史艷財(cái)，鄒 蓉**，朱成豪，熊忠臣，蔣運(yùn)生

(1.廣西壯族自治區(qū)中國科學(xué)院廣西植物研究所，廣西桂林 541006；2.桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣西桂林 541004)

0 引言

喙核桃(Annamocaryasinensis)為胡桃科(Juglandaceae)喙核桃屬(Annamocarya)植物，為第三紀(jì)古熱帶孑遺植物[1]。喙核桃果實(shí)為核果，球形或卵球形，頂端具鳥喙?fàn)罴忸^，該種僅分布于貴州、廣西、云南等少數(shù)幾個(gè)省區(qū)[2]，其木材結(jié)構(gòu)均勻，花紋美觀，是制作軍工設(shè)備、家具等的優(yōu)良木材。喙核桃僅有極低比例的種子可萌發(fā)成苗。此外，喙核桃的分布區(qū)域多年來破壞嚴(yán)重，植株數(shù)量日趨減少，已被列為國家二級(jí)保護(hù)植物[3]。目前，對(duì)喙核桃的研究僅有群落調(diào)查[4]、木材解剖及其分類位置[5]、保育遺傳[6]等方面。為準(zhǔn)確揭示喙核桃的遺傳多樣性，以便于進(jìn)行后續(xù)資源評(píng)價(jià)、良種選育及種苗繁育等工作，亟需建立其特定的多樣性檢測體系。

Inter-simple Sequence Repeat (ISSR)分子標(biāo)記技術(shù)由Zietkiewicz等于1994年提出，具有操作簡易、成本低、靈敏度高等特點(diǎn)，推出后即被廣泛應(yīng)用于植物遺傳多樣性研究中[7]。ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件對(duì)檢測結(jié)果至關(guān)重要，將該技術(shù)用于物種遺傳多樣性檢測時(shí)需建立其對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增反應(yīng)體系。本文將正交和單因素試驗(yàn)相結(jié)合，開展dNTPs、Mg2+、引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA、循環(huán)次數(shù)及退火溫度對(duì)喙核桃ISSR-PCR擴(kuò)增效果影響的研究，以期建立喙核桃ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系，為其種質(zhì)資源評(píng)價(jià)等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料2019年8月采于廣西壯族自治區(qū)中國科學(xué)院廣西植物研究所的種質(zhì)資源圃，采集生長良好植株的幼嫩葉片2-3片，冰盒(4℃)帶回實(shí)驗(yàn)室后用液氮(-80℃)冷凍。樣品經(jīng)廣西植物研究所韋霄研究員鑒定。

1.2 試劑與儀器

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中所用dNTPs、引物、10×PCR Buffer、Taq DNA聚合酶等試劑全部購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

DNA質(zhì)量檢測所用分光光度計(jì)為TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(jì)；PCR擴(kuò)增采用美國BIO-RAD伯樂公司的PCR儀；DYCP-34型電泳槽和CDYY-6C型電泳儀為北京市六一儀器廠生產(chǎn)。

1.3 方法

1.3.1 喙核桃基因組DNA提取

采用CTAB法提取喙核桃葉片總DNA。DNA質(zhì)量檢測采用1%瓊脂糖凝膠電泳法和紫外分光光度計(jì)檢測法。

1.3.2 ISSR-PCR反應(yīng)體系正交試驗(yàn)

用2×uniqueTMTaq Plus Master Mix (with Dye)試劑盒對(duì)100條通用引物進(jìn)行初步篩選，選用引物826 (5′-ACA CAC ACA CAC ACA CC-3′)進(jìn)行正交試驗(yàn)(L16(45))，設(shè)置的因素為Mg2+、Taq DNA聚合酶、dNTPs、引物、DNA模板，每因素設(shè)置4個(gè)梯度(表1和表2)。此外，每個(gè)體系中添加2.0 μL的10×PCR Buffer，最后用ddH2O補(bǔ)至20 μL，每個(gè)組合重復(fù)3次。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

Table 1 Factors and levels of orthogonal test

水平Levels因素FactorsdNTPs(mmol/L)引物Primer(μmol/L)Mg2+(mmol/L)Taq DNA聚合酶Taq DNA polymerase (U/20 μL)DNA(ng)10.10.21.00.53020.20.41.51.04530.40.62.01.56040.50.82.52.075

預(yù)擴(kuò)增程序：首先94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，52.9℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)40次;以上循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.5%的瓊脂糖電泳1.5 h左右，然后置EB液(0.5 μg/mL)中染色20 min，最后置UVP凝膠成像系統(tǒng)中拍照。

表2 ISSR-PCR 正交試驗(yàn)L16(45)

Table 2 Orthogonal test for ISSR-PCR L16(45)

編號(hào)Number因素FactorsdNTPs(mmol/L)引物Primer (μmol/L)Mg2+(mmol/L)Taq DNA聚合酶Taq DNA polymerase(U/20 μL)DNA(ng)10.10.21.00.53020.10.41.51.04530.10.62.01.56040.10.82.52.07550.20.21.51.57560.20.41.02.06070.20.62.50.54580.20.82.01.03090.40.22.02.045100.40.42.51.530110.40.61.01.075120.40.81.50.560130.50.22.51.060140.50.42.00.575150.50.61.52.030160.50.81.01.545

1.3.3 喙核桃 ISSR-PCR擴(kuò)增單因素試驗(yàn)

以優(yōu)選出的正交組合為基礎(chǔ)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，設(shè)置水平分別為Mg2+濃度0.5,1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mmol/L；Taq DNA聚合酶濃度0.25，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 U/20 μL；引物濃度0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 μmol/L；模板DNA 15，30，45，60，75，90 ng；dNTPs濃度0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mmol/L。

1.3.4 ISSR-PCR反應(yīng)程序優(yōu)化

退火溫度設(shè)置為理論退火溫度Tm±5℃，共12個(gè)梯度。循環(huán)次數(shù)設(shè)20，25，30，35，40，45次。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果

5因素4水平正交試驗(yàn)的結(jié)果如圖1所示，組合1，7，14，15，16的擴(kuò)增效果最差，基本無條帶擴(kuò)出。組合2，4，5條帶強(qiáng)度弱且背景模糊。組合3，8，9，10，11，12，13擴(kuò)增效果雖稍好，但僅能擴(kuò)增出3條條帶。組合6條帶多且背景也較為清晰。綜合以上分析結(jié)果可知，組合6多態(tài)性豐富、條帶清晰，可用于后續(xù)研究。

M:DL1200 DNA marker; 1—16 represent 16 groups of orthogonal test

圖1 ISSR-PCR正交試驗(yàn)結(jié)果

Fig.1 Orthogonal test results of ISSR-PCR

2.2 Mg2+濃度對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增效果的影響

由圖2可知，Mg2+濃度低時(shí)擴(kuò)增效果較差。提高M(jìn)g2+濃度，其條帶數(shù)目增加且清晰度也有較大提高。當(dāng)濃度為3.0 mmol/L時(shí)多態(tài)性和清晰度最好，故該濃度為最佳Mg2+濃度。

M:DL1200 DNA marker; 1—6 represent Mg2+concentrations of 0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0 mmol/L

圖2 Mg2+濃度對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增效果的影響

Fig.2 Effect of Mg2+concentration on ISSR-PCR amplification

2.3 dNTPs對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增效果的影響

dNTPs對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響如圖3所示。當(dāng)dNTPs濃度較低時(shí)(0.1 mmol/L)，擴(kuò)增條帶數(shù)較少；提高dNTPs濃度，擴(kuò)增條帶數(shù)與清晰度增強(qiáng)，因此dNTPs濃度為0.5 mmol/L時(shí)效果最好。

2.4 Taq DNA聚合酶對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增效果的影響

不同濃度的Taq DNA聚合酶擴(kuò)增結(jié)果如圖4所示，低濃度的Taq DNA聚合酶基本擴(kuò)增不出條帶。提高Taq DNA聚合酶濃度后，擴(kuò)增條帶數(shù)目和清晰度明顯改善，且Taq DNA聚合酶濃度為2.5 U/20 μL時(shí)擴(kuò)增效果最好。

M:DL1200 DNA marker; 1—6 represent dNTPs concentrations of 0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6 mmol/L

圖3 dNTPs濃度對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增效果的影響

Fig.3 Effect of dNTPs concentration on ISSR-PCR amplification

M:DL1200 DNA marker; 1—6 represent Taq polymerase concentrations of 0.25,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5 U/20 μL

圖4 Taq DNA聚合酶濃度對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增效果的影響

Fig.4 Effect of Taq DNA polymerase concentration on ISSR-PCR amplification

2.5 引物對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增效果的影響

不同濃度引物對(duì)ISSR-PCR結(jié)果的影響如圖5所示，不同濃度的引物擴(kuò)增出的條帶數(shù)基本相同，且以引物濃度為0.8 μmol/L時(shí)擴(kuò)增的條帶最為清晰，可確定引物的最佳濃度為0.8 μmol/L。

M:DL1200 DNA marker; 1—6 represent primer concentrations of 0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 μmol/L

圖5 引物濃度對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增效果的影響

Fig.5 Effect of primer concentration on ISSR-PCR amplification

2.6 喙核桃模板DNA濃度對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增效果的影響

喙核桃模板DNA濃度對(duì)ISSR-PCR的影響如圖6所示，DNA濃度為15-90 ng時(shí)擴(kuò)增出的帶型基本相同，且以45 ng時(shí)擴(kuò)增出的條帶強(qiáng)度較高，故該濃度為模板DNA最佳濃度。

M:DL1200 DNA marker; 1—6 represent DNA concentrations of 15,30,45,60,75,90 ng

圖6 模板DNA濃度對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增效果的影響

Fig.6 Effect of template DNA concentration on ISSR-PCR amplification

2.7 PCR循環(huán)次數(shù)對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增效果的影響

PCR循環(huán)次數(shù)對(duì)ISSR-PCR的影響如圖7所示，隨著循環(huán)次數(shù)的增加，條帶數(shù)目及條帶強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。循環(huán)次數(shù)為40時(shí)即可得到清晰的條帶，再增加循環(huán)次數(shù)條帶清晰度變化不大。

M:DL1200 DNA marker; 1—6 represent cycles of 20,25,30,35,40,45

圖7 循環(huán)次數(shù)對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增效果的影響

Fig.7 Effect of cycle times on ISSR-PCR amplification

2.8 退火溫度對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增效果的影響

退火溫度對(duì)PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響如圖8所示，退火溫度升高，擴(kuò)增出的條帶數(shù)目呈降低趨勢(shì)。綜合考量條帶數(shù)和清晰度，本文確定54.4℃為最適退火溫度。

M:DL1200 DNA marker; 1—6 represent annealing temperature of 47.0,47.2,47.7,48.5,49.6,51.1,52.9,54.4,55.5,56.3,56.8,57.0℃

圖8 退火溫度對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增效果的影響

Fig.8 Effect of annealing temperature on ISSR-PCR amplification

3 討論

建立穩(wěn)定、可靠的ISSR-PCR反應(yīng)體系對(duì)于后續(xù)的遺傳多樣性分析至關(guān)重要。單獨(dú)采用單因素試驗(yàn)優(yōu)化組合時(shí)僅考量了各因素不同水平對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，忽略了各因素間的交互作用，很大程度上降低了最佳反應(yīng)水平的可靠程度[8-9]。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)既考慮了多因素各水平的相互作用，且能利用最少的組合數(shù)考察因素和水平對(duì)結(jié)果的影響程度，得出最佳組合，故而越來越多的研究者將該方法用于試驗(yàn)體系建立的研究中[10]。本試驗(yàn)先用正交試驗(yàn)進(jìn)行初步篩選，再用單因素試驗(yàn)優(yōu)化，極大地減少了試驗(yàn)次數(shù)和時(shí)間，快速建立了喙核桃的ISSR-PCR反應(yīng)體系。

ISSR擴(kuò)增結(jié)果受Taq DNA聚合酶、dNTPs、模板DNA、引物等諸多因素影響，這些因素間也存在較為復(fù)雜的相互作用。例如：dNTPs分子含有的磷酸基團(tuán)可與Mg2+結(jié)合，從而降低反應(yīng)體系中的Mg2+濃度[10]，故在試驗(yàn)前需對(duì)各因素的比例進(jìn)行優(yōu)化組合。試驗(yàn)結(jié)果顯示，喙核桃的ISSR-PCR反應(yīng)體系對(duì)Mg2+濃度要求嚴(yán)格，濃度低時(shí)無法擴(kuò)增出條帶，對(duì)其他因素(Taq DNA聚合酶、dNTPs、模板DNA、引物)則要求不太嚴(yán)格。這可能是由于反應(yīng)體系中其他組分對(duì)Mg2+都較為敏感，如Taq DNA聚合酶對(duì)Mg2+濃度極為敏感，是Mg2+依賴性酶，故Mg2+可與其他組分結(jié)合，最終影響PCR 擴(kuò)增的效率和特異性。

除反應(yīng)體系中各組分會(huì)對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果產(chǎn)生重要影響外，擴(kuò)增程序?qū)U(kuò)增結(jié)果同樣至關(guān)重要，尤其是引物退火溫度[11]。每條引物雖會(huì)提供其理論退火溫度，但實(shí)際溫度與理論值不符的現(xiàn)象也時(shí)有發(fā)生，故試驗(yàn)前需對(duì)引物退火溫度值進(jìn)行篩選。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)退火溫度對(duì)擴(kuò)增結(jié)果影響顯著，當(dāng)溫度為51.1-57℃，擴(kuò)增效果好，條帶較為清晰。該結(jié)果與其他研究結(jié)果相一致，即較高的退火溫度可提高反應(yīng)的特異性及清晰度[12]。

4 結(jié)論

喙核桃的ISSR-PCR反應(yīng)體系對(duì)Mg2+濃度要求嚴(yán)格，其最佳ISSR-PCR擴(kuò)增體系及程序?yàn)?0 μL的反應(yīng)體系含dNTPs 0.5 mmol/L、Mg2+3.0 mmol/L、引物0.8 μmol/L、Taq DNA聚合酶2.5 U、模板DNA 45 ng、10×PCR Buffer 2.0 μL。退火溫度為54.4℃，循環(huán)次數(shù)為40次。