鐘春水

(萬源生態(tài)股份有限公司 植物組培中心，浙江 臺(tái)州 318000)

金花茶屬山茶科山茶屬木本花卉，其葉與花富含多酚，兼具觀賞與藥用價(jià)值，是廣西的傳統(tǒng)藥物，同時(shí)也是國家一級(jí)保護(hù)植物[1-2]。防城金花茶是指分布在廣西防城地區(qū)金花茶的一個(gè)變種[3]，其花產(chǎn)量高，是市場(chǎng)主流產(chǎn)品之一。目前，對(duì)金花茶多酚的研究主要集中在提取工藝優(yōu)化[4-6]、成分鑒定[7-8]、生物功能[7]等方面，而對(duì)金花茶多酚離體生產(chǎn)方面的研究較少。據(jù)報(bào)道，植物體內(nèi)的多酚受外源激素[9-12]、光照條件[13-14]、培養(yǎng)時(shí)間[15]、稀土元素[16]及誘導(dǎo)子[17]等因素影響。筆者在前期試驗(yàn)篩選中獲得1種富含多酚且能持續(xù)增殖的防城金花茶愈傷組織。鑒于此，本研究開展了6-BA與2，4-D配比對(duì)防城金花茶愈傷組織增殖與多酚含量的影響的研究，以期為防城金花茶多酚離體生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

2018年9月采集浙江溫嶺苗圃引種的防城金花茶幼嫩葉片作為外植體，表面消毒后接種至附加5.00 mg·L-16-BA+0.10 mg·L-12，4-D的MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)培養(yǎng)45 d后，將誘導(dǎo)出的愈傷組織與葉片分離，并接至誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)，繼代時(shí)間為30 d，繼代培養(yǎng)3代以上后待用(圖1)。培養(yǎng)溫度為(25±2)℃；培養(yǎng)條件為黑暗；培養(yǎng)基均附加30 g·L-1蔗糖與6 g·L-1瓊脂，用NaOH調(diào)節(jié)pH至5.8，并在121 ℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用兩因素完全隨機(jī)試驗(yàn)。6-BA的3個(gè)試驗(yàn)濃度分別為2.50、5.00和7.50 mg·L-1，2，4-D的3個(gè)試驗(yàn)濃度分別為0.05、0.10和0.15 mg·L-1；水平間兩兩組合共9個(gè)處理，每處理重復(fù)3次，每瓶接種4個(gè)愈傷切塊。

1.2.2 增殖系數(shù)測(cè)定

培養(yǎng)30 d后將愈傷組織在80 ℃烘干；增殖系數(shù)為培養(yǎng)30 d后的愈傷組織干重占剛接入的愈傷組織干重的比值。

1.2.3 多酚含量測(cè)定

參考李熙燦等[18]改進(jìn)的福林酚法對(duì)多酚進(jìn)行測(cè)定(干重)。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 13.0對(duì)9個(gè)處理的增殖系數(shù)、多酚含量及兩者的乘積分別進(jìn)行主效應(yīng)檢驗(yàn)與兩兩比較分析，并對(duì)增殖系數(shù)與多酚含量進(jìn)行皮爾森(Pearson)相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 增殖系數(shù)分析

增殖系數(shù)F檢驗(yàn)結(jié)果(表1)表明，僅2，4-D對(duì)愈傷組織增殖有顯著影響。6-BA及兩者互作效應(yīng)的F檢驗(yàn)結(jié)果均表明其對(duì)增殖系數(shù)的影響不顯著。故表2中，增殖系數(shù)的多重比較無需再做。

表1 主體間效應(yīng)檢驗(yàn)

注：表中F與p后綴的數(shù)字1、2與3分別代表增殖系數(shù)、多酚含量及兩者的乘積。

2.2 多酚含量分析

多酚含量F檢驗(yàn)結(jié)果(表1)表明，6-BA、2，4-D及其兩者的交互作用均對(duì)多酚含量有極顯著影響，其影響大小為6-BA + 2，4-D>6-BA>2，4-D。各處理多酚含量兩兩比較結(jié)果(表2)表明，處理9即7.50 mg·L-16-BA與0.15 mg·L-12，4-D培養(yǎng)的愈傷組織多酚含量最高，且與其他處理存在顯著差異；其次為處理2,即2.50 mg·L-16-BA+0.10 mg·L-12，4-D的培養(yǎng)基。

表2 各處理對(duì)愈傷組織多酚含量及兩者乘積的影響

注：同列數(shù)據(jù)后無相同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。

2.3 多酚離體生產(chǎn)最佳處理

增殖系數(shù)與多酚含量乘積F檢驗(yàn)結(jié)果(表1)表明，6-BA、6-BA與2，4-D的交互作用對(duì)增殖系數(shù)與多酚含量的乘積有極顯著影響，其影響大小為6-BA+2，4-D>6-BA。各處理增殖系數(shù)與多酚含量乘積兩兩比較結(jié)果(表2)表明，處理9的愈傷組織增殖系數(shù)與多酚含量乘積最大，且與其他處理間存在顯著差異。因此,處理9最適合離體生產(chǎn)防城金花茶多酚類物質(zhì)，其愈傷組織狀態(tài)如圖1所示。

圖1 防城金花茶愈傷組織

2.4 增殖系數(shù)與多酚含量的相關(guān)性分析

對(duì)9個(gè)處理的增殖系數(shù)均值與多酚含量均值進(jìn)行兩變量皮爾森(Pearson)相關(guān)性分析。結(jié)果表明，兩者的皮爾森相關(guān)系數(shù)為-0.42<0，且P值為0.27>0.05，因此，愈傷組織增殖系數(shù)與多酚含量不存在顯著相關(guān)關(guān)系。

3 討論

目前次生代謝產(chǎn)物離體生產(chǎn)的方案有2種思路。一種是“兩步法”，即分別篩選適宜生長與次生代謝產(chǎn)物累積的組培條件，先大量增殖離體培養(yǎng)物，然后將其轉(zhuǎn)接至適宜條件下累積次生代謝產(chǎn)物；另一種是“一步法”，即篩選獲得既適宜離體培養(yǎng)物累積次生代謝產(chǎn)物，亦能正常生長的培養(yǎng)條件，從而獲得次生代謝產(chǎn)物。前者多一個(gè)步驟更耗時(shí)，后者由于生長與次生代謝產(chǎn)物累積的矛盾而較難實(shí)現(xiàn)。由試驗(yàn)結(jié)果可知，增殖系數(shù)與多酚含量相關(guān)性不顯著，因此，可以采用“一步法”生產(chǎn)金花茶多酚。與此同時(shí)，經(jīng)過實(shí)踐認(rèn)為，在篩選“一步法”的適宜組培條件時(shí)，可把增殖系數(shù)與含量的乘積作為次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的指標(biāo)。除了已研究的6-BA與2，4-D外，其他植物激素、光照、培養(yǎng)時(shí)間、稀土元素及誘導(dǎo)子等因素亦可能對(duì)多酚含量存在影響，且彼此間可能存在交互作用。因此，可在上述試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)其他影響因素進(jìn)行研究，從而獲得成熟的愈傷組織離體培養(yǎng)技術(shù)，進(jìn)而達(dá)到離體生產(chǎn)防城金花茶多酚的目的。