肖楚麗

邵陽學(xué)院，湖南 邵陽 422000

金黃色葡萄球菌（SA）屬于化膿性球菌的一種類型，也是造成院內(nèi)感染的主要原因，一旦患者出現(xiàn)感染，可能引發(fā)食物中毒、假膜性腸炎以及燙傷樣皮膚綜合征，對住院患者的治療造成非常大的威脅。金黃色葡萄球菌能調(diào)節(jié)人體的逃避宿主免疫防御系統(tǒng)，直至死亡，但是，其引發(fā)死亡的作用機(jī)制并不明確，所以，研究金黃色葡萄球菌中細(xì)胞走向凋亡的重要介導(dǎo)因子，具有重要的意義，也是目前臨床研究的一個重要方向。目前，僅有少數(shù)學(xué)者發(fā)現(xiàn)，可能與絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）活性高低有關(guān)，在信號通路的傳導(dǎo)中，有著重要的促進(jìn)作用，但是，MAPK是如何通過信號通路，產(chǎn)生作用，其作用機(jī)制和原理，還有待深入的分析，所以，對P38MAPK信號傳導(dǎo)通路誘導(dǎo)金黃色葡萄糖球菌，至細(xì)胞凋亡的作用進(jìn)行分析，是一項重要的研究課題[1]。本文對P38 MAPK信號通路在金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)U937細(xì)胞凋亡中的作用進(jìn)行分析，內(nèi)容如下：

1 材料與方法

1.1 材料 100株金黃色葡萄球菌均自實(shí)驗室中獲取，菌株由實(shí)驗室提供，并在不含有抗生素的5%小牛血清RPMI1640培養(yǎng)基重懸并進(jìn)行稀釋。試劑選擇：P38 MAPK、PHOSPHO-P38MAPK抗體，P38 MAPK抑制劑，凋亡試劑盒、細(xì)胞培養(yǎng)試劑。

1.2 方法

①細(xì)胞培養(yǎng)以及抑制劑加入。將U937（人巨噬細(xì)胞）中置入10%小牛血清，與2mmol/L L-谷氨酸鈉、100U/ml青霉素、100g/ml鏈霉素放于RPMI1640培養(yǎng)基中，進(jìn)行培養(yǎng)箱培養(yǎng)，溫度為37℃，并在SA感染前1h加入不同濃度的P38 MAPK抑制劑。

②SA感染U937細(xì)胞。感染前需要使用不含抗生素的RPMI1640培養(yǎng)基將U937進(jìn)行細(xì)胞的清洗并進(jìn)行重懸，調(diào)整濃度，細(xì)胞與細(xì)菌的比例為1:20，之后分別培養(yǎng)0/15/30/60min，連續(xù)2次進(jìn)行離心處理，將未吞沒的細(xì)菌標(biāo)本清洗干凈，將其放入青霉素、鏈霉素清RPMI1640的培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)，放置3h后，進(jìn)行感染細(xì)胞提取，對其進(jìn)行定性分析。

連續(xù)離心2次，清洗未吞噬的細(xì)菌標(biāo)本，放置于2倍小牛血清、青霉素以及鏈霉素的清RPMI1640培養(yǎng)基中，3h后提取感染的U937細(xì)胞，觀察變化。

③雙染分析。使用流式細(xì)胞分析儀，將106細(xì)胞加入含有an-nexinV的緩和液中，緩和液劑量為60μL，在4℃溫度下避光15分鐘，注意區(qū)分早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞以及壞死細(xì)胞，并在實(shí)施檢查之前同時染an-nexinV與PI，結(jié)合測試儀分析結(jié)果。

④Western免疫印跡。在U937細(xì)胞處理過一段時間后，實(shí)施PBS洗滌，在3次后將其中裂解液進(jìn)行重懸，時間為20min，之后使用同樣數(shù)量的蛋白12%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，使用蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)將蛋白轉(zhuǎn)印至膜上，60min后使用5%奶粉在三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽水中進(jìn)行封閉，并按照說明書的操作要求，對其進(jìn)行Tween20洗滌，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。

1.3 觀察指標(biāo) 對比U937細(xì)胞凋亡百分比在不同時間段的表現(xiàn)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 本次研究數(shù)據(jù)均采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS20.0進(jìn)行處理，計數(shù)資料采用χ2表示，P檢驗，P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

隨著時間的增加，U937細(xì)胞凋亡百分比顯著提升，詳見表1。

表1 對比不同時間下U937細(xì)胞凋亡百分比

3 討論

金黃色葡萄糖球菌的抵抗力是最強(qiáng)的，屬于一種無芽胞菌，在人體中大量的存在，其生存條件簡單，如皮膚表面附著，鼻腔內(nèi)部附著等。研究顯示，MAPK的存在途徑非常多樣化，被學(xué)者知曉的目前就有4種，P38 MAPK信號通路是其中一種，主要通過絲氨酸以及蘇氨酸同時磷酸化之后出現(xiàn)激活，因此需要對該方面進(jìn)行分析。根據(jù)學(xué)者研究指出，p38MAPK可介導(dǎo)、分化細(xì)胞的分化和增殖，并且大量的存在于對中生物學(xué)效應(yīng)中，有時候，甚至可以產(chǎn)生抑制等相反的作用，但是，其具有很強(qiáng)的細(xì)胞依賴性，在致病性細(xì)菌侵襲的細(xì)胞中，p38MAPK信號通路均表現(xiàn)出很強(qiáng)的活躍性。例如，p38MAPK在巨噬細(xì)胞中，能參與脂多糖（LPS）的活化活動，或者是大腸桿菌感染上皮細(xì)胞中，p38MAPK在李斯特菌、沙門菌等致病菌中，能借助這些病菌的誘導(dǎo)作用，p38MAPK被活化。而根據(jù)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株ATC25922能誘導(dǎo)U937細(xì)胞逐漸走向凋亡，而此時p38MAPK磷酸化水平也隨著時間的延長，而逐漸增長，該學(xué)者研究表示，p38MAPK在U937細(xì)胞凋亡過程中，發(fā)揮著重要的作用。所以，對于金黃色葡萄球菌中p38MAPK是否也發(fā)揮著同樣的作用，是一個值得深入研究的問題。

而通過本文研究，也再次證實(shí)隨著時間的增加，U937細(xì)胞凋亡百分比顯著提升。分析原因：絲裂原激活的蛋白激酶（MAPKS）又稱為絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，介導(dǎo)信號自細(xì)胞表面向核內(nèi)傳遞，屬于一種信號系統(tǒng)，在細(xì)胞的生長、增殖、分化以及凋亡的過程中起到非常重要的作用，而P38 MAPK屬于MAPKS的組成部分，主要介導(dǎo)炎癥、應(yīng)激、損傷等信號的傳遞，可以被炎細(xì)胞因子、毒素等應(yīng)激因素激活，因此其在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)等方面發(fā)揮的作用較為顯著，同時P38通路異常過度激活可能導(dǎo)致細(xì)胞正常停滯或者凋亡；而激活P38 MAPK的原因可能是因為患者受到應(yīng)激性的刺激，或病理性損傷，引發(fā)介導(dǎo)細(xì)胞死亡，因此一些細(xì)胞可在P38 MAPK的介導(dǎo)下出現(xiàn)分化以及增殖，并且在活化之后生物效應(yīng)多樣化顯著，有些甚至與原本屬性相反，可能存在依賴性，此時，研究P38MAPK信號通路在金黃色葡萄糖球菌中的誘導(dǎo)作用，有著重要的意義。

通過研究發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)U937細(xì)胞死亡時，其細(xì)胞的死亡率，是隨著時間延長而逐漸升高的，可見金黃色葡萄球菌可以將P38 MAPK激活，因此在進(jìn)行該疾病預(yù)防的過程中需要注意對該方面的預(yù)防，為細(xì)菌的控制提供更加理想的條件[7]；對P38 MAPK進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，其可以被吞噬細(xì)胞中的脂多糖成分逐漸活化，最終釋放大量的沙門菌或里斯特菌，附著在大腸上，引起病變，最終通過P38MAPK產(chǎn)生誘導(dǎo)作用，整個過程中完全遏制了TNF-a的活性，最終使得人中性粒細(xì)胞IL-8發(fā)生超氧化離子，發(fā)生MIP誘導(dǎo)化學(xué)趨化性，介導(dǎo)P38 MAPK活化，進(jìn)而啟動信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，促進(jìn)細(xì)胞表達(dá)、合成以及釋放IL-1、ILK-6等多種炎性因子，參與至炎性反應(yīng)的過程中，而U937細(xì)胞在感染金黃色葡萄球菌后P38 MAPK的活性，發(fā)現(xiàn)其在15min后開始升高，證明其具有激活的效果，因此可以降低抑制劑依賴性細(xì)胞的凋亡，為疾病的控制提供條件[8-9]。

綜上分析，P38 MAPK信號通路是金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)U937細(xì)胞凋亡的重要傳導(dǎo)。