0 μL ，正、反向引物（10 μmol/L）各2.0 μL，超純水補足至50.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性1 min;94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，進(jìn)行35個循環(huán);72 ℃延伸5 min。以2.0%瓊脂糖凝膠在1×TAE緩沖液中150 V下電泳30 min，凝膠成像系統(tǒng)拍照。選取PCR擴(kuò)增成功的微衛(wèi)星引物在其正向引物5'端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)，并對16尾凡納濱對蝦DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至上海邁浦生物科技有限公司，在ABI 3730測序儀上進(jìn)行熒光分型。

1. 6 微衛(wèi)星數(shù)據(jù)分析

獲得不同養(yǎng)殖家系凡納濱對蝦的微衛(wèi)星分型數(shù)據(jù)后，使用PopGen32計算每個微衛(wèi)星位點的等位基因數(shù)（Na）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）及多態(tài)信息含量（PIC）。

2 結(jié)果與分析

2. 1 凡納濱對蝦微衛(wèi)星數(shù)量及其分布密度

凡納濱對蝦轉(zhuǎn)錄組SMRT測序共獲得51367條非冗余全長轉(zhuǎn)錄本序列（GenBank登錄號SRX3267788～ SRX3267801），利用MISA對這些轉(zhuǎn)錄本序列進(jìn)行分析，共獲得39674條微衛(wèi)星序列，分布在29461條轉(zhuǎn)錄本序列中，包含微衛(wèi)星的序列占總序列的57.35%。序列拼接總長度為171322994 bp，微衛(wèi)星的分布密度為0.232 SSR/kb，平均每4.32 kb出現(xiàn)1條微衛(wèi)星序列。各核苷酸重復(fù)類型的凡納濱對蝦微衛(wèi)星數(shù)量差異明顯，其分布密度也存在明顯差異。在所鑒定的39674條凡納濱對蝦微衛(wèi)星序列（表2）中，二核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星序列分布最多，共有22223條（占56.01%）;三核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星序列14781條（占37.26%），四核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星序列1947條（占4.91%），六核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星序列441條（占1.11%）;分布最少的是五核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星序列，僅有282條（占0.71%）。

2. 2 凡納濱對蝦微衛(wèi)星不同重復(fù)類型中各核苷酸重復(fù)單元的數(shù)量與頻率

凡納濱對蝦微衛(wèi)星二核苷酸重復(fù)類型中不同重復(fù)單元的數(shù)量分布情況如圖1所示，以含AT/TA重復(fù)單元的微衛(wèi)星序列數(shù)量最多，其次是CA/TG重復(fù)單元和GA/TC重復(fù)單元，AC/GT重復(fù)單元和AG/CT重復(fù)單元的數(shù)量差異不明顯。凡納濱對蝦微衛(wèi)星三核苷酸重復(fù)類型中不同重復(fù)單元的數(shù)量分布情況如圖2所示，以含CTC/GAG重復(fù)單元的微衛(wèi)星序列數(shù)量最多，其次是AAT、TTA/TAA、CTG/CAG和AGC/GCT等重復(fù)單元。

2. 3 微衛(wèi)星分子標(biāo)記驗證結(jié)果

根據(jù)鑒定出的39674條微衛(wèi)星序列，利用Pri-mer 3.0設(shè)計39367對微衛(wèi)星引物。為驗證設(shè)計的微衛(wèi)星引物能否通過PCR擴(kuò)增出微衛(wèi)星序列，隨機(jī)選取40對微衛(wèi)星引物，在桂海1號凡納濱對蝦DNA混池中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有26對微衛(wèi)星引物能成功擴(kuò)增出特異性條帶（圖3），占所選PCR擴(kuò)增引物數(shù)量的65.00%。為進(jìn)一步驗證微衛(wèi)星的多態(tài)性，以篩選出的26對微衛(wèi)星引物分別對16個不同養(yǎng)殖家系凡納濱對蝦個體DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在ABI 3730測序儀上進(jìn)行熒光分型（圖4），并采用GeneMarker 3.0.0分析分型結(jié)果。經(jīng)微衛(wèi)星分型后有16個微衛(wèi)星位點顯示出多態(tài)性（表3），多態(tài)性位點的等位基因數(shù)在2～8，共獲得67個等位基因，平均Na為4.2個，計算獲得的平均Ho為0.511，平均He為0.451，平均PIC為0.489。依據(jù)Botstein等（1980）的判斷標(biāo)準(zhǔn)：PIC<0.25代表該位點具有低度多態(tài)性，0.250.50代表該位點具有高度多態(tài)性。在16個微衛(wèi)星位點中，有2個微衛(wèi)星位點為低度多態(tài)性，6個微衛(wèi)星位點為中度多態(tài)性，其余8個微衛(wèi)星位點為高度多態(tài)性。此外，Hardy-Weinberg平衡檢驗結(jié)果顯示有4個微衛(wèi)星位點偏移Hardy-Weinberg平衡外（P<0.05），其余12個微衛(wèi)星位點均未偏離Hardy-Weinberg平衡（P>0.05）。

3 討論

微衛(wèi)星分子標(biāo)記對開展水產(chǎn)動物遺傳學(xué)研究具有重要意義。為開發(fā)凡納濱對蝦微衛(wèi)星分子標(biāo)記，本研究采用第三代高通量測序技術(shù)——SMRT測序?qū)Ψ布{濱對蝦轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序，結(jié)果在獲得51367條非冗余全長轉(zhuǎn)錄本序列中鑒定出39674條微衛(wèi)星序列，并設(shè)計39367對微衛(wèi)星引物。Meehan等（2003）通過傳統(tǒng)的構(gòu)建文庫和探針篩選僅發(fā)現(xiàn)573個凡納濱對蝦微衛(wèi)星，楊銘等（2017）采用高通量測序技術(shù)則鑒定獲得14767條凡納濱對蝦微衛(wèi)星序列?？梢姡酶咄繙y序技術(shù)開發(fā)微衛(wèi)星分子標(biāo)記的優(yōu)勢在于能大規(guī)模發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星序列，極大豐富凡納濱對蝦微衛(wèi)星分子標(biāo)記的數(shù)量。本研究在分析凡納濱對蝦轉(zhuǎn)錄組微衛(wèi)星數(shù)量及其分布密度時發(fā)現(xiàn)，不同類型重復(fù)單元的微衛(wèi)星數(shù)量差異較明顯，其分布密度也存在明顯差異，其中，二核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星序列分布最多，與馬寧和曾地剛（2013）、楊銘等（2017）采用高通量測序得到的凡納濱對蝦轉(zhuǎn)錄組微衛(wèi)星結(jié)果一致。微衛(wèi)星的分布密度為0.232 SSR/kb，高于楊銘等（2017）采用第二代高通量測序技術(shù)獲得的凡納濱對蝦轉(zhuǎn)錄組微衛(wèi)星分布密度（0.215 SSR/kb），究其原因可能是本研究測序獲得的RNA序列較長，雖然獲得的非冗余全長轉(zhuǎn)錄本序列數(shù)量（51367條）略少于楊銘等（2017）采用第二代高通量測序技術(shù)獲得的非冗余全長轉(zhuǎn)錄本序列數(shù)量（66815條），但相對較長的RNA序列可鑒定出更多微衛(wèi)星位點。說明采用第三代測序技術(shù)開發(fā)微衛(wèi)星分子標(biāo)記更具優(yōu)勢。

為驗證設(shè)計的微衛(wèi)星引物，隨機(jī)挑選40對微衛(wèi)星引物對桂海1號凡納濱對蝦DNA混池進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有26對微衛(wèi)星引物擴(kuò)增成功（占65.00%）。進(jìn)一步的微衛(wèi)星分型結(jié)果顯示，在26對成功擴(kuò)增的微衛(wèi)星引物中有16對在不同養(yǎng)殖家系凡納濱對蝦個體DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物中具有多態(tài)性，表明本研究開發(fā)獲得的這些微衛(wèi)星分子標(biāo)記有相當(dāng)高的比例可用于凡納濱對蝦遺傳學(xué)研究。Na、PIC及遺傳雜合度（H）是檢測種群遺傳多樣性的主要指標(biāo)。本研究挑選的16個微衛(wèi)星位點的Na在2～9個，平均為4.2個，符合用于遺傳多樣性評估的微衛(wèi)星至少具有4個等位基因的標(biāo)準(zhǔn)（Wajid et al.，2014）。Botstein等（1980）認(rèn)為：PIC<0.25代表該位點具有低度多態(tài)性，0.250.50代表該位點具有高度多態(tài)性。本研究發(fā)現(xiàn)在16個微衛(wèi)星位點中，有2個微衛(wèi)星位點為低度多態(tài)性，6個微衛(wèi)星位點為中度多態(tài)性，其余8個微衛(wèi)星位點為高度多態(tài)性，表明桂海1號凡納濱對蝦群體尚具有較豐富的遺傳變異。

H是衡量群體遺傳變異的最適參數(shù)，是指群體中某個位點上的雜合子頻率，主要反映群體的遺傳變異程度（Shikano and Taniguchi，2002）;PIC與基因突變率有關(guān)（Gyapay et al.，1994），因此，通過H和PIC能反映群體內(nèi)個體遺傳變異程度，其數(shù)值高低與遺傳變異程度呈正相關(guān)。本研究中，不同養(yǎng)殖家系凡納濱對蝦的平均Ho為0.511、平均He為0.451，群體的雜合度及遺傳多樣處于中等水平。雜合子缺失現(xiàn)象的產(chǎn)生可能是研究對象數(shù)量有限、近親雜交或人為干擾等因素導(dǎo)致稀有堿基缺失所致（Antoro et al.，2006）。Hardy-Weinberg平衡檢驗是評估樣本代表性及其基因分型質(zhì)量的重要工具（Crane et al.，2004），樣本群體小、近親交配、等位基因突變等均可導(dǎo)致所檢測的種群基因型偏離Hardy-Weinberg平衡（宋煒等，2017）。本研究所分析的16個微衛(wèi)星多態(tài)性位點在16尾不同養(yǎng)殖家系凡納濱對蝦中，有12個微衛(wèi)星位點滿足Hardy-Weinberg平衡，有4個微衛(wèi)星點位偏離Hardy-Weinberg平衡，表明不同養(yǎng)殖家系凡納濱對蝦群體遺傳結(jié)構(gòu)尚處于相對穩(wěn)定狀態(tài)。

SMRT測序是近年來新出現(xiàn)的第三代測序技術(shù)，是通過觀測單個DNA聚合酶合成過程而實現(xiàn)單分子實時測序的技術(shù)。SMRT測序不僅具有測序長度優(yōu)勢，還不存在GC偏好（Roberts et al.，2013），因此開發(fā)的微衛(wèi)星分子標(biāo)記在基因組中的分布相對較均勻，而有利于構(gòu)建遺傳連鎖圖譜。本研究首次利用SMRT測序開發(fā)凡納濱對蝦微衛(wèi)星分子標(biāo)記，有效增加了凡納濱對蝦的可用微衛(wèi)星分子標(biāo)記數(shù)量，同時證實采用SMRT測序開發(fā)微衛(wèi)星分子標(biāo)記是一種高效可行的方法。

4 結(jié)論

通過對凡納濱對蝦轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行SMRT測序、Illumina測序糾錯及MISA分析，共獲得39674條微衛(wèi)星序列，從設(shè)計的39367對微衛(wèi)星引物中隨機(jī)選取40對微衛(wèi)星引物進(jìn)行驗證，發(fā)現(xiàn)有16對微衛(wèi)星引物顯示出多態(tài)性，說明采用SMRT測序開發(fā)獲得的微衛(wèi)星分子標(biāo)記有相當(dāng)高的比例可用于凡納濱對蝦遺傳學(xué)研究。即采用SMRT測序開發(fā)凡納濱對蝦微衛(wèi)星分子標(biāo)記是一種簡單而高效的途徑，有助于開展凡納濱對蝦的遺傳育種研究工作。

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