竺利紅，張潮，尹小良，施躍峰，李孝輝*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護與微生物研究所 浙江省植物有害生物防控重點實驗室——省部共建國家重點實驗室培育基地，浙江 杭州 310021；2.浙江豐島股份有限公司，浙江 新昌 312532；3.紹興市越城區(qū)東湖鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心，浙江 紹興 312001)

菊花[Dendranthemamorifolium(Ramat.)Tzvel.]是原產(chǎn)于我國的傳統(tǒng)名花，既富有觀賞性，又具藥性。目前，菊花采摘后，其葉多被棄去，易造成嚴重的環(huán)境污染和資源浪費[1-3]。菊花葉中含有與菊花類似的活性物質(zhì)成分，包括揮發(fā)油、黃酮、酚酸類、多糖類等，具有抗菌和抗氧化活性，在清除脂自由基方面，其性能還勝于菊花[4-5]。我國是菊花種植和出口大國，據(jù)統(tǒng)計，2017年我國菊花種植面積在7 520.5萬hm2左右，每年產(chǎn)生的廢棄菊葉不可估量，如能將其利用起來，經(jīng)濟效益和社會效益不容小覷。本研究利用益生菌發(fā)酵菊花葉，以提高其抑菌活性，延長貯藏周期，旨在為制備菊花葉飼料添加劑提供研究基礎(chǔ)?，F(xiàn)總結(jié)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

發(fā)酵菌株：植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。

檢測菌株：藤黃八疊球菌(Micrococcusluteus)，普通變形桿菌(Proteusvulgaris)，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，雞沙門氏菌(Salmonellagullinarum)，銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，大腸埃希菌(Escherichiacoli)，醋酸鈣不動桿菌(Acinetobactercalcoaceticus)，多重耐藥鮑曼不動桿菌(AcinetobacterbaumanniiMDRAb)，嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)和金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)。

以上菌株均由本實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

常規(guī)培養(yǎng)基：乳酸細菌培養(yǎng)基(MRS培養(yǎng)基)，LB培養(yǎng)基，馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)。

菊花葉培養(yǎng)基：取100 g菊花葉，打漿后加入0.3 g(NH4)2SO4和10 mL水，混勻。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵物制備

取新鮮的植物乳桿菌和釀酒酵母種子液接入菊花葉培養(yǎng)基中，攪拌均勻，密封后置于32 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，得到漿狀發(fā)酵物，用于活菌數(shù)測定和保存試驗。將漿狀發(fā)酵物擠壓得汁液，用于pH值、酸度和抑菌活性測定。

1.2.2 發(fā)酵物基本參數(shù)測定

活菌數(shù)測定。植物乳桿菌計數(shù)采用梯度稀釋法。用無菌生理鹽水稀釋發(fā)酵物，選取10-6、10-7、10-8這3個稀釋梯度，各吸取0.5 mL與冷卻到40 ℃的MRS培養(yǎng)基混勻，倒平板，于37 ℃條件下培養(yǎng)48 h，選擇單菌落數(shù)在30～300的平皿進行計數(shù)，根據(jù)稀釋倍數(shù)計算每克發(fā)酵物的植物乳桿菌活菌數(shù)。釀酒酵母計數(shù)采用血球計數(shù)法。

pH值測定。用酸度計測定汁液pH值。

滴定酸度測定。吸取5 mL汁液于100 mL三角瓶中，加入40 mL去CO2蒸餾水，加酚酞2滴，混合均勻后用0.1 mol·L-1NaOH標準溶液滴定至微紅色，且30 s內(nèi)不褪色。以NaOH溶液消耗體積(mL)除以樣品質(zhì)量(g)，再乘以1 000，即得酸度(°T)。取3次測定的平均值。

1.2.3 發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性測定

將汁液以12 000 r·min-1的速度離心1 min，取上清液過0.22 μm濾膜，取濾液調(diào)節(jié)至pH值6.5，備用。

抗菌譜測定。采用杯碟法。將檢測菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)16 h，將細菌濃度調(diào)至107mL-1。取0.1 mL均勻涂在肉湯固體平板上，自然干燥30 min后，將牛津杯(內(nèi)徑為6 mm)均勻放置在平板上。吸取0.1 mL濾液于牛津杯中，37 ℃培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈直徑。每次測定重復(fù)3次，取平均值。對照組在牛津杯中添加空白菊花葉培養(yǎng)基濾液。

對病原菌細胞形態(tài)的影響。在30 mL肉湯培養(yǎng)液中按1%的接種量接入雞沙門氏菌種子液(試驗組)，37 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)8 h，加入濾液1 mL，對照試管中加入無菌水1 mL。60 min后，取對照組和試驗組中的少量菌體于JEM-1400透射電子顯微鏡下觀察菌體內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

1.2.4 保存試驗

將發(fā)酵物置于28 ℃ 30 d，進行表觀評價，并以雞沙門氏菌為檢測菌，測定其抑菌活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵物基本參數(shù)

菊花葉經(jīng)植物乳桿菌和釀酒酵母混合發(fā)酵48 h后，測得1 mL汁液的活菌數(shù)分別為16億和2.4億，pH值為3.8，總酸度39.55 °T，說明該菌組合在菊花葉培養(yǎng)基中生長良好。

2.2 抑菌活性

從表1可以看出，菊花葉發(fā)酵后，不僅提高了對雞沙門氏菌等幾種病原菌的抑菌活性，同時擴大了抗菌范圍，對普通變形桿菌和嗜麥芽窄食單胞菌也表現(xiàn)出了較好的抗菌活性。

表1 菊花葉發(fā)酵產(chǎn)物的抗菌譜

注：+++++表示抑菌圈直徑在30 mm以上，++++表示抑菌圈直徑在25～30 mm，+++表示抑菌圈直徑在20～25 mm，++表示抑菌圈直徑在15～20 mm，+表示抑菌圈直徑在10～15 mm，—表示抑菌圈直徑<10 mm。

2.3 抑制作用

透射電鏡觀察可知，試驗組的雞沙門氏菌形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，菌體皺縮，破裂，胞內(nèi)物質(zhì)外流(圖1中A)；而對照組中菌體成粗桿狀，表面光滑，飽滿(圖1中B)。說明試驗組中的活性物質(zhì)通過破壞細菌細胞壁膜導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)外泄，引起細菌死亡。

圖1 菊花葉發(fā)酵液對雞沙門氏菌的抑制作用(40 000×)

2.4 保存情況

在28 ℃保存30 d后，發(fā)酵液無異味，對雞沙門氏菌的抑菌圈直徑為22 mm，與貯藏前無顯著差異，說明本研究中的菊花發(fā)酵液易于常溫保存。

3 小結(jié)與討論

新鮮菊花葉不耐貯藏，尤其是當氣溫超過25 ℃時，堆放極易引起腐爛。本研究利用植物乳桿菌和釀酒酵母混合發(fā)酵菊花葉，將其貯藏時間延長到30 d以上，同時拓寬了其抗菌譜，提高了其抑菌活性。鮑曼不動桿菌是一種人畜共患菌，在2017年世界衛(wèi)生組織公布的12大耐藥性細菌排名中，其位居級別1——嚴重耐藥性的第一名。本研究所制備的發(fā)酵產(chǎn)物對多重耐藥鮑曼不動桿菌表現(xiàn)出較強的抗菌活性，極具應(yīng)用潛力。綜上，利用微生物固態(tài)發(fā)酵菊花葉作為飼料添加劑具有較大的開發(fā)前景。