陳怡瑾 楊亞莉 王云歡 王必勤 包曉霞

早發(fā)性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency，POI)是指女性在40歲以前出現(xiàn)卵巢功能減退,促性腺激素水平升高(卵泡刺激素，follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)>25 U/L,雌激素水平波動性下降，主要表現(xiàn)在月經(jīng)的異常，如月經(jīng)稀發(fā)、閉經(jīng)等[1]。同時，也會由于雌激素水平降低而出現(xiàn)圍絕經(jīng)期綜合征的癥狀，嚴(yán)重影響女性身心健康和生活質(zhì)量。POI病因尚不明確，目前認(rèn)為主要與遺傳、環(huán)境、醫(yī)源和代謝等多種因素相關(guān)，多種原因?qū)е侣殉苍悸雅輸?shù)目減少或卵泡閉鎖加速、卵泡功能被破壞等，進(jìn)而影響排卵[2]。POI近年來發(fā)病率逐年上升且年輕化，亟待安全有效的治療方法。目前研究證實了中醫(yī)藥通過調(diào)節(jié)激素水平、改善卵巢形態(tài)、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等多個方面來治療POI[3]。育胞湯是北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院著名婦科專家郭志強(qiáng)教授的經(jīng)驗方，在臨床多年的使用中已證實對POI患者有顯著的療效。本研究通過育胞湯的顆粒劑(育胞顆粒)治療早發(fā)性卵巢功能不全大鼠，治療后檢測大鼠激素水平及卵巢相關(guān)激素和受體的表達(dá)，提供分子機(jī)制方面的實驗依據(jù)，印證其對于早發(fā)性卵巢功能不全的改善作用并對其改善作用的分子機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雌性SD大鼠，8周齡，體重220～250 g，由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院實驗室提供。在室溫(22±2)℃、濕度(50±5)%、12小時晝夜明暗交替，自由飲食的環(huán)境，分籠適應(yīng)性喂養(yǎng)5天后，每天上午同一時間段進(jìn)行陰道細(xì)胞學(xué)涂片，連續(xù)觀察兩個動情周期，篩選出有正常動情周期者為受試動物。實驗過程中對動物處置符合中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部頒布的實驗動物管理條例的規(guī)定。

1.2 實驗藥品

雷公藤多苷片，10 mg/片，50片/盒，浙江得恩德制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字：Z33020422。枸櫞酸氯米芬(克羅米芬)，50 mg/片，10片/盒，MEDOCHEMIE LTD(塞浦路斯)，國藥準(zhǔn)字：H20140688。

郭志強(qiáng)教授經(jīng)驗方育胞湯藥物組成：枸杞子15 g、女貞子15 g、黃精15 g、熟地黃15 g、菟絲子15 g、淫羊藿12 g、川斷15 g、黨參15 g、益母草15 g、川芎12 g、當(dāng)歸15 g。育胞顆粒由北京康仁堂藥業(yè)有限公司提供(枸杞子，批號：18008951；酒女貞子，批號：18001632；酒黃精，批號：17023221；熟地黃，批號：18002131；鹽菟絲子，批號：18008521；炙淫羊藿，批號：18010691；續(xù)斷，批號：18012771；黨參，批號：18017781；益母草，批號：18010252；川芎，批號：18019833；當(dāng)歸，批號：18016761)。

1.3 主要試劑

抗苗勒管激素(anti-Müllerian hormone,AMH)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)、雌激素受體(estrogen receptor,ER)多克隆抗體免疫組化試劑盒為北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，孕激素受體(progesterone receptor,PR)多克隆抗體免疫組化為博士德生物公司產(chǎn)品。p-PKA antibody、Actin antibody為Abcam公司產(chǎn)品，Goat Anti-Rabbit IgG、 HRP、Goat Anti-Mouse IgG為Santa公司產(chǎn)品，RIPA裂解液為碧云天公司產(chǎn)品，BSA緩沖液、30%丙烯酰胺為Amresco公司產(chǎn)品。

1.4 主要儀器

雙垂直電泳槽、轉(zhuǎn)移槽、電泳儀購自CAVOY,溫控?fù)u床購自其林貝爾,光譜掃描多功能讀數(shù)儀購自賽默飛世爾科技,烤片機(jī)購自Leica Biosystems Nussioch GmbH,顯微鏡攝像頭購自美國DIAGNOSTIC,恒溫箱購自上海福馬實驗設(shè)備有限公司。

1.5 造模方法

將具有正常動情周期的SD雌性大鼠以生理鹽水配制的雷公藤多苷片(40 mg·kg-1·d-1)懸浮液灌胃[4-5]，劑量為1 mL/100 g，1 次/天，共10周，自灌藥日起，每日進(jìn)行陰道涂片，觀察記錄動情周期。全部大鼠動情周期破壞，則造模成功。

1.6 分組和給藥方法

將造模成功的SD雌性大鼠30只，隨機(jī)分為育胞顆粒組、克羅米芬組、空白對照組各10只，每5只一籠。育胞顆粒組：育胞顆粒臨床日用量159 g生藥。換算動物臨床等效劑量[5]，大鼠用量為16.70 g生藥/kg。每劑顆粒劑溶解于生理鹽水至95.21 mL，即1.67 g生藥/mL，按1 mL/100 g，每天1次，大鼠灌胃7天?？肆_米芬組將克羅米芬片研成粉末，將其懸浮于50 mL無菌生理鹽水中，配成0.52 mg/mL克羅米芬懸浮液。按照5.2 mg克羅米芬·kg-1·d-1即1 mL/100 g，每日1次，大鼠灌胃7天?？瞻讓φ战M按1 mL/100g，每日1次生理鹽水，灌胃7天。灌藥期間繼續(xù)每日行陰道涂片檢測。

1.7 檢測指標(biāo)

1.7.1 取材和處死 所有動物在完成操作24小時后處死，腹主動脈取血4 mL，靜置離心后取上清液，分離出雙側(cè)卵巢組織，分別置于4%多聚甲醛液中固定、-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.7.2 酶聯(lián)免疫吸附法檢測大鼠血清AMH激素水平 檢測大鼠血清AMH激素水平，按照酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒說明書操作進(jìn)行。

1.7.3 免疫組化法檢測大鼠卵巢組織ER和PR的表達(dá) 卵巢組織進(jìn)行石蠟包埋切片，切片60℃烤片30分鐘，二甲苯脫蠟,酒精水化，微波爐內(nèi)不同溫度進(jìn)行抗原修復(fù)，避光加3% H2O2處理15分鐘，滴加封閉液孵育30分鐘，后滴加配比好的一抗,孵育4℃過夜。次日給予二抗孵育，PBS洗5次，DAB避光顯色，蘇木素復(fù)染，封片，顯微鏡下觀察染色結(jié)果。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果處理：卵巢組織標(biāo)本中細(xì)胞胞質(zhì)出現(xiàn)淡黃色或黃色顆粒狀著色為陽性表達(dá)，攝像記錄后采用Image-proplus 6.0圖像處理在同等條件下檢測每張組織切片中表達(dá)的平均積分光密度(A)值。

1.7.4 Western blot檢測大鼠卵巢組織中PKA的表達(dá) 取三組大鼠卵巢加入適量RIPA裂解液，勻漿，冰上裂解進(jìn)行蛋白提取。調(diào)整蛋白濃度，煮沸變性。取等量蛋白樣品，電泳，轉(zhuǎn)膜，Western blot封閉液封閉，第一抗體(稀釋濃度1∶500)與靶蛋白結(jié)合，然后第二抗體與第一抗體結(jié)合。室溫下，PBST緩沖液中洗膜4次，每次5分鐘，ECL反應(yīng)、暗室膠片曝光，顯影并定影。采用Quantity One v.4.6.2軟件讀取條帶灰度值，求每個蛋白印記的灰度值，與內(nèi)參的灰度值的比值，作為被檢測蛋白的相對表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清AMH激素水平情況

與空白對照組比較，育胞顆粒組與克羅米芬組均出現(xiàn)AMH增高的現(xiàn)象，育胞顆粒組與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，克羅米芬組與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，育胞顆粒和克羅米芬組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。 如表1所示。

表1 各組POI大鼠血清AMH激素水平情況比較

注： 與空白對照組比較，Z=10.774，aP<0.05。

2.2 各組大鼠卵巢組織中ER、PR表達(dá)情況

與空白對照組比較，育胞顆粒組與克羅米芬組均出現(xiàn)ER和PR增高的現(xiàn)象，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；育胞顆粒和克羅米芬組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。如表2和圖1、圖2所示。

表2 各組POI大鼠卵巢組織中ER、PR表達(dá)情況比較

注： 與空白對照組比較，Z=10.402、13.272，aP<0.05。

注： A：育胞顆粒組；B：克羅米芬組；C：空白對照組。

圖1各組POI大鼠卵巢ER表達(dá)情況(免疫組化×400)

注：A:育胞顆粒組；B:克羅米芬組；C:空白對照組。

圖2各組POI大鼠卵巢PR表達(dá)情況(免疫組化×400)

2.3 各組大鼠卵巢組織中PKA表達(dá)情況

根據(jù)Western blot檢測結(jié)果，如表3、圖3所示，對照組大鼠卵巢組織存在少量PKA的表達(dá)。與對照組相比較，克羅米芬組、育胞顆粒組PKA表達(dá)均顯著升高(P<0.01)；與育胞顆粒組相比，克羅米芬組PKA的表達(dá)明顯更高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表3 各組POI大鼠卵巢組織中PKA表達(dá)情況比較

注： 與空白對照組比較，aP<0.01。

圖3 各組POI大鼠卵巢組織中PKA的表達(dá)

3 討論

早發(fā)性卵巢不全既往亦稱為“卵巢早衰”，早在《內(nèi)經(jīng)》中就首次提出了“早衰”，并且定義“早衰”的年齡為 “年四十”，這與現(xiàn)代的認(rèn)識相吻合。該病雖在中醫(yī)學(xué)中無直接對應(yīng)的病名，根據(jù)癥狀可認(rèn)為其屬于中醫(yī)“月經(jīng)過少”“月經(jīng)后期”“閉經(jīng)”“不孕”等病的范疇?！端貑枴ち?jié)藏象論篇》云：“腎者，主蟄，封藏之本，精之處也”，《傅青主女科》認(rèn)為“經(jīng)水出諸腎”“經(jīng)本于腎”?！端貑枴ど瞎盘煺嬲撈诽岬剑骸芭佣叨旃镏?，任脈通，太沖脈盛，月事以時下，故有子。”《景岳全書·婦人規(guī)》：云“此證最多，所以當(dāng)辨而治之……而腎氣日消，輕則或早或遲，重則漸成枯閉?！蹦I藏精，主生殖，腎氣充盛，氣血旺盛，沖任二脈充盈，協(xié)調(diào)作用于胞宮，則月經(jīng)如期而至。郭志強(qiáng)教授認(rèn)為腎藏精氣是天癸至、經(jīng)調(diào)子嗣的根本，而婦人陰血常虛狀態(tài)是婦科疾病發(fā)病的重要內(nèi)因，認(rèn)為該病與腎、肝、脾、沖任密切相關(guān)，主要病位在腎。郭志強(qiáng)教授自擬的育胞湯中女貞子、枸杞子補(bǔ)腎益精共為君藥；熟地黃補(bǔ)血養(yǎng)陰、填精益髓，黃精健脾益腎、補(bǔ)氣養(yǎng)陰，共助君藥補(bǔ)腎益精為臣藥；菟絲子、續(xù)斷、淫羊藿溫補(bǔ)腎陽，取其陽中求陰之義；黨參、益母草益氣活血；當(dāng)歸、川芎補(bǔ)血活血。育胞湯主要用于經(jīng)后期，經(jīng)后期經(jīng)水即行、陳祛新生，根據(jù)經(jīng)后期陰長陽消，陰血漸復(fù)，達(dá)到重陰的生理特點，此時胞宮、沖任空虛，故應(yīng)以滋補(bǔ)肝腎(陰)，養(yǎng)血調(diào)經(jīng)為主，為陰陽轉(zhuǎn)化氤氳之時奠定基礎(chǔ)。臨床研究發(fā)現(xiàn)，育胞湯聯(lián)合其他方劑組成的周期療法能改善卵巢功能低下患者的激素水平及卵巢功能，顯著提高臨床妊娠率，臨床有效率達(dá)到92.3%[6]。

克羅米芬是目前臨床運用廣泛的促排卵藥物，對雌激素有強(qiáng)的拮抗作用和弱的激動作用。拮抗是通過競爭性占據(jù)下丘腦雌激素受體，影響內(nèi)源性雌激素的負(fù)反饋，促使垂體促性腺激素分泌的增加，從而刺激卵泡生長。至卵泡成熟后，弱的雌激素激動作用通過正反饋激發(fā)排卵?？肆_米芬還可以通過增強(qiáng)顆粒細(xì)胞對促性腺激素的敏感性和芳香化酶的活性[7]。在卵巢組織中育胞顆粒組的ER和PR與克羅米芬組沒有明顯差異，但都比空白對照組有顯著增高。研究表明，ER的數(shù)量對雌激素發(fā)揮作用有較為重要的影響[8]。本研究發(fā)現(xiàn)育胞顆?？梢陨险{(diào)大鼠卵巢組織內(nèi)ER和PR的數(shù)量，增加雌二醇及孕激素的水平，有助于提高受損的卵巢功能。但是，目前國內(nèi)外尚無克羅米芬對于卵巢功能不全大鼠卵巢ER、PR影響的研究。

抗苗勒管激素(AMH)主要是由竇前卵泡和小的竇卵泡上的顆粒細(xì)胞產(chǎn)生，可以抑制卵泡的生長過快及募集過程，從而導(dǎo)致卵巢無排卵，防止卵泡消耗過早過快[9-10]。卵巢功能不全主要為卵巢儲備功能低下，這主要與卵巢卵母細(xì)胞質(zhì)量及數(shù)量相關(guān)，血清內(nèi)的AMH水平能夠很好地反應(yīng)出卵巢內(nèi)竇卵泡數(shù)量[11]。AMH水平受到其他激素的影響較小，也不受下丘腦-垂體-卵巢軸的影響，能穩(wěn)定的反映出卵巢功能[12]。本研究發(fā)現(xiàn)育胞顆?？梢蕴岣呗殉补δ懿蝗笫笱錋MH水平，從而提高卵巢儲備功能，促進(jìn)卵巢功能恢復(fù)。

PKA即cAMP依賴蛋白激酶，簡稱激酶A。最新研究顯示，PKA與卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂密切相關(guān)。在排卵前，PKA一定的活性保證了卵母細(xì)胞減數(shù)分裂停滯，LH高峰后，伴隨著PKA活性的下降，減數(shù)分裂再次啟動[13]。PKA也促進(jìn)了GnRH對FSH分泌的作用，但GnRH對LH的促進(jìn)作用不明顯[14]，同時PKA介導(dǎo)了FSH對于排卵前卵泡成熟過程中顆粒細(xì)胞的分化以及FSH促進(jìn)顆粒細(xì)胞tPA的表達(dá)的過程，進(jìn)而引起排卵[15-16]。同時，有研究發(fā)現(xiàn)PKA激動劑能夠提高卵泡的質(zhì)量，抑制卵泡的閉鎖[17]。本研究結(jié)果顯示，育胞顆粒組及克羅米芬組PKA表達(dá)較空白對照組明顯升高(P<0.01)，提示藥物組POI大鼠卵泡成熟過程的重啟，卵泡質(zhì)量也明顯提高。PKA蛋白介導(dǎo)的通路在卵泡成熟、排卵等過程中都發(fā)揮了一定的作用，因此，可以認(rèn)為克羅米芬、育胞顆粒均可能通過PKA通路對POI大鼠的卵泡成熟等產(chǎn)生正面的作用。雖然克羅米芬組PKA的表達(dá)較育胞顆粒組明顯增多，但在卵泡生長及排卵等一系列的過程中除PKA相關(guān)的通路外還有很多的通路在介導(dǎo)各個過程的發(fā)生及變化，因此要進(jìn)一步明確育胞顆粒對POI大鼠的作用及機(jī)制須納入更多相關(guān)通路的研究。

克羅米芬雖然可以促進(jìn)卵巢排卵功能，但是因其具有雌激素拮抗作用，會引起宮頸黏液粘稠、拉絲度低、阻止精子進(jìn)入，還可影響子宮內(nèi)膜發(fā)育，減少子宮血流供應(yīng)，使內(nèi)膜和卵泡發(fā)育不同步，從而降低受精卵著床率?？肆_米芬能夠提高卵巢排卵率，但是臨床妊娠率低。在臨床使用中發(fā)現(xiàn)育胞顆粒不僅能夠促進(jìn)卵巢功能恢復(fù)，促進(jìn)卵巢排卵，還不會影響子宮內(nèi)膜厚度，但其具體作用的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。本實驗旨在明確育胞顆粒對POI的治療作用的基礎(chǔ)上初步探究相關(guān)機(jī)制，分組簡單，所納入的指標(biāo)也較少，有諸多不完善之處，在未來須進(jìn)行更加科學(xué)、深入的研究進(jìn)一步明確育胞顆粒治療POI的相關(guān)機(jī)制。