唐標(biāo)，代正云，陳怡飛，夏效東，楊華*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江 杭州 310021；2.湖南科技學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 永州 425199；3.西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

蜂花粉是蜜蜂加工花蜜后加入自身腺上分泌物和唾液制成的團(tuán)狀物[1]，根據(jù)花粉的來源呈現(xiàn)不同的顏色，其中以黃色居多。蜂花蜂是蜂群的主要蛋白質(zhì)來源，包含蛋白質(zhì)、氨基酸、碳水化合物、維生素、脂類，酶、輔酶、激素、黃酮、多肽、微量元素等多種生物活性物質(zhì)[2]。因多酚類和黃酮類物質(zhì)廣泛存在，蜂花粉被認(rèn)為是一種有效的抗氧化劑[3-5]。同時，蜂花粉還具有抗動脈粥樣硬化活性[6]，被消費者用作營養(yǎng)和保健品。

新鮮采集的蜂花粉含水量較高，在晾曬、分裝等粗放式加工過程中可能使蜂花粉產(chǎn)品受到微生物的二次污染，從而對人體健康構(gòu)成潛在風(fēng)險[7]。一直以來，關(guān)于蜂花粉中細(xì)菌污染的研究較少[8-9]。一方面是因為蜂花粉具有一定的抗菌活性[10]，細(xì)菌含量少，較難分離；另一方面也是由于傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定流程繁瑣，導(dǎo)致人們可能會忽視零星檢出的可疑菌落。

本研究收集了浙江省主要蜂花粉產(chǎn)區(qū)的代表性蜂花粉樣品，對其進(jìn)行了細(xì)菌分離，隨后通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)進(jìn)行快速鑒定，以反映產(chǎn)品中存在的細(xì)菌污染狀況，并首次對來源于蜂花粉中的克雷伯氏菌的藥物敏感性進(jìn)行檢測分析，相關(guān)結(jié)果可為評估蜂花粉產(chǎn)品的質(zhì)量安全提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

主要儀器：Bio-Rad Gel Doc凝膠成像系統(tǒng)，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司；Eppendorf 5424R微量高速離心機，艾本德中國有限公司；Nanodrop ONE核酸定量儀，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；SW-CJ-ICU超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀，德國布魯克·道爾頓公司。

試劑：LB培養(yǎng)基、EMB培養(yǎng)基、緩沖蛋白胨水(BPW)，購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；質(zhì)控菌株——大腸埃希菌(Escherichiacoli)ATCC 25922系本實驗室保藏；MALDI-TOF MS基質(zhì)——α-氰基-4羥基肉桂酸(HCCA)，購自Sigma公司；2×TaqMaster Mix、DNA marker(相對分子質(zhì)量標(biāo)記)，購自TaKaRa公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑，購自上海捷瑞生物工程有限公司；96孔肉湯微量稀釋法藥敏板，購自上海星佰生物技術(shù)有限公司。

1.2 樣品采集與細(xì)菌分離

在浙江省龍游、長興、蘭溪、江山、武義等市縣采集不同類型的蜂花粉樣品107個，詳細(xì)信息參見本實驗室先前的報道[7]。稱取1 g蜂花粉樣品在37 ℃通過BPW過夜預(yù)增菌，然后同時在LB和EMB培養(yǎng)基上劃線分離，挑選疑似克隆后純化3次，使用20%甘油保藏到-80 ℃冰箱。將分離株劃線于LB平板，37 ℃培養(yǎng)12～24 h復(fù)蘇，挑單克隆用于后續(xù)研究。

1.3 MALDI-TOF-MS鑒定分析

將純化單菌落均勻涂抹至MALDI靶板上的圓孔內(nèi)，加入1 μL 70%的甲酸溶液裂解細(xì)胞，自然晾干后加入1 μL HCCA基質(zhì)溶液覆蓋，自然干燥結(jié)晶。使用MALDI Biotyper RTC[11]軟件進(jìn)行樣品指紋圖譜的自動采集和分析。將采集的指紋圖譜與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，分值越高，則鑒定準(zhǔn)確的可信度越高：分值在2.3～3.0的，表示鑒定到種水平，且可信度高；分值在2.0～2.2的，表示鑒定到種水平；分值在1.7～1.9的，表示鑒定到屬水平。

1.4 基因組DNA抽提與擴增

參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取基因組總DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop ONE進(jìn)行檢測，保存于-20 ℃冰箱備用。細(xì)菌的16S擴增子測序使用通用引物8F(5′-ACTCCTAC GGGAGGCAGCAG-3′)和1492R(5′-GGACTACHV GGGTWTCTAAT-3′)。

1.5 藥物敏感性檢測

采用肉湯微量稀釋法測定抗菌藥物對試驗菌株的最低抑菌濃度(MIC)，使用E.coliATCC 25922作為質(zhì)控菌株，利用上海星佰生物技術(shù)有限公司的藥敏檢測板，按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行試驗。測定的抗菌藥物包括氨芐西林、氨芐西林-舒巴坦、四環(huán)素、氯霉素、復(fù)方新諾明、頭孢唑林、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢西丁、慶大霉素、亞胺培南、萘啶酸、阿奇霉素、磺胺異噁唑、環(huán)丙沙星、阿莫西林-克拉維酸、頭孢噻肟-克拉維酸、頭孢他啶-克拉維酸、多黏菌素E、多黏菌素B、米諾環(huán)素、阿米卡星、氨曲南、頭孢吡肟、美羅培南、左氧氟沙星、多西環(huán)素、卡那霉素、鏈霉素、吉米沙星。所有MIC數(shù)據(jù)參照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(CLSI)2015版M100-S25文件解釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌的分離鑒定

對107份蜂花粉進(jìn)行細(xì)菌分離，總計分離出38株菌株，大部分蜂花粉樣品通過預(yù)增菌后在EMB平板上培養(yǎng)24 h沒有可見菌落。通過MALDI-TOF MS檢測，將分離出的菌群進(jìn)一步鑒定到種水平。圖1顯示了3個代表性菌株——肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)、陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)和黏質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)通過細(xì)菌質(zhì)譜檢測的結(jié)果，其譜圖具有明顯的差異，檢測值也有較高的可信度。對于得分值較低的個別菌株進(jìn)一步通過16S測序驗證。如表1所示，最終鑒定獲得的細(xì)菌分屬于10個屬20個種，包括克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、埃希菌屬(Escherichia)、腸桿菌屬(Enterobacter)、克羅諾桿菌屬(Cronobacter)、沙雷氏菌屬(Serratia)、勒克氏菌屬(Leclercia)、泛菌屬(Pantoea)、腸球菌屬(Enterococcus)、賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus)和芽孢桿菌屬(Bacillus)，占比較高的為腸桿菌屬和克雷伯氏菌屬，前者共有10株，其中7株為陰溝腸桿菌；后者共有7株，其中4株為肺炎克雷伯菌。分離出的菌株中，25株為革蘭氏陰性菌，全部屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，其中多數(shù)為條件致病菌；13株為革蘭氏陽性菌，包括腸球菌科(Enterococcaceae)和芽孢桿菌科(Bacillaceae)。

2.2 藥物敏感性檢測

克雷伯氏菌屬為常見的致病菌，尤以肺炎克雷伯菌為代表。對分離的克雷伯氏菌屬菌株(分別編號為KP16、KP29-2、KP24、KP31、KO59、KO55、KV3-2)進(jìn)行藥物敏感性檢測，獲得其對30種藥物的MIC值(表2)。其中，6株菌對氨芐西林具有耐藥性，KO59對頭孢唑林具有耐藥性，KO55對頭孢西丁具有耐藥性。測試菌株對其他的藥物均表現(xiàn)為敏感，較來源于臨床或者動物腸道的肺炎克雷伯菌耐藥性水平較低[12]。

3 小結(jié)與討論

本研究從107份蜂花粉中分離出38株細(xì)菌，以腸桿菌科細(xì)菌為主，分屬于10個屬，其中7株屬克雷伯氏菌屬，藥敏檢測發(fā)現(xiàn)其耐藥水平較低，僅個別菌株對頭孢類抗生素耐藥?？偟膩碚f，蜂花粉具有一定的食品安全風(fēng)險。

圖1 代表性菌株肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌和黏質(zhì)沙雷氏菌的質(zhì)譜鑒定結(jié)果

表1 蜂花粉中分離的細(xì)菌統(tǒng)計

一直以來，關(guān)于蜂花粉的細(xì)菌污染研究報道極少。蜂花粉不僅影響蜜蜂腸道微生物組成[13]，同時作為保健品關(guān)系食品安全。本研究對浙江省的蜂花粉進(jìn)行了采樣，對可培養(yǎng)的細(xì)菌進(jìn)行了分離鑒定，獲得了較多的致病性的腸桿菌科細(xì)菌，對蜂花粉的細(xì)菌污染狀況有了初步的認(rèn)識，并對其中分離到的克雷伯氏菌屬菌株的耐藥性進(jìn)行了探究。

表2 供試克雷伯氏菌的MIC值

注：標(biāo)*的判斷為耐藥。

蜂花粉中的菌群較糞便、土壤、河流樣品簡單[14-15]，但是其攜帶細(xì)菌的來源是多樣的，包括蜜蜂腸道、植物花粉、生長環(huán)境，以及加工儲運環(huán)節(jié)[16-18]。據(jù)報道，高通量測序發(fā)現(xiàn)，克雷伯氏菌屬、泛菌屬、腸桿菌屬和沙雷氏菌屬在蜜蜂腸道中較常見[19]，本研究同樣分離到上述細(xì)菌，但是蜂花粉中攜帶的細(xì)菌與蜜蜂腸道中上述細(xì)菌的因果關(guān)系仍不明了，需要進(jìn)一步研究。

蜂花粉類型較多，屬于小眾農(nóng)產(chǎn)品，加工和儲運以個體戶為主，所以細(xì)菌的污染狀況具有一定的隨機性。蜂花粉通過預(yù)增菌后，細(xì)菌的分離率仍較低。本研究將MALDI-TOF-MS應(yīng)用于蜂花粉這一農(nóng)產(chǎn)品上，通過對可培養(yǎng)的菌落進(jìn)行鑒定，較容易地鑒定出38株細(xì)菌。本研究第一次較系統(tǒng)地分離出蜂花粉產(chǎn)品中的細(xì)菌，提高了對蜂花粉細(xì)菌或致病菌污染的認(rèn)識，但是對于全面研究蜂花粉的細(xì)菌污染狀況仍有不足。隨著細(xì)菌質(zhì)譜的應(yīng)用，未來可以更方便地對更多的農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)行細(xì)菌污染研究，這對于提高農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全水平具有重要價值。