王 冰 肖克源 孟 麟 壽成超

(北京大學(xué)臨床腫瘤學(xué)院，北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所，生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究室，惡性腫瘤發(fā)病機制及轉(zhuǎn)化研究教育部重點實驗室，北京 100142)

胰腺癌是一種惡性程度極高的消化道腫瘤，其發(fā)病隱匿，早期無特異性臨床癥狀及體征，且易局部復(fù)發(fā)，肝臟及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高，預(yù)后極差，5年生存率不足6%[1]。美國癌癥協(xié)會最新發(fā)布的2018年癌癥統(tǒng)計報告指出胰腺癌已躍居惡性腫瘤死亡的第四位[2]。吸煙、不正確的飲食習(xí)慣、糖尿病史、膽系疾病史及高水平的 CA19-9、CA242、CEA 均是胰腺癌的獨立危險因素[3]。

THBS2(thrombospondin-2,TSP-2或THBS2)為血小板反應(yīng)蛋白家族的第二個成員，是一種二硫鍵連接的三聚體糖蛋白，其單個亞基包括氨基端的球狀結(jié)構(gòu)域、三聚化的兩個半胱氨酸殘基的連接體結(jié)構(gòu)域、原膠原同源結(jié)構(gòu)域、三個 Ⅰ 型備解素重復(fù)序列、三個 Ⅱ 型表皮生長因子樣重復(fù)序列、七個Ⅲ型鈣離子結(jié)合域和羧基端的球狀結(jié)構(gòu)域[4]。人THBS2基因位于染色體6q27，編碼1 172個氨基酸[5]。人THBS2與同家族的THBS1氨基酸序列具有62%的同源性，人THBS2與小鼠Thbs2氨基酸序列具有89%的同源性。THBS1和THBS2共有的 Ⅰ 型備解素重復(fù)序列在抑制血管生成方面具有重要意義[6,7]。除了調(diào)節(jié)血管生成，THBS2已被報道與多種細胞受體、生長因子和細胞外基質(zhì)蛋白相互作用，并參與細胞外基質(zhì)構(gòu)建以及調(diào)節(jié)細胞增殖、黏附和凋亡[8,9]。

THBS2的重要生物學(xué)功能使其在腫瘤研究中越來越受到關(guān)注。研究表明，THBS2與前列腺癌、乳腺癌、黏液樣脂肪肉瘤、宮頸癌以及胰腺癌的侵襲與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[10-15]，并對結(jié)直腸癌、口腔鱗狀細胞癌、尿路上皮癌、非小細胞肺癌、胃癌等癌癥患者的預(yù)后評估有一定意義[16-20]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，THBS2與常規(guī)腫瘤標志物CA19-9的聯(lián)合檢測可提高胰腺癌的檢出率和特異性，有望成為新的腫瘤標志物[21]。目前雖然已經(jīng)有商品化的THBS2單抗出售，鑒于其價格昂貴且不能滿足自身實驗需求，我們嘗試制備特異性好、親和力高的THBS2單克隆抗體，以期為THBS2在胰腺癌檢測中的應(yīng)用提供工具。

1 材料與方法

1.1材料 胰腺癌細胞株BxPC-3、AsPC-1、PANC-1、SW1990、CFPAC-1、PL45及Sp2/0骨髓瘤細胞由我室保存，BL21大腸桿菌感受態(tài)以及原核表達載體pGEX-4T-1為我室保存，6～8周齡BALB/c小鼠購于北京維通利華實驗動物中心，限制性內(nèi)切酶BamHⅠ 和EcoRⅠ、T4 DNA連接酶均購于NEB公司，THBS1和THBS2全長真核表達蛋白購于Creative Biomart公司，F(xiàn)reund完全佐劑及HAT選擇性培養(yǎng)液購于Sigma公司，化學(xué)發(fā)光試劑盒購于Pierce公司，pCMV-THBS2質(zhì)粒購于Sino Biological 公司，正常人及胰腺癌患者血清來自北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院標本庫。

1.2方法

1.2.1pGEX-4T-1-1#和pGEX-4T-1-2#重組質(zhì)粒的構(gòu)建 因人THBS2與THBS1及鼠Thbs2序列同源性較高，為保證免疫原片段的免疫原性及產(chǎn)生抗體的特異性，我們選取人THBS2與THBS1及鼠Thbs2差異較大的兩條序列作為免疫原片段(1#編碼THBS2第125～146位氨基酸序列；2#編碼THBS2第234～258位氨基酸序列)。1#目的片段(Forw-ard：5′GATCCGATCTCACCTACTGGATTGACGGCAC-CCGGCATGTGGTCTCCCTGGAGGACGTCGGCCTGG-CTGACTGAC3′，Reverse:5′AATTCTCAGTCAGCCAGGCCGACGTCCTCCAGGGAGACCACATGCCGGGTGC-CGTCAATCCAGTAGGTGAGATCG3′)和2#目的片段(Forward：5′GATCCCTGCGCCTGGGTCCGCATGTCACCACCGAGTACGTGGGCCCCAGCTCGGAGAGGA-GGCCCGAGGTGTGCGAACGCTGAC3′，Reverse:5′A-ATTCTCAGCGTTCGCACACCTCGGGCCTCCTCTCCG-AGCTGGGGCCCACGTACTCGGTGGTGACATGCGG-ACCCAGGCGCAGG3′)委托上海生工生物工程股份有限公司進行合成，正義鏈和反義鏈經(jīng)退火生成雙鏈DNA，空載體pGEX-4T-1經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ37℃雙酶切，二者經(jīng)T4 DNA連接酶16℃水浴連接過夜。次日挑取單克隆菌落至LB培養(yǎng)基中，小量提取質(zhì)粒后進行進行測序。

1.2.2GST-1#和GST-2#融合蛋白的誘導(dǎo)表達及純化 將測序正確的pGEX-4T-1-1#和pGEX-4T-1-2#重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21大腸桿菌感受態(tài)，挑取單克隆菌落至含氨芐青霉素(Ampicillin，終濃度100 μg/ml)的LB培養(yǎng)基中，37℃、225 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。次日將培養(yǎng)過夜的菌液按1∶50 比例稀釋至含Amp的LB 培養(yǎng)基中，37℃、225 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600為0.8～1.0，pGEX-4T-1-1#加入終濃度為0.25 mmol/L的IPTG，在18℃、225 r/min繼續(xù)培養(yǎng)12 h；pGEX-4T-1-2#加入終濃度為0.25 mmol/L的IPTG，在37℃、225 r/min繼續(xù)培養(yǎng)4 h。然后6 000 r/min離心10 min后棄去上清，每200 ml菌液加入10 ml細菌裂解液(溶菌酶1 mg/ml、PMSF 1 mmol/L、DTT 1 mmol/L、PBS配制)，充分懸浮細菌沉淀，室溫靜置10 min后加入終濃度為1%Triton X-100，冰浴 20 min后進行超聲裂解，裂解液12 000 r/min，4℃離心15 min，取上清。將獲得的菌液上清與GST珠子4℃結(jié)合過夜，次日PBS洗珠子5遍，加入GST珠子洗脫緩沖液(Tris-HCl pH8.5 50 mmol/L，GSH 25 mmol/L)4℃搖床洗脫2 h后，進行SDS-PAGE鑒定。

1.2.3動物免疫 將純化的GST-1#和GST-2#融合蛋白與等體積的Freund 完全佐劑充分混合，BALB/c小鼠皮下多點注射融合蛋白50 μg/只。初次免疫4周后背部皮下多點注射加強免疫，4周后再次加強免疫，每次所用免疫原50 μg/只。第3 次免疫后7～10 d尾靜脈采血ELISA 測血清抗體效價。于融合前4 d選擇抗體滴度最高的1只小鼠腹腔注射無佐劑抗原150 μg加強免疫。

1.2.4細胞融合與篩選 無菌取加強免疫BALB/c小鼠脾細胞，以50%聚乙二醇作為融合劑，按1∶5～1∶10將Sp2/0骨髓瘤細胞與小鼠脾細胞進行融合，加入HAT選擇性培養(yǎng)液，接種96 孔板，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第7～10天后吸取生長克隆孔中的培養(yǎng)上清，分別用GST-1#和 GST-2#融合蛋白作為包被抗原用ELISA進行初篩，篩選出只與GST-1#或GST-2#反應(yīng)的陽性雜交瘤細胞，對陽性雜交瘤上清再分別與THBS1和THBS2全長真核表達蛋白進行ELISA檢測，選取只與THBS2反應(yīng)的克隆，用有限稀釋法進行3～4輪亞克隆，直至所有單克隆均為陽性時，擴大培養(yǎng)和建株。

1.2.5單克隆抗體的制備與純化 BALB/c小鼠腹腔注射雜交瘤細胞1×106～2×106個/只，約7 d后待小鼠腹部顯著膨隆，吸取腹水，2 000 r/min，離心20 min，取上清。經(jīng)平衡緩沖液稀釋后，0.45 μm濾器過濾。將過濾后腹水以1 ml/min流速通過Purify蛋白純化儀，平衡緩沖液洗去雜蛋白，洗脫液(甘氨酸-鹽酸pH2.8 100 mmol/L)洗脫抗體，收取OD280>0.5的抗體，經(jīng)PBS 4℃透析后進行SDS-PAGE電泳鑒定。

1.2.6單抗親和力和特異性鑒定

1.2.6.1THBS2單抗ELISA檢測 用GST-1#和GST-2#融合蛋白(2 μg/ml)分別包被96孔板，50 μl/孔，4℃過夜。次日PBS洗5次，加入5%脫脂奶粉(PBST配制)室溫封閉2 h，PBS洗5次。將各個THBS2單抗(2 μg/ml)加入酶標板，50 μl/孔，室溫反應(yīng)1 h，PBST洗3次，PBS洗2次。加入HRP標記的羊抗鼠IgG(1∶2 000)，50 μl/孔，室溫反應(yīng)1 h，PBST洗3次，PBS洗2次。加入底物顯色液TMB，100 μl/孔，室溫顯色5～15 min，加入12.5%H2SO4終止，50 μl/孔。酶標儀測OD450值。THBS1和THBS2全長真核表達蛋白檢測步驟與原核融合蛋白一致。

1.2.6.2THBS2單抗Western blot檢測 GST-1#和GST-2#融合蛋白分別加入2×SDS裂解液，每泳道5 ng上樣。SDS-PAGE后，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上;5%脫脂奶粉(TBST配制)室溫封閉2 h后，分別與各THBS2單抗(2 μg/ml)4℃孵育過夜，同時以抗GST單抗作為陽性對照。次日洗滌后，加入HRP 標記的羊抗鼠IgG(1∶2 000)，室溫孵育50 min，ECL化學(xué)發(fā)光顯色。THBS1和THBS2全長真核表達蛋白檢測，每泳道10 ng上樣，除無GST陽性對照外，其余檢測步驟與原核融合蛋白一致。

1.2.6.3Western blot檢測胰腺癌細胞中THBS2表達水平 RIPA細胞裂解液裂解細胞后，每泳道20 μg 細胞總蛋白上樣。SDS-PAGE后，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶粉(TBST配制)室溫封閉2 h后，用制備獲得的單抗7F5(2 μg/ml)孵育過夜，內(nèi)參采用小鼠抗GAPDH 抗體(1∶1 000)孵育過夜。次日TBST洗膜后，加入HRP 標記的羊抗鼠IgG(1∶2 000)，室溫孵育50 min，ECL化學(xué)發(fā)光顯色。

1.2.6.4免疫沉淀檢測不同單抗與THBS2的結(jié)合活性 轉(zhuǎn)染pCMV-THBS2質(zhì)粒至SW1990胰腺癌細胞中，48 h后RIPA裂解液裂解細胞收取蛋白。各取1 μg THBS2單抗與20 μl Protein G 珠子加入到1 ml PBST中，同時以1 μg小鼠IgG作為陰性對照，室溫搖1 h，PBST洗珠子3次，之后分別加入100 μl細胞裂解液和900 μl PBST 4℃反應(yīng)過夜。次日PBST洗珠子3 次，加入15 μl 2×SDS裂解液，煮沸5 min，用THBS2單抗7F5進行Western blot檢測，具體方法見1.2.6.3。

1.2.7免疫沉淀檢測胰腺癌患者及正常人血清THBS2 各取2 μg 9F7單抗與20 μl Protein G 珠子加入到1 ml PBST中，同時以2 μg小鼠IgG作為陰性對照，室溫搖1 h，PBST洗珠子3次，之后分別加入20 μl 血清和1 ml PBST 4℃反應(yīng)過夜。次日PBST洗珠子3 次，加入15 μl 2×SDS裂解液，煮沸5 min，用THBS2單抗7F5進行Western blot檢測，具體方法見1.2.6.3。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad Prism 5軟件作圖，Student′st檢驗分析胰腺癌患者和正常人血清中THBS2的表達差異，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1不同THBS2截斷體片段融合蛋白的重組、表達和純化 將構(gòu)建的重組質(zhì)粒進行測序，在證實其序列正確的基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌并經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達，超聲裂解后行SDS-PAGE和考馬斯亮藍染色檢測。結(jié)果可見重組質(zhì)粒經(jīng)誘導(dǎo)表達后出現(xiàn)明顯的蛋白條帶，且以可溶性形式存在于上清中。融合蛋白經(jīng)純化后，純度達90%以上(圖1)。

2.2THBS2單抗的純化 用GST融合蛋白免疫小鼠后，經(jīng)細胞融合和克隆篩選，最終獲得了4株抗1#的雜交瘤細胞株、6株抗2#的雜交瘤細胞株，收集小鼠腹水后進行抗體純化，并用12%SDS-PAGE電泳對其純度進行鑒定。考馬斯亮藍染色后僅看到抗體的重輕鏈，而無其他雜蛋白，說明抗體純度良好(圖2)。

圖1 GST融合蛋白的重組、表達和純化Fig.1 Recombination,expression and purification of GST fusion proteinsNote:A，B.Expression and purification of GST-1# and GST-2#; M.Marker; 1.Total bacterial protein before induction; 2.Total bacterial protein after induction; 3.Bacterial supernatant after induction;4.Purified GST fusion protein.

2.3單克隆抗體與THBS2片段的反應(yīng)特異性檢測 為檢測所獲單抗與THBS2片段的特異反應(yīng)，我們分別用GST-1#和GST-2#融合蛋白包被96孔板，然后用抗1#片段及抗2#片段的不同單克隆抗體作為一抗，羊抗鼠酶標抗體作為二抗進行常規(guī)ELISA 檢測，從圖3B和圖3C可知，抗1#片段抗體4E11、5A2、9B6、10E5和抗2#片段抗體6H8、7B12、7E2、7F5、 9F7、11A10只特異性地與相應(yīng)THBS2片段反應(yīng)，與GST 蛋白均不反應(yīng)。在Western blot實驗中，他們也均可與相應(yīng)THBS2片段特異結(jié)合，與GST 不結(jié)合(圖3E和圖3F)。

圖2 THBS2單克隆抗體的純化Fig.2 Purification of THBS2 monoclonal antibodies

圖3 單克隆抗體與THBS2片段的反應(yīng)特異性檢測Fig.3 Detection of monoclonal antibodies reacted with THBS2 fragmentsNote:A，D.GST positive control;B，C.ELISA detects the specificity of the antibody response;E，F(xiàn).Western blot detects the specificity of the antibody response.

2.4單克隆抗體與THBS2全長真核表達蛋白的反應(yīng)特異性檢測 在證明所獲單抗可與THBS2片段特異結(jié)合后，我們分別用THBS1和THBS2全長真核表達蛋白包被96孔板，用常規(guī)ELISA檢測抗體的反應(yīng)特異性，結(jié)果表明，抗1#片段的4株抗體和抗2#片段的6株抗體均可與THBS2反應(yīng)，而不與THBS1反應(yīng)(圖4A)。同樣地，用單抗作為一抗進行Western blot實驗，可見所有單抗均不與THBS1反應(yīng)，除抗1#片段的抗體4E11和5A2，其余單抗均可檢測到THBS2全長真核表達蛋白(圖4C)。上述結(jié)果說明獲得的單抗具有較好的THBS2結(jié)合特異性。同時，我們還使用7F5作為一抗，通過Western blot檢測了6株胰腺癌細胞的THBS2表達水平，結(jié)果顯示，AsPC-1和CFPAC-1細胞均有不同程度的THBS2表達(圖4B)。

2.5免疫沉淀檢測不同單抗與THBS2的結(jié)合能力 在SW1990細胞中過表達THBS2， 使用免疫沉淀法檢測不同單抗與THBS2在天然活性狀態(tài)下的結(jié)合情況。結(jié)果可見，抗2#片段的6株抗體和抗1#片段的10E5在免疫沉淀中與THBS2的結(jié)合能力較強，而抗1#片段的其余3株抗體(4E11、5A2和9B6)的結(jié)合能力較弱(圖5)。

圖4 單克隆抗體與THBS2全長真核表達蛋白的反應(yīng)特異性檢測Fig.4 Detection of monoclonal antibodies reacted specialy with THBS2 protein

圖5 免疫沉淀檢測不同單抗與THBS2的結(jié)合能力Fig.5 Detection of different monoclonal antibodies reacted with THBS2 in immunoprecipitation assay

圖6 免疫沉淀檢測胰腺癌患者及正常人血清THBS2Fig.6 Immunoprecipitation for detection of serum THBS2 in patients with pancreatic cancer and normal controlsNote:P.Patients with pancreatic cancer;N.Normal controls.***.P

2.6免疫沉淀檢測胰腺癌患者及正常人血清THBS2 選取免疫沉淀中結(jié)合能力較強的單抗9F7，對36例胰腺癌患者及20例正常人血清中的THBS2進行免疫沉淀，隨后采用單抗7F5進行檢測(圖6A)；統(tǒng)一對各條帶進行灰度掃描并進行統(tǒng)計學(xué)分析(圖6B)，結(jié)果表明THBS2在胰腺癌患者血清中的水平顯著高于正常人(P<0.000 1)。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)THBS2與其他腫瘤標志物聯(lián)合檢測可輔助腫瘤早期診斷。Kim等[21]最近的一項研究表明，THBS2區(qū)分PDAC(胰腺導(dǎo)管腺癌)和健康對照的AUC為0.875。當以THBS2≥42 ng/ml為臨界值時，其檢測的靈敏度為52%，特異性為99%，當與CA19-9聯(lián)合檢測時，靈敏度可達87%，特異性達98%，提示THBS2對胰腺癌的輔助診斷具有較大的潛在臨床應(yīng)用價值。另外，Zhang等[22]的研究發(fā)現(xiàn)，肝癌患者血清THBS2和SPARC(骨連接蛋白)水平均顯著高于健康人群，血清SPARC和THBS2的聯(lián)合檢測可以區(qū)分肝癌與健康對照及良性肝病患者。Fei等[23]對結(jié)直腸癌患者及正常對照血清樣本中的THBS2和RBP4(retinol binding protein,視黃醇結(jié)合蛋白)水平進行檢測，發(fā)現(xiàn)其聯(lián)合檢測可將結(jié)直腸癌患者與正常對照區(qū)別開來，并且與CEA或CA19-9有較好的互補作用，有助于結(jié)直腸癌的輔助診斷?？梢奣HBS2有望成為新的腫瘤標志物，對腫瘤的早期診斷具有潛在臨床價值。

為了研發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的THBS2檢測技術(shù)體系，我們選取人THBS2與THBS1及鼠Thbs2氨基酸序列均有較大差異區(qū)段，通過基因重組及GST融合蛋白表達純化、小鼠免疫、細胞融合、克隆篩選和特異性鑒定等一系列實驗，最終獲得了10株能與THBS2反應(yīng)、而與THBS1不反應(yīng)的特異性單克隆抗體。除單抗4E11和5A2 在Western blot中未能檢測到與全長真核表達蛋白THBS2的明顯反應(yīng)條帶外，其他單克隆抗體在ELISA、免疫沉淀和Western blot 中均可用于對THBS2的特異檢測，單抗9F7可通過免疫沉淀檢測胰腺癌患者血清中的THBS2，且檢測結(jié)果表明THBS2在胰腺癌患者血清中的水平高于正常人(P<0.000 1)。

綜上，本研究獲得了多株THBS2特異性單克隆抗體，他們可用于對THBS2的不同免疫學(xué)實驗檢測。在后續(xù)研究中，我們將評估所獲抗體對外周血中THBS2檢測的敏感性及特異性，并進行系統(tǒng)的雙抗夾心配對實驗，為THBS2檢測試劑盒的研發(fā)奠定堅實基礎(chǔ)。